黑色小扁豆中不同結(jié)合態(tài)酚類含量、花青素組成及其抗氧化活性研究

李文婷 鄒安迪 李紅艷 鄧澤元 張 兵

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室 南昌330047）

小扁豆（Lentil,Lens culinaris）是一種重要的豆科類作物，在所有可食用豆科類作物中，小扁豆特別是黑色小扁豆的高營養(yǎng)價值越來越受到人們的關(guān)注[1]。小扁豆含有大量的營養(yǎng)素、微量營養(yǎng)素以及植物化學(xué)成分。現(xiàn)有研究[2]表明，小扁豆中富含益生元，可以有效降低肥胖的發(fā)生。小扁豆中含有的多酚類植物化學(xué)物具有顯著的抗氧化、抗炎活性。

豆類植物具有較高的抗氧化性與其含量豐富的多酚、黃酮及花色苷等物質(zhì)密切相關(guān)[3-5]。有研究表明[1，6-9]，存在于植物中的天然抗氧化劑如多酚、生育酚、類胡蘿卜素等植物化學(xué)物，可以起到保持人體健康，預(yù)防慢性疾病的作用。植物體中的天然多酚類物質(zhì)主要包括酚酸、黃酮和單寧類物質(zhì)[10]。花青素是一種水溶性色素，屬類黃酮化合物，廣泛存在于有色植物果實、花朵及子葉中，具有很強的抗氧化能力[11-12]，可以預(yù)防心血管疾病，預(yù)防DNA損傷，抗炎作用，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[13-14]。

存在于植物中的酚類物質(zhì)主要包括兩部分：有機溶劑可提取的可溶性酚類和有機溶劑不可提取的結(jié)合態(tài)酚類?？扇苄苑宇愇镔|(zhì)除以游離形態(tài)存在外，還可通過酯鍵、醚鍵、糖苷鍵的形式與其它物質(zhì)結(jié)合[15]。通過堿水解處理可破壞酯鍵和醚鍵，酸水解處理破壞糖苷鍵。將有機溶劑提取后的上清液用堿、酸水解處理并萃取，可從有機溶劑提取液中分別提取出游離態(tài)酚類、酯鍵合態(tài)酚類、糖苷鍵合態(tài)酚類；對于殘渣中存在的有機溶劑不可提取的結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)主要以酯鍵、醚鍵、糖苷鍵與細胞壁中的纖維素、半纖維素、蛋白質(zhì)、果膠等物質(zhì)結(jié)合[16-17]，可通過酸水解、堿水解或酶水解破壞物質(zhì)間的化學(xué)鍵[18-19]，以提取酚類物質(zhì)。文獻[10]、[20]、[21]研究了紅棗中酚類物質(zhì)，分別提取出游離態(tài)、酯鍵合態(tài)、糖苷鍵合態(tài)和堿解結(jié)合態(tài)酚類。彭瀚等[22]對黑豆經(jīng)甲醇溶液提取處理，上清液為可溶性酚類，殘渣進行酸水解、堿水解處理，可得到甲醇不可提取的結(jié)合態(tài)酚類。目前，對小扁豆中花青素成分的研究文獻較少。Takeoka等[23]利用HPLC和NMR鑒定出黑色小扁豆中的花青素成分為飛燕草-3-O-（2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-α-L-吡喃阿拉伯糖苷）。

有關(guān)小扁豆不同存在形式的酚類物質(zhì)（游離態(tài)、酯鍵合態(tài)、糖苷鍵合態(tài)、結(jié)合態(tài)）的含量及其抗氧化活性鮮見研究報道。基于前人對酚類物質(zhì)及小扁豆植物化學(xué)物的相關(guān)研究，本研究目的是評價小扁豆中游離態(tài)、酯鍵合態(tài)、糖苷鍵合態(tài)和結(jié)合態(tài)酚類的含量，進行體外抗氧化活性研究，并鑒定其花青素成分。

1 材料與方法

1.1 原料

黑色小扁豆，2015年3月購于加拿大圭爾夫當?shù)爻?/p>

1.2 試劑、儀器與設(shè)備

沒食子酸、兒茶素、奎諾二甲基丙烯酸酯（Trolox）、2，4，6-三吡啶基三嗪（TPTZ）、2，2-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（ABTS），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），西亞試劑；福林酚試劑，上海荔達生物科技有限公司；無水甲醇、FeCl3·6H2O、乙酸乙酯、鹽酸、硫酸、冰醋酸、K2S2O8、三水醋酸鈉、NaOH，西隴科學(xué)股份有限公司；乙醚，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；AlCl3，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；Na2CO3、NaNO2、FeSO4，西隴化工股份有限公司。

AL104電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；BioTek酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；HY-2調(diào)速多用振蕩器，上海比朗儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州市華普達教學(xué)儀器有限公司；N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司；KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；TDL-5-A離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 酚類物質(zhì)提取及測定

準確稱取1.00 g研磨好的黑色小扁豆粉末于50mL離心管中，按1∶15的料液比加入15mL 80%甲醇-水（V/V）溶液，室溫下超聲提取1 h，4 200 g離心10min，收集上清液，重復(fù)提取4次，合并甲醇提取液，用于游離態(tài)、酯鍵合態(tài)和糖苷鍵合態(tài)酚類分析，殘渣用于結(jié)合態(tài)酚類分析。將樣品放在-20℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1 小扁豆甲醇提取液的制備[10，20-21]

1）游離態(tài)酚類的制備 將小扁豆甲醇提取液于35℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至20mL，用6mol/L HCl調(diào)pH值至2，該部分酚類物質(zhì)通過加入等體積有機溶劑（體積比1∶1的乙醚-乙酸乙酯混合溶液）進行萃取，震蕩萃取30min，靜置分層后分液，重復(fù)萃取5次。將萃取分離的有機相合并，在35℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，復(fù)溶于5mL 80%甲醇中，即游離態(tài)酚類提取物，將樣品放在-20℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

2）酯鍵合態(tài)酚類的制備 向上述提取過游離態(tài)酚類的水相中加入10mL 4mol/L NaOH溶液，同時充入氮氣，室溫下?lián)u床震蕩反應(yīng)4 h，用6 mol/L HCl調(diào)pH值至2，該部分酚類物質(zhì)萃取過程同上。

3）糖苷鍵合態(tài)酚類的制備 向上述提取完酯鍵合態(tài)酚類的水相中加入4mL HCl，85℃水解反應(yīng)30min，該部分酚類物質(zhì)萃取過程同上。

1.3.2 小扁豆結(jié)合態(tài)酚類的制備[10，22]

1）堿解結(jié)合態(tài)的制備 將甲醇提取后的殘渣加入20mL 2mol/L NaOH溶液中，同時充入氮氣，室溫下?lián)u床震蕩4 h，用6mol/L HCl調(diào)整pH值至2，4200 g離心10min，收集上清液，該部分酚類物質(zhì)萃取過程同上。

2）酸解結(jié)合態(tài)的制備 將甲醇提取后的殘渣加入25mL 2mol/L HCL溶液中，同時充入氮氣，在85℃水浴中保持1 h后，用10mol/L NaOH將溶液pH值調(diào)至2，4200 g離心10min后收集上清液，該部分酚類物質(zhì)萃取過程同上。

1.3.3 小扁豆中總酚含量的測定[24-25]總酚含量的測定采用Folin-Ciocalten法，以沒食子酸（gallic acid）為標準品，選用96孔板測定。將25μL樣品或標準品溶液和125μL福林酚試劑（0.2mol/L）于室溫下反應(yīng)10min，加125μL飽和Na2CO3溶液（10 g/100mL），在振蕩器上緩慢搖勻后室溫下反應(yīng)30min，在波長765 nm處測定吸光度。由沒食子酸系列標準溶液制作標準曲線，計算樣品總酚含量，結(jié)果表示為mg GAE/g DW（GAE即Gallic acid equivalent）。

1.3.4 小扁豆中黃酮含量的測定[24-25]總黃酮的測定采用亞硝酸鈉-三氯化鋁法，以兒茶素（catechin）為標準品，選用96孔板測定。25μL樣品或標準品溶液與110μL NaNO2（0.066mol/L）室溫混合，反應(yīng)5min后加入15μL AlCl3（0.75mol/L）溶液反應(yīng)6min，最后加入100μL NaOH（0.5mol/L）溶液，在振蕩器上緩慢搖勻，室溫反應(yīng)10min，在510 nm處測定吸光度。由兒茶素系列標準濃度制作標準曲線，計算樣品總黃酮含量，結(jié)果表示為mg CAE/g DW（CAE即Catechin equivalent）。

1.3.5 亞鐵離子還原能力（FRAP）測定[24-25]

試驗試劑的配制：

1）40mmol/L鹽酸溶液 取濃鹽酸（12mol/L）0.1mL加水至30mL。

2）20mmol/L三氯化鐵溶液 稱取0.2703 g的FeCl3·6H2O，用超純水定容50 mL。

3）0.3mol/L醋酸鈉緩沖溶液 稱取三水醋酸鈉0.31 g，加冰醋酸1.6mL，然后用超純水水稀釋定容100mL。

4）10mmol/L TPTZ溶液 稱取TPTZ樣品31.233mg，用40mmol/L鹽酸定容10mL，置于4℃冰箱中保存。

5）FRAP工作液 醋酸鈉緩沖溶液、三氯化鐵溶液和TPTZ溶液按體積比10∶1∶1混合，制得質(zhì)量濃度為0.04mg/mL的工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

試驗方法：加10μL樣品或FeSO4標品溶液及180μL預(yù)熱至37℃的FRAP工作液至96孔板，在振蕩器上避光搖勻，37℃反應(yīng)10min，于波長593 nm處測定其吸光度值。以FeSO4系列標準溶液制作標準曲線。樣品抗氧化活性以達到同樣吸光度所需FeSO4的物質(zhì)的量（mmol Fe/g DW）表示。

1.3.6 DPPH自由基清除能力測定[24-25]加100 μL DPPH甲醇溶液（0.065mmol/L）與100μL樣品或空白溶液于96孔板中，避光條件下在振蕩器上緩慢搖勻，室溫反應(yīng)30min，使用酶標儀在517 nm處測定其吸光值。以Trolox為標準測定，樣品DPPH清除能力以達到同樣消除率所需Trolox的質(zhì)量（mg TE/g DW）表示（TE：Trolox equivalent）。清除率計算公式：

式中：Ai——樣品溶液加DPPH試劑混合液的吸光度；Aj——樣品溶液加甲醇的吸光度；Ac——DPPH溶液加樣品溶劑的吸光度。

1.3.7 ABTS自由基清除能力測定[24，26]試驗試劑的配制：將5mL 7.0mmol/L ABTS儲備液與88 μL 140mmol/L K2S2O8混勻，靜置12～16 h，配制ABTS工作液。ABTS工作液用80%的甲醇稀釋，使混合溶液在734 nm處吸光值為0.7±0.02。

將200μL ABTS溶液和20μL樣品或標品溶液分別加入96孔板中，避光條件下在振蕩器上緩慢搖勻，室溫反應(yīng)6min，在波長734 nm處測定吸光值。以Trolox為標準測定，樣品ABTS清除能力以達到同樣消除率所需Trolox的質(zhì)量（mg TE/g DW）表示（TE，Trolox equivalent）。清除率計算公式：

式中：A0——ABTS溶液和樣品溶劑混合液的吸光度；Ai——ABTS溶液和樣品溶液混合液的吸光度；Aj——80%甲醇和樣品溶液的吸光度。

1.4 黑色小扁豆中花青素的提取及組成鑒定

1.4.1 黑色小扁豆花青素提取物的制備 準確稱取1.00 g研磨好的小扁豆粉末于50mL塑料離心管中，按料液比1∶15加入15mL提取液，提取液為含1%HCL的80%甲醇-水（V/V）溶液，室溫下避光超聲提取1 h，4 200 g離心10min，收集上清液，重復(fù)提取4次，合并甲醇提取液，在35℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。將殘留物溶解于10mL蒸餾水中，樣品過0.22μm的MCE濾膜，用于鑒定花青素成分。

酸解花青素提取物：避光條件下在上述提取液中加入鹽酸溶液，使鹽酸終濃度為2mol/L，同時充入氮氣，室溫下?lián)u床震蕩提取1 h，加入等體積有機溶劑（體積比為1∶1的乙醚-乙酸乙酯混合溶液），重復(fù)提取5次。將提取分離的有機相合并，在35℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，將殘留物溶解于10 mL蒸餾水中，待測，樣品過0.22μm的MCE濾膜，用于鑒定花青素成分。

1.4.2 HPLC-ESI-QQQ-MS鑒定花青素 液相條件：色譜分離采用HPLC系統(tǒng)（Agilent 1290 infinity series），包含脫氣機、二元泵（Bin Pump SL）、進樣器（HiP-ALS）、柱溫箱（TCC SL）、DAD檢測器（Agilent Technologies,Santa Clara,USA）。使用Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250mm，5μm）。流動相含0.1%的甲酸水溶液（A）和含0.1%的甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脫程序為：0～5 min,8%～12%B；5～10 min,12%～18%B；10～13min,18%B；13～20min,18%～25%B；20～32 min,25%～38%B；32～36 min,38%B；36～38min,38%～8%B。進樣量5μL，柱溫30℃，流速0.8mL/min，DAD 520 nm。

質(zhì)譜條件：質(zhì)譜檢測采用三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀（Agilent 6430 QQQ），裝備電噴霧離子源（ESI），采用正離子模式用于精密質(zhì)量測定。全質(zhì)譜數(shù)據(jù)在m/z 50～1 000質(zhì)量范圍獲得。最佳質(zhì)譜參數(shù)如下：毛細管電壓3.5 kV，進樣錐電壓35 V，去溶劑化氣流（N2）速度為900 L/h，進樣錐氣流（N2）速度為50 L/h，去溶劑溫度325℃，離子源溫度150℃，裂解電壓120 V。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差（mean±SD，n=3）。對數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計軟件分析，方差分析（ANOVA）用于顯著性分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 黑色小扁豆可溶性和結(jié)合態(tài)提取物酚類、黃酮含量Table1 Phenolic and flavonoid content of soluble and bound phenolic extracts of black lentil

2 結(jié)果與分析

2.1 總酚和總黃酮含量

黑色小扁豆的酚酸及黃酮含量見表1。不同存在形式酚類提取物中酚酸、黃酮含量有顯著性差異（P＜0.05），其中酯鍵合態(tài)酚類物質(zhì)酚酸含量最高，達1.61mg/g，堿解結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)黃酮含量最高，可達1.07mg/g，而糖苷鍵合態(tài)酚類物質(zhì)酚酸、黃酮含量最低，分別為0.16mg/g和0.14mg/g。對于殘渣中黃酮含量的測定結(jié)果是：堿解處理明顯高于酸解處理，可能是因為黑色小扁豆中黃酮主要以酯鍵、醚鍵與纖維素、半纖維素、淀粉、果膠等物質(zhì)結(jié)合，經(jīng)堿解處理破壞化學(xué)鍵，將黃酮釋放出來。Fratianni等[27]研究表明，小扁豆總酚含量為1.09～1.59mg/g，低于本試驗研究結(jié)果；而張兵等[25]對20種加拿大紅色和綠色小扁豆的研究表明，總酚、總黃酮含量分別為4.56～8.34mg/g和0.6～1.98 mg/g；Xu等[28]用不同溶劑提取小扁豆中的酚類物質(zhì)，其總酚、黃酮含量分別為1.02～7.53 mg/g和0.72～2.21mg/g；Yeo等[17]對4種脫脂后的小扁豆進行研究，其可溶性、堿解結(jié)合態(tài)提取物酚類含量分別為3.22～4.03mg/g和3.00～3.64mg/g，黃酮含量分別為2.30～3.11mg/g和1.55～2.28mg/g。在比較小扁豆中酚類含量時，本試驗結(jié)果低于其它報道，這可能是由于所用原料區(qū)域、品種及總酚提取方法的差異所致。

2.2 總還原能力FRAP

黑色小扁豆中游離態(tài)、酯鍵合態(tài)、糖苷鍵合態(tài)和結(jié)合態(tài)酚類提取物的總還原能力見表2。不同存在形式酚類提取物的FRAP值之間有顯著性差異，主要分布在6.25～43.80mmol/g之間，其中堿解結(jié)合態(tài)的總還原能力最強，其次是糖苷鍵合態(tài)。趙艷等[29]研究豇豆屬、小扁豆屬、鷹嘴豆屬、菜豆屬、蠶豆屬等豆類的抗氧化活性，結(jié)果表明：定西小扁豆、榆林扁豆的FRAP值分別是1.48mmol/g和1.03mmol/g，總還原能力低于本研究結(jié)果。

2.3 DPPH自由基清除能力

黑色小扁豆中游離態(tài)、酯鍵合態(tài)、糖苷鍵合態(tài)和結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)DPPH自由基清除能力見表2。不同存在形式酚類提取物的DPPH清除能力之間有顯著性差異，清除能力主要分布在0.15～2.13 mg/g之間，其中堿解結(jié)合態(tài)的清除能力最強，其次是游離態(tài)，堿解結(jié)合態(tài)清除能力最弱。Xu等[28]用不同溶劑提取小扁豆中的酚類物質(zhì)，DPPH為0.91～19.61μmol/g。Yeo等[17]對4種脫脂的小扁豆進行研究，其可溶性、堿解結(jié)合態(tài)酚類提取物的DPPH自由基清除能力分別為5.22～6.67mg/g和4.73～5.51mg/g，此結(jié)果高于本研究結(jié)果，可能是因原料品種及提取物中所含酚類物質(zhì)種類及含量不同所致。

2.4 ABTS自由基清除能力

黑色小扁豆中游離態(tài)、酯鍵合態(tài)、糖苷鍵合態(tài)和結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)的ABTS自由基清除能力見表2。不同存在形式酚類提取物的ABTS清除能力之間有顯著性差異，清除能力主要分布在0.74～3.92 mg/g之間，其中堿解結(jié)合態(tài)的清除能力最強，其次是酸解結(jié)合態(tài)，游離態(tài)提取物清除能力最弱。

表2 黑色小扁豆可溶性和結(jié)合態(tài)提取物的抗氧化能力Table2 Antioxidant activity of soluble and bound phenolic extracts of black lentil

2.5 黑色小扁豆花青素成分鑒定結(jié)果

圖1a為黑色小扁豆甲醇提取物在520 nm處的液相圖譜，Rt在9.892min有特征吸收峰；圖1b為該保留時間處的高效液相三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜（HPLC-QQQ-MS）圖。由母離子m/z 597.2和碎片離子m/z 303.3、435.2可推斷：單體為飛燕草素，母離子和碎片離子的相對分子質(zhì)量差分別為294和162，分子中含一個單糖糖苷和一個阿拉伯糖糖苷。結(jié)合文獻[23]推測m/z 597.2的花青素結(jié)構(gòu)為飛燕草素-3-O-（2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-α-L-吡喃阿拉伯糖苷）。

圖1 黑色小扁豆甲醇提取液中花青素在520 nm的液相色譜圖（a）和峰1的質(zhì)譜圖（b）Fig.1 HPLC profile of methanolic extracts of black lentil at 520 nm（a）and MS/MS spectrum（b）of peak

圖2a為黑色小扁豆甲醇提取物經(jīng)酸水解后在520 nm處的液相圖譜，可看出，酸解提取的花青素中有2個明顯的峰：圖2b、2c分別為Rt在13.482min（A1）和16.007min（A2）保留時間處的高效液相三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜（HPLC-QQQMS）圖。由母離子m/z 303.1并結(jié)合520 nm處的特征吸收峰可推斷出含有飛燕草素單體，由母離子m/z 287.1結(jié)合520 nm處的特征吸收峰可推斷出含有矢車菊素單體。

由圖2可知，小扁豆甲醇提取物經(jīng)鹽酸水解處理后可鑒定出2種花青素單體，分別為飛燕草素單體和矢車菊素單體。其中，飛燕草素成分在甲醇提取物520 nm處的液相圖中（圖1a）有明顯的吸收峰。結(jié)合質(zhì)譜圖及文獻[23]可推斷為飛燕草素-3-O-（2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-α-L-吡喃阿拉伯糖苷）；矢車菊素成分在甲醇提取物520 nm處的液相圖中沒有吸收峰，可能是因為矢車菊素單體與其它物質(zhì)以糖苷鍵的形式結(jié)合在一起，經(jīng)酸處理后可以破壞糖苷鍵，將矢車菊素單體釋放，從而在520 nm處有明顯的吸收峰，該物質(zhì)為矢車菊素衍生物。

圖2 黑色小扁豆甲醇提取液酸解后在520 nm的液相色譜圖（a），以及峰A1（b）和峰A2（c）的質(zhì)譜圖Fig.2 HPLC profile of acid hydrolyzed extracts of black lentil at 520 nm（a）and MS/MS spectrum of peak A1（b）and peak A2（c）

3 結(jié)論

分別對80%甲醇溶液提取的上清液和殘渣中不同存在形式的酚類進行分離提取，結(jié)果表明，小扁豆中不同存在形式的酚類提取物含量及其抗氧化能力有一定差異，其中酯鍵合態(tài)酚類提取物的總酚含量較高，為1.61mg/g，堿解結(jié)合態(tài)酚類提取物具有較高的黃酮含量、亞鐵離子還原能力、DPPH清除能力、ABTS清除能力，其值分別為1.07mg/g、43.80mmol/g、2.13mg/g、3.92mg/g。采用HPLC-QQQ-MS鑒定黑色小扁豆中的花青素成分，結(jié)果表明黑色小扁豆中花青素主要為飛燕草-3-O-（2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-α-L-吡喃阿拉伯糖苷）及矢車菊素衍生物，這為黑色小扁豆的進一步開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。