基于體外模擬腸道微生態(tài)體系比較不同果蔬全粉的益生元功效

石夢(mèng)玄 張 璐，2 田美玲 陳 芳*

（1 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院 國(guó)家果蔬加工工程技術(shù)研究中心 農(nóng)業(yè)部果蔬加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室教育部果蔬加工工程技術(shù)研究中心 北京100083

2 北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 北京100193）

腸道是體內(nèi)消化代謝的重要器官之一，腸腔內(nèi)環(huán)境極其復(fù)雜，棲息了1013～1014個(gè)腸道微生物[1]。大量研究表明，這些微生物能夠維持腸道內(nèi)環(huán)境平衡。腸道菌群中的益生菌，能夠在腸道中與致病菌競(jìng)爭(zhēng)抑制其生長(zhǎng)[2]，增強(qiáng)腸道屏障功能[3]。菌群代謝碳水化合物產(chǎn)生的短鏈脂肪酸（Shortchain fatty acids，SCFAs）[4]，能夠調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞的生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激，影響?zhàn)ひ簩拥慕M成[5]。腸道中有益菌數(shù)量和SCFAs產(chǎn)量的增加對(duì)維持腸道功能，保護(hù)腸道健康具有重要作用。

果蔬包含的功能成分如膳食纖維和多酚，能夠與腸道菌群相互作用，改善腸道微生態(tài)環(huán)境[6-7]。膳食纖維不易被人體直接吸收，但可被腸道菌群代謝產(chǎn)生SCFAs，反之，SCFAs為腸道上皮細(xì)胞提供能量來(lái)源，調(diào)節(jié)腸道環(huán)境pH值[8]。多酚能夠抑制腸道致病菌如類桿菌、腸球菌和葡萄球菌等的生長(zhǎng)，促進(jìn)雙歧桿菌、乳酸桿菌等有益菌數(shù)量的增加，維持菌群結(jié)構(gòu)平衡[9]。不同果蔬成分組成的差別會(huì)對(duì)腸道菌群及其代謝產(chǎn)物產(chǎn)生不同的影響，因此選擇方便快捷、靈敏準(zhǔn)確的研究方法初步評(píng)價(jià)不同果蔬的益生元功效有重要意義。

目前，人體腸道模擬系統(tǒng)（Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem，SHIME）[10]、三聯(lián)體外發(fā)酵模擬系統(tǒng)[11]等體外模擬消化體系具有精確度高、重現(xiàn)性好、操作便捷的優(yōu)點(diǎn)，逐漸在食品消化代謝研究中得到廣泛運(yùn)用。本研究通過(guò)建立體外模擬腸道微生態(tài)體系，研究了絲瓜、香菇、桑葚和枸杞4種果蔬凍干全粉對(duì)5種腸道有益菌數(shù)量和SCFAs產(chǎn)量的影響，為初步評(píng)價(jià)果蔬的益生元功效提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“寧杞五號(hào)”枸杞、“808”香菇和“黑珍珠”桑葚全果凍干粉由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所提供。市售“棒絲瓜”鮮果切片、凍干、研磨后得絲瓜凍干粉。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（98%）、果糖標(biāo)準(zhǔn)品（99%）、蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品（99%）、乙酸標(biāo)準(zhǔn)品（99.8%）、丙酸標(biāo)準(zhǔn)品（99.8%）、丁酸標(biāo)準(zhǔn)品（99.5%）、異戊酸標(biāo)準(zhǔn)品（98.5%），熱穩(wěn)定α-淀粉酶（TDF-100A）、淀粉葡萄糖苷酶（TDF-100A）、蛋白酶（TDF-100A）、豬胃粘膜胃蛋白酶（250 units/mg）、豬胰腺胰蛋白酶（～1 500U/mg）、豬胰腺胰酶（8×USP）、豬胃黏蛋白（Type II），美國(guó)Sigma公司；色譜級(jí)甲醇、乙腈，美國(guó)Honeywell公司；蛋白胨、酵母提取物、三號(hào)膽鹽，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；L-Cysteine（97%），美國(guó)Sigma-Aldrich公司；糞便基因組DNA提取試劑盒DP328，北京天根生化科技有限公司；SYBR Premix Ex Taq，日本TaKaRa公司；Folin-Phenol試劑，北京索萊寶科技有限公司；分析純無(wú)水乙醇、葡萄糖、NaOH、K2HPO4、KH2PO4，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（滬試）；腸道菌群特異性引物，北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 設(shè)備與儀器

IS-RSD3臺(tái)式恒溫振蕩器，美國(guó)精騏有限公司；LAI-3DT型厭氧培養(yǎng)箱，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；SpectraMax iD5多功能微孔讀板機(jī)，美國(guó)Molecular Devices公司；LightCycler480Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR儀，德國(guó)Roche公司；Waters e2695高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；Waters RIDetector檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司；Luna NH2色譜柱（250mm×4.6mm，5cm），美國(guó)Phenomenex公司；Agilent Technologies 7890B-5977A氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent Technologies公司；HP-FFAP色譜柱（19091F-413），美國(guó)Agilent Technologies公司

1.3 方法

1.3.1 體外模擬腸道微生態(tài)體系的建立 模擬胃液和小腸液分別參照Tedeschi等[12]的方法配制，并進(jìn)行部分調(diào)整。模擬胃液：3.10 g NaCl，1.10 g KCl，0.15 g CaCl2，0.60 g NaHCO3，用去離子水定容1 000mL。在150mL胃電解液中添加35.40 mg胃蛋白酶，加入1.5 mL CH3COONa緩沖液（1.0 mol/L，pH 5.0）。室溫下磁力攪拌10min，調(diào)至pH 2.0（0.5 mol/L HCl）。模擬小腸液：5.40 g NaCl，0.65 g KCl，0.25 g CaCl2，去離子水定容1 000 mL。將25mL小腸電解液、50mL 4%膽汁鹽溶液和25mL 7%胰酶上清液混合，添加13mg胰蛋白酶，調(diào)至pH7.0（0.5mol/L NaOH）。

發(fā)酵培養(yǎng)基參照Chen等[13]的方法配制，并進(jìn)行部分調(diào)整。0.10 g NaCl，0.04 g K2HPO4，0.04 g KH2PO4，0.01 g MgSO4，0.01 g CaCl2，2.00 g NaHCO3，2.50 g蛋白胨，4.00 g酵母提取物，0.40 g葡萄糖，2.00 g黏蛋白，0.50 g膽鹽，0.46 g L-Cysteine，2mL Tween-80，用去離子水定容1 000mL，調(diào)至pH 7.0（0.5mol/L NaOH），121℃高壓濕熱滅菌15min，冷卻后備用。

糞便菌群懸液參照Qiao Ding等[14]的方法配制。采集新鮮小鼠糞便，加入pH 7.0無(wú)菌PBS緩沖液，以1∶9（m/V）混合稀釋，均質(zhì)10min，1 000 r/min離心10min，去除雜質(zhì)，取上層渾濁液為糞便菌群懸液。

體外發(fā)酵方法參照Qiao Ding等[14]方法，并進(jìn)行部分調(diào)整。于10mL離心管中以5%的體積比加入模擬胃液，加入質(zhì)量比1%果蔬凍干粉充分混勻，在37℃恒溫振蕩1.5 h（120 r/min）后，立即加入模擬小腸液（體積比為5%）充分混勻，恒溫振蕩1.5 h（120 r/min，37℃），得到果蔬粉消化液。按體積比6∶3∶1混合培養(yǎng)基、模擬腸道菌群液和果蔬粉消化液，于37℃厭氧環(huán)境培養(yǎng)24 h，分別于0，3，6，12，24 h取樣5mL，12 000 r/min離心10min，沉淀和上清液分別保存-80℃待測(cè)。以不添加果蔬凍干粉為對(duì)照組。

1.3.2 果蔬凍干全粉主要碳水化合物及總酚含量測(cè)定 參考HPLC-RID法[15]測(cè)定果蔬凍干粉中葡萄糖、果糖和蔗糖含量。參考AOAC 991.43法[16]測(cè)定總膳食纖維含量。采用Folin-Ciocalteu法[17]測(cè)定總酚含量，依據(jù)沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總酚含量，表示為mg/100 g。

1.3.3 有益菌數(shù)量的測(cè)定 采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）絕對(duì)定量法[18]測(cè)定樣品中雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、普氏菌屬（Prevotella）、擬 桿菌屬（Bacteroides）和阿克曼氏菌（Akkermansia mucinipila）5種有益菌數(shù)量。選擇總菌及上述5種有益菌的特異性擴(kuò)增引物，采用基因克隆方法構(gòu)建相應(yīng)有益菌的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，以10倍梯度稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，利用特異性引物（表1）進(jìn)行qPCR測(cè)定，繪制目的細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

以總DNA為模板，利用特異性引物（表1）進(jìn)行qPCR測(cè)定。擴(kuò)增體系（10μL）：2×SYBR Premix Ex TaqⅡ5μL，正、反向引物各0.25 nmol，模板DNA 1μL，ddH2O補(bǔ)足10μL。反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃，30 s；變性95℃，5 s；退火60℃，15 s，40個(gè)循環(huán)；延伸72℃，30 s；復(fù)性95℃，10 s。將Cq值代入對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算拷貝數(shù)，表示為copies/mL。

表1 腸道菌群菌屬引物序列Table1 Sequence of primers for intestinal microbiota

1.3.4 SCFAs含量測(cè)定 參照Hu等[21]的方法測(cè)定上清液樣品中SCFAs的含量。取800μL上清液加入200μL 50%濃硫酸漩渦混勻后，立即加入1 mL乙醚漩渦1min，冰上靜置10min，12 000 r/min離心10min，加入無(wú)水CaCl2脫水后，吸取上清過(guò)膜待測(cè)（0.22μm，尼龍膜）。采用HP-FFAP色譜柱，用氣-質(zhì)譜儀測(cè)定乙酸、丙酸、丁酸和異戊酸，外標(biāo)法計(jì)算各短鏈脂肪酸的質(zhì)量濃度。檢測(cè)器為氫火焰檢測(cè)器（Flame ionization detector，F(xiàn)ID），載氣為N2，流速19.0mL/min，分流比1∶10，空氣流速300mL/min，H2流速為30mL/min。檢測(cè)器溫度250℃，進(jìn)樣口溫度240℃，初始溫度80℃（0.5 min），升溫至150℃（4℃/min），然后升溫至230℃（20℃/min）保持10min。進(jìn)樣量1μL，重復(fù)3次。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，單因素方差分析（ANOVA）用于比較不同組之間的差異，結(jié)果以±SD表示，a、b、c、d表示不同組之間的差異顯著性（P＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 4種果蔬凍干粉的主要碳水化合物及多酚含量

對(duì)4種果蔬凍干粉中總膳食纖維、總可溶性糖、葡萄糖、果糖、蔗糖和總酚含量進(jìn)行測(cè)定（見表2）。總膳食纖維含量最高的是香菇為24.37 g/100 g，之后為絲瓜17.89 g/100 g?？扇苄蕴呛孔罡呤巧］?5.75 g/100 g，其次為枸杞和絲瓜，分別為46.43 g/100 g和32.85 g/100 g。在可溶性糖組成上，香菇中葡萄糖含量是23.20 g/100 g，果糖和蔗糖未檢出；桑葚的果糖含量較高為32.65 g/100 g，葡萄糖、蔗糖相對(duì)較少，分別為18.58，14.52 g/100 g；枸杞中主要為葡萄糖和果糖，分別為22.24 g/100 g和22.64 g/100 g；絲瓜中葡萄糖、果糖和蔗糖的含量分別為10.52，7.23 g/100 g和8.26 g/100 g。4種果蔬凍干粉均含有多酚，其中桑葚總酚含量最高，為5.58mg/100 g。

表2 果蔬凍干粉營(yíng)養(yǎng)成分（g/100g）Table2 The nutritional components of fruit and vegetable freeze-dried powders（g/100g）

2.2 體外模擬腸道微生態(tài)體系中4種果蔬凍干粉對(duì)菌群數(shù)量的影響

對(duì)照組體外發(fā)酵0～12 h總菌數(shù)量明顯上升（圖1a），12～24 h趨向平穩(wěn)，表明該體系有利于腸道菌群進(jìn)行發(fā)酵。有研究表明雙歧桿菌屬和乳酸桿菌屬是生物體腸道內(nèi)重要的益生菌[22-23]；普氏菌屬和擬桿菌屬是健康人體腸道菌群中的主導(dǎo)菌種[24]，為人體提供營(yíng)養(yǎng)并維持腸道的正常生理功能；阿克曼氏菌能夠改善腸道屏障功能，被稱為潛在益生菌[25]。采用膳食補(bǔ)充等手段促進(jìn)有益菌數(shù)量的增加，對(duì)維護(hù)人體腸道健康十分重要。本研究發(fā)現(xiàn)，4種果蔬凍干粉分別對(duì)雙歧桿菌屬、乳酸菌屬、普氏菌屬、擬桿菌屬和阿克曼氏菌數(shù)量的增加產(chǎn)生了不同程度的影響。桑葚、枸杞和絲瓜自發(fā)酵6 h起促進(jìn)雙歧桿菌屬數(shù)量增加（圖1b），24 h時(shí)顯著高于對(duì)照和香菇組（P＜0.05）。桑葚、枸杞和絲瓜自發(fā)酵3 h起顯著促進(jìn)乳酸桿菌屬數(shù)量增加（圖1c），且顯著高于對(duì)照和香菇組（P＜0.05）。絲瓜自體外發(fā)酵6 h起顯著促進(jìn)普氏菌屬和擬桿菌屬數(shù)量增加（圖1d-1e），12 h和24 h時(shí)均顯著高于其它各組（P＜0.05）。然而，果蔬各組均未能顯著促進(jìn)阿克曼氏菌數(shù)量的增加（P＜0.05），如圖1f所示。

圖1 體外發(fā)酵各組（a）總菌、（b）雙歧桿菌屬、（c）乳酸菌屬、（d）普氏菌屬、（e）擬桿菌屬和（f）阿克曼氏菌數(shù)量變化Fig.1 The number of（a）all bacteria，（b）Bifidobacterium，（c）Lactobacillus，（d）Prevotella，（e）Bacteroides，and（f）Akkermansia mucinipila in the in vitro fermentation system

2.3 體外模擬腸道微生態(tài)體系中4種果蔬凍干粉對(duì)短鏈脂肪酸含量的影響

腸道菌群主要代謝產(chǎn)物為SCFAs，包括乙酸、丙酸和丁酸等，乙酸參與脂肪生成和糖異生過(guò)程，丙酸可以影響肝臟和膽固醇代謝[4]，丁酸是腸道上皮細(xì)胞的重要能量來(lái)源[26]，異戊酸屬于支鏈脂肪酸，具有顯著的抗炎效果[27]。SCFAs含量可以作為評(píng)價(jià)腸道微生態(tài)平衡的重要指標(biāo)。如圖2a所示，4種果蔬凍干粉對(duì)乙酸增加均有明顯的促進(jìn)作用，其中桑葚組顯著高于對(duì)照和其它果蔬組（P＜0.05），在24 h達(dá)到最高值為465.41μg/mL。發(fā)酵24 h時(shí)，絲瓜粉組的丙酸含量達(dá)到122.35μg/mL，顯著高于其它果蔬組（P＜0.05），低于對(duì)照組（圖2b）。絲瓜粉組自發(fā)酵6h起促進(jìn)丁酸含量增加，且顯著高于其它果蔬組（P＜0.05），12 h達(dá)到最大值為130.24μg/mL（圖2c）。各果蔬組處理的異戊酸含量均較低，僅絲瓜組有促進(jìn)作用（圖2d）。

圖2 體外發(fā)酵各組（a）乙酸、（b）丙酸、（c）丁酸和（d）異戊酸的產(chǎn)量Fig.2 The production of（a）acetic acid，（b）propionic acid，（c）butyric acid and（d）iso-valeric acid in the in vitro fermentation system

3 結(jié)論與討論

體外模擬腸道微生態(tài)體系具有操作簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好和成本經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，能夠方便快捷地研究腸道菌群及其代謝產(chǎn)物的變化。常見的體外發(fā)酵體系有人腸道模擬系統(tǒng)（SHIME）[10]、三聯(lián)體外發(fā)酵模擬系統(tǒng)[11]和迷你體外模擬腸道系統(tǒng)（Copenhagen MiniGut）[28]等。本研究基于體外模擬腸道微生態(tài)體系，分別評(píng)價(jià)了絲瓜、香菇、桑葚和枸杞凍干粉對(duì)腸道菌群及其代謝產(chǎn)物SCFAs的影響，結(jié)果表明，4種果蔬凍干粉均能夠不同程度增加有益菌數(shù)量和SCFAs含量，為今后篩選健康膳食干預(yù)、科學(xué)飲食搭配提供試驗(yàn)參考。

果蔬中富含膳食纖維，膳食纖維尤其是不溶性膳食纖維能夠直接經(jīng)過(guò)胃、小腸部位進(jìn)入腸道[29]。許多研究證明普氏菌屬和擬桿菌屬均可利用復(fù)雜碳水化合物產(chǎn)生乙酸和丙酸[24，30]，雙歧桿菌和乳酸桿菌是益生菌，可以維持免疫平衡和增強(qiáng)腸道屏障功能[22-23]，利用單糖或低聚糖代謝產(chǎn)生乙酸[2]。丁酸CoA可在乙酸存在的條件下通過(guò)butyryl CoA：acetate CoA轉(zhuǎn)移酶合成丁酸[31]。果蔬中的單糖可被雙歧桿菌和乳酸桿菌利用[32]，多酚可以選擇性地促進(jìn)雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量增加[33]。本研究發(fā)現(xiàn)絲瓜能夠顯著促進(jìn)普氏菌屬、擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬數(shù)量及其代謝物乙酸、丙酸、丁酸含量（圖1-2）。絲瓜的總膳食纖維和總酚含量均較高（表2），推測(cè)絲瓜的膳食纖維可能促進(jìn)普氏菌屬和擬桿菌屬直接代謝產(chǎn)生乙酸和丙酸，多酚及可溶性糖促進(jìn)雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量增加，大量乙酸存在的環(huán)境促使丁酸CoA轉(zhuǎn)化為丁酸，這些使絲瓜呈現(xiàn)出明顯的益生元功效。本研究還發(fā)現(xiàn)桑葚粉的果糖和總酚含量最高，且對(duì)雙歧桿菌屬數(shù)量和乙酸含量的增加顯著高于其它果蔬組，乳酸桿菌數(shù)量增加顯著高于除絲瓜組以外的其它果蔬組。同樣的，枸杞粉的單糖和總酚含量相比桑葚粉含量較低，具有促進(jìn)雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬數(shù)量和乙酸含量的增加效果，然而比桑葚組較弱，說(shuō)明果蔬對(duì)有益菌數(shù)量和SCFAs產(chǎn)量的影響與營(yíng)養(yǎng)成分含量有極大關(guān)系。阿克曼氏菌是黏液降解菌，特異性利用腸道中的黏蛋白，能夠改善腸道屏障功能。據(jù)報(bào)道是與降脂、降血糖等功能密切相關(guān)的有益菌種[25，34]。通過(guò)基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)該菌具有果糖和甘露糖代謝途徑[35]，然而目前尚缺研究證實(shí)。本研究顯示4種果蔬凍干粉均未能對(duì)阿克曼氏菌數(shù)量增加產(chǎn)生顯著性影響，這說(shuō)明果蔬調(diào)節(jié)阿克曼氏菌的特殊性和復(fù)雜性。特定營(yíng)養(yǎng)組分對(duì)阿克曼氏菌的調(diào)節(jié)機(jī)制，以及阿克曼氏菌與其它菌群的相互作用仍需進(jìn)一步挖掘。

通過(guò)上述分析得出，本研究建立的體外模擬腸道微生態(tài)體系可以用來(lái)評(píng)價(jià)果蔬凍干粉的益生元功效，且研究發(fā)現(xiàn)絲瓜、桑葚和枸杞能夠促進(jìn)腸道中4種有益菌生長(zhǎng)和SCFAs產(chǎn)生，其中絲瓜和桑葚展示出顯著的益生元功效。針對(duì)這些果蔬中各個(gè)營(yíng)養(yǎng)組分的益生元效果以及如何對(duì)人體腸道菌群起到益生作用還有待進(jìn)一步研究。