銀離子固相萃取法測定反芻動(dòng)物反式脂肪酸異構(gòu)體含量

胡盛本 蔡澄亮 卓成飛 周若琳 陶 林 鄧澤元 李 靜

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌330047）

膳食反式脂肪酸與人體健康的關(guān)系近年來備受關(guān)注，而反式脂肪酸的來源主要有兩類：一類是植物油或魚油經(jīng)高溫或者化學(xué)催化等過程中產(chǎn)生的大量的反式脂肪酸，被稱為工業(yè)氫化油反式脂肪酸（industrial trans fatty acids，ITFA）[1-2]，另一類是反芻動(dòng)物反式脂肪酸（ruminant trans fatty acids，RTFA），這是一類天然的反式脂肪酸，在反芻動(dòng)物（如牛、羊）瘤胃中，微生物將食物中的多不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化成反式脂肪酸[3-5]。

研究表明，ITFA與心血管疾病的發(fā)生呈正相關(guān)，攝入過量的ITFA會(huì)提高血脂含量，提高體內(nèi)低密度脂蛋白酯（LDL），降低高密度脂蛋白酯（HDL），同時(shí)還會(huì)提高脂蛋白含量，如提高載脂蛋白A1等[6-8]。有研究發(fā)現(xiàn)ITFA可提高細(xì)胞內(nèi)炎癥因子ICAM～1,VCAM～1的表達(dá)，從而促發(fā)炎癥[9-10]。目前對(duì)反芻動(dòng)物反式脂肪酸與人類健康的關(guān)系仍有爭議，一方面有研究稱，與ITFA和RTFA一樣，能提高血脂含量，促發(fā)功能紊亂，要求在食品標(biāo)簽上標(biāo)注反芻動(dòng)物反式脂肪酸的含量；另一部分研究則認(rèn)為反芻動(dòng)物反式脂肪酸能改善血脂，對(duì)血管健康有益。

反式十八碳一烯酸（Trans octadecenoic acid，trans-18：1）是反芻動(dòng)物脂質(zhì)中起主導(dǎo)性的一類脂肪酸，而不同的反式十八碳烯酸對(duì)健康的影響也不同，11t18：1是反芻動(dòng)物中含量最高的一類反式脂肪酸，有報(bào)道稱其可以預(yù)防癌癥的發(fā)生[11]，而9t18：1會(huì)使得血脂異常，誘導(dǎo)心血管疾病發(fā)生[12]。此外，反芻動(dòng)物脂質(zhì)中還含有9t16：1。有研究稱，除了反芻動(dòng)物自身含有9t16：1外，還有部分是通過11t18：1氧化生成，9t16：1能夠提高胰島素的敏感性，對(duì)糖尿病的促發(fā)有一定抑制作用，還能舒緩血管壓力[13-15]。作者推測，反式脂肪酸異構(gòu)體的種類及含量的不同，可能是造成這種爭議的原因。了解反芻動(dòng)物反式脂肪酸異構(gòu)體的種類、含量，對(duì)于揭示RTFA與人類健康的關(guān)系有一定的指導(dǎo)意義。

目前分離反式脂肪酸的方法主要有兩種：一種是銀離子薄層色譜法[16]，另一種是銀離子固相萃取法[17-18]，其原理是銀離子與不飽和脂肪酸雙鍵間有微弱作用力，其強(qiáng)度隨雙鍵數(shù)目的增加而增加，隨鍵長的增加而減弱，特別是銀離子與順式異構(gòu)體的結(jié)合比反式異構(gòu)體更為牢固。而銀離子薄層色譜操作復(fù)雜，耗時(shí)較長，且損失率比較大；反之，銀離子固相萃取法，步驟簡單，損失率低。

利用銀離子固相萃取法從反芻動(dòng)物脂質(zhì)中分離出反式脂肪酸異構(gòu)體，用氣相色譜儀檢測3種反芻動(dòng)物脂質(zhì)甘油三酯和磷脂反式脂肪酸異構(gòu)體的種類與含量，并以氫化大豆油作為對(duì)照，為揭示RTFA對(duì)健康的影響提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原材料：牛奶、牛肉、羊肉。

試劑：脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品（GLC463標(biāo)樣），NuChek．Prep公司；氯仿、甲醇、草酸、乙腈、甲醇鈉、異丙醇等均為分析純?cè)噭?；乙酸乙酯、正己烷為色譜純?cè)噭?/p>

儀器與設(shè)備：FA2204B電子天平，上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；6890N型氣相色譜儀，美國安捷倫公司；TDL～5～A低速大容量離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；DF101B數(shù)顯集熱式攪拌器，金壇市大地自動(dòng)化儀器廠；

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 樣品從超市購買，其中，牛奶4℃保存。洗凈牛肉和羊肉，攪碎后4℃保存。

1.2.2 樣品脂質(zhì)的提取 參照Folch法[19]并作修改，提取原料中的脂質(zhì)。分別取1 g牛肉、羊肉或1mL牛奶放入50mL大試管中，加入2mL水，5 mL甲醇和2.5mL氯仿，震蕩1～2min，加入2.5 mL水和2.5mL氯仿，渦流混勻，離心，取下層有機(jī)相，用氮?dú)獯蹈桑玫酱钟椭?/p>

1.2.3 甘油三酯和磷脂的分離和收集 用氨丙基硅膠固相萃取小柱對(duì)油脂樣品進(jìn)行純化[20-21]。用前先用7.5mL正己烷對(duì)固相萃取小柱進(jìn)行除雜，然后取適量樣品溶解于0.2mL氯仿中，上樣。用4 mL氯仿-異丙醇（2∶1）洗脫出中性脂質(zhì)甘油三酯，用4mL乙醚-乙酸（98∶2）洗脫出游離脂肪酸，最后用4mL甲醇洗脫出磷脂，收集洗脫出的甘油三酯和磷脂，氮?dú)獯蹈桑?20℃下保存。用TLC法確定分離效果是否良好。

1.2.4 脂肪酸的測定

1.2.4.1 總脂肪酸和甘油三酯脂肪酸的測定 總脂肪酸和甘油三酯脂肪酸的測定采用堿法甲酯化方法[22]。取2mg TAG溶于1.5mL正己烷，加入40μL乙酸甲酯和100μL（0.5mol/L）甲醇鈉溶液，渦流混勻1min，37℃下反應(yīng)20min，置于冰箱下層-20℃冷凍10min，取出后立即加入100μL草酸溶液，離心棄沉淀，N2吹干，GC分析TAG脂肪酸組成。

1.2.4.2 磷脂脂肪酸的測定 磷脂脂肪酸的測定采用酸法甲酯化方法。稱取2mg磷脂于15mL試管中，分別加入2mL 14%三氟化硼～甲醇溶液，1 mL甲苯，沖入氮?dú)?，密封?0℃水浴加熱1 h,冷卻至室溫，加入3mL正己烷和1mL超純水，渦流混勻，2 000 r/min離心10 min，取2mL上清液，氮?dú)獯蹈?，加?mL正己烷（色譜純）復(fù)溶，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶，GC測定。

1.2.5 銀離子固相萃取柱分離反式脂肪酸[23]按照1.2.4節(jié)方法得到脂肪酸甲酯，用銀離子固相萃取柱（750mg/6mL）分離出反式十八碳烯酸甲酯，先分別用4mL丙酮和4mL正己烷活化柱子，將1～2mg脂肪酸甲酯溶于1mL正己烷，上樣，之后用6mL正己烷（99∶1，V/V）洗脫出飽和脂肪酸甲酯，再用6mL正己烷-丙酮（96∶4，V/V）洗脫出反式十八碳烯酸甲酯。

1.2.6 氣相色譜分析 色譜條件參照Cruz～Hernandez等[24]，色譜柱為CP～Sil88熔融石英毛細(xì)管柱（100m×0.25mm×0.2μm）。載氣為H2，燃燒氣為H2、N2和空氣。FID溫度250℃，進(jìn)樣口溫度250℃。氣相色譜程序：45℃時(shí)保持4min，以13℃/min的速率將溫度升至175℃，保持27min，再以4℃/min的速率升至215℃，保持35min。脂肪酸的分析參照標(biāo)準(zhǔn)圖譜，脂肪酸含量采用面積歸一化法確定（以峰值面積的百分比表示）。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 用SPSS20.0分析數(shù)據(jù)，結(jié)果用Mean±SD表示。用Excel分析處理數(shù)據(jù)，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次以上。用單因素方差分析比較均值，P＜0.05為顯著差異。用Origin8.0繪圖，用Metabonalyst 3.0進(jìn)行最小偏二乘法分析和主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 反芻動(dòng)物脂質(zhì)各組分含量

圖1顯示3種反芻動(dòng)物脂質(zhì)中各組分含量。反芻動(dòng)物中，TAG含量占總脂質(zhì)含量的58.25%～66.13%，其中含量最高的是牛奶TAG，占總脂質(zhì)的66.13%，最低的是牛肉TAG，占總脂質(zhì)的58.25%。PL含量占總脂質(zhì)含量的12.22%～17.09%，含量最高的是羊肉PL，占17.09%，最低的是牛肉TG，占12.22%。在氫化大豆油中，甘油三酯占總脂的92.65%，磷脂未洗脫出來，這可能是油脂在精煉過程中，經(jīng)脫酸、脫色和脫臭等步驟去除了磷脂。

圖1 反芻動(dòng)物各脂質(zhì)組分含量Fig.1 Lipids classes in ruminant animals oil

2.2 反芻動(dòng)物各脂質(zhì)組分中反式脂肪酸含量

圖2a顯示3種反芻動(dòng)物脂質(zhì)和氫化大豆油總脂肪酸含量。在牛奶脂質(zhì)、牛肉脂質(zhì)和羊肉脂質(zhì)中，反式脂肪酸含量最高的是羊肉脂質(zhì)，占總脂肪酸的7.64%，其次為牛奶脂質(zhì)，占總脂肪酸的3.05%，含量最低的是牛肉脂質(zhì)，占總脂肪酸的2.77%。此外，在3種反芻動(dòng)物脂質(zhì)中共檢測出3類反式脂肪酸：trans-16：1、trans-18：1和trans-18：2，其中總反式脂肪酸含量最高的是羊肉脂質(zhì)，占總脂肪酸的7.64%，其次為牛奶脂質(zhì)，占總脂肪酸的3.05%，含量最低的是牛肉脂質(zhì)，占總脂肪酸的2.77%。含量最高的反式脂肪酸是trans-18：1，分別占總脂肪酸的2.18%～6.69%。而氫化油中，反式脂肪酸含量高達(dá)45.43%。共檢測出兩類反式脂肪酸：trans-18：1和trans-18：2，最主要的反式脂肪酸是trans-18：1，占總脂肪酸的45.13%。

圖2b顯示反芻動(dòng)物脂質(zhì)甘油三酯脂肪酸含量，其中總反式脂肪酸含量最高的是羊肉脂質(zhì)，占總脂肪酸的7.38%，其次為牛肉脂質(zhì)，占總脂肪酸的3.09%，含量最低的是牛奶脂質(zhì)，占總脂肪酸的2.67%。共檢出3類反式脂肪酸：trans16：1、trans-18：1和trans18：2，其中含量最高的反式脂肪酸是trans-18：1，分別占總脂肪酸的2.13%～6.42%。氫化油中，反式脂肪酸含量高達(dá)44.35%，共檢出兩類反式脂肪酸：trans-18：1和trans-18：2，最主要的反式脂肪酸是trans-18：1，占總脂肪酸43.40%，占總反式脂肪酸的97.97%。

圖2c顯示3種反芻動(dòng)物脂質(zhì)磷脂反式脂肪酸含量，其中總反式脂肪酸含量最高的是牛肉脂質(zhì)，占總脂肪酸的5.89%，其次為牛奶脂質(zhì)，占總脂肪酸的3.15%，含量最低的則是羊肉脂質(zhì)，占總脂肪酸的2.72%。此外，共檢測出3類反式脂肪酸：trans-16：1、trans-18：1和trans-18：2，其中含量最高的反式脂肪酸是trans-18：1，分別占總脂肪酸的1.86%～4.53%。

2.3 反芻動(dòng)物脂質(zhì)中trans-18：1異構(gòu)體含量

表1為反芻動(dòng)物脂質(zhì)trans-18：1異構(gòu)體含量，總脂中，從牛奶和牛肉脂質(zhì)中檢測到8種trans-18：1異構(gòu)體，而羊肉脂質(zhì)中檢測到9種trans-18：1異構(gòu)體，其中含量最高的是11t18：1，分別占總反式脂肪酸的30.33%～39.03%，含量最高的為牛奶脂質(zhì)，占39.03%，最低的為羊肉脂質(zhì)，占30.33%。而氫化大豆油中，檢測出7種trans-18：1異構(gòu)體，含量最高的是6-8t18：1，它們未能分開，其次是9t18：1，占總反式脂肪酸的21.79%。

甘油三酯，在3種反芻動(dòng)物脂質(zhì)中共檢出7種trans-18：1異構(gòu)體含量，其中含量最高的是11t18：1，分別占總反式脂肪酸的38.08%～45.09%，含量最高的為牛奶脂質(zhì)，占45.09%，最低的為牛肉脂質(zhì)，占38.08%。氫化大豆油中，檢出7種trans-18：1異構(gòu)體，含量最高的是6-8t18：1，它們未能分開，其次是9t18：1，占總反式脂肪酸的19.91%。

磷脂，在3種反芻動(dòng)物脂質(zhì)中，從牛奶和牛肉脂質(zhì)中檢測到8種trans-18：1異構(gòu)體，而從羊肉脂質(zhì)中檢測到7種trans-18：1異構(gòu)體，其中含量最高的是11t18：1，分別占總反式脂肪酸的27.10%～44.47%，含量最高的為羊肉脂質(zhì)，占44.47%，最低的為牛奶脂質(zhì)，占27.10%。

圖2 反芻動(dòng)物脂質(zhì)反式脂肪酸含量Fig.2 Fatty acids compositions of ruminant animals lipids

表1 反芻動(dòng)物脂質(zhì)trans-18：1異構(gòu)體含量（占總trans-18：1百分含量）Table1 Trans octadecenoic acid isomers in ruminant animals lipids（percentage of tatal trans-18：1）

（續(xù)表1）

2.4 多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析反芻動(dòng)物脂質(zhì)脂肪酸差異

圖3顯示偏最小二乘法分析反芻動(dòng)物與氫化大豆油反式脂肪酸差異。由于從反芻動(dòng)物脂質(zhì)和氫化油中都分離得到甘油三酯，氫化油中無磷脂，所以甘油三酯是它們共有成分。用甘油三酯反式脂肪酸數(shù)據(jù)做主成分分析，圖3a為總得分圖，PC1為91.5%，PC2為7.9%，共含99.4%的信息?？梢钥闯?種反芻動(dòng)物脂質(zhì)脂肪酸總得分位于總得分圖（圖3a）的第二、三象限，而氫化油位于第一、四象限，它們之間間隔很大，說明主成分分析將反芻動(dòng)物脂質(zhì)與氫化油脂質(zhì)區(qū)分開。而圖3b是VIP score，表明造成這種差異的是一些脂肪酸，其中起主要貢獻(xiàn)的脂肪酸有9t18：1，11t18：1和6-8t18：1，這3類反式脂肪酸異構(gòu)體是反芻動(dòng)物脂質(zhì)與氫化大豆油之間的差異反式脂肪酸。此外，總得分圖也將3種反芻動(dòng)物分開，說明它們的反式脂肪酸存在差異，還需進(jìn)一步分析。

圖3 偏最小二乘法分析反芻動(dòng)物脂質(zhì)和氫化大豆油反式脂肪酸差異Fig.3 PLS-DA analysis on trans fatty acids of ruminant animal lipids and partially hydrogenated soybean oil

圖4顯示偏最小二乘法判別分析法（PLSDA）分析反芻動(dòng)物脂質(zhì)脂肪酸差異。圖4a為總得分圖，其中PC1為77.4%，PC2為20.1%，共含97.5%的信息。3種反芻動(dòng)物脂質(zhì)脂肪酸總得分分別位于得分圖的3個(gè)方向，間隔很大，說明PLSDA法分析3種反芻動(dòng)物脂質(zhì)反式脂肪酸能將它們區(qū)分開。而圖4b是VIP score，造成這種差異主要是一些脂肪酸，其中起主要貢獻(xiàn)的脂肪酸有PL-11t18：1，PL-15t18：1和TAG-9t18：1等，而這些脂肪酸在這3種反芻動(dòng)物脂質(zhì)中含量變化都比較大。

圖4 偏最小二乘法分析反芻動(dòng)物脂質(zhì)脂肪酸差異Fig.4 PLS-DA analysis on the difference of ruminant animal lipids fatty acids

3 討論

分析了3種反芻動(dòng)物脂質(zhì)反式脂肪酸，并以氫化大豆油反式脂肪酸作對(duì)照，發(fā)現(xiàn)在氫化大豆油中總反式脂肪酸含量高達(dá)45.43%，而反芻脂質(zhì)中總反式脂肪酸含量僅2.77%～7.64%，氫化油中的反式脂肪酸是反芻動(dòng)物脂質(zhì)中的6～16倍。一項(xiàng)元分析表明，每增加2%反式脂肪酸攝入，就會(huì)增加23%冠心病的促發(fā)率[25]。同時(shí)用2%反式脂肪酸的能量取代相對(duì)應(yīng)的碳水化合物、飽和脂肪酸、順式單不飽和脂肪酸和順式多不飽和脂肪酸的能量，心血管疾病的發(fā)生率會(huì)分別增加24%，20%，27%和34%[26]?？梢姡攀撤词街舅釘z入量是造成這兩種反式脂肪酸對(duì)健康影響的原因之一。

通過比較反芻動(dòng)物和氫化大豆油反式脂肪酸異構(gòu)體，發(fā)現(xiàn)氫化油中只存在trans-18：1和trans-18：2兩類反式脂肪酸，而反芻動(dòng)物脂質(zhì)中除此之外還多了一種9t16：1。有研究報(bào)道9t16：1有助于緩解2型糖尿病和降低血管壓力，減少甘油三酯的產(chǎn)生和提高胰島素的敏感性[15]。trans-18：1是反芻動(dòng)物和氫化大豆油中主要的反式脂肪酸，它存在很多同分異構(gòu)體，通過銀離子固相法能夠從反芻動(dòng)物脂質(zhì)中分離9種trans-18：1異構(gòu)體，其中甘油三酯中7種，從氫化大豆油總脂質(zhì)和甘油三酯中分離出7種trans-18：1異構(gòu)體。反芻動(dòng)物脂質(zhì)中，含量最高的trans-18：1是11t18：1，而氫化大豆油中含量最高的是9t18：1。9t18：1被當(dāng)作工業(yè)反式脂肪酸代名詞（ITFA），流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)它與心血管疾病呈正相關(guān)，會(huì)造成內(nèi)皮紊亂，促發(fā)炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化，被認(rèn)為是一種有害的反式脂肪酸[10，27]。而11t18：1，目前它對(duì)健康的影響尚存爭議，部分研究發(fā)現(xiàn)11t18：1可以部分通過SCD-1脂肪酶轉(zhuǎn)變?yōu)镃LA，可能是一種有益的脂肪酸，可以降低心血管疾病和癌癥的發(fā)生[28]。11t-18：1還可以通過β氧化生成9t16：1[14]。反芻動(dòng)物反式脂肪酸（RTFA）和工業(yè)氫化油反式脂肪酸（ITFA）是對(duì)健康影響的又一原因，它們?cè)诜词街舅岙悩?gòu)體含量和種類上存在差異，反芻動(dòng)物脂質(zhì)中可能存在更多有益或?qū)】祩^小的反式脂肪酸異構(gòu)體。

通過比較3種反芻動(dòng)物甘油三酯和磷脂反式脂肪酸，發(fā)現(xiàn)在甘油三酯中羊肉中總反式脂肪酸顯著高于其它二者（P＜0.05），而在磷脂中是牛肉中的反式脂肪酸含量更高（P＜0.05）。通過PLS-DA分析3種反芻動(dòng)物反式脂肪酸異構(gòu)體之間的差異，羊肉脂質(zhì)中甘油三酯中的9t18：1和磷脂中的11t18：1含量均顯著高于牛奶脂質(zhì)和牛肉脂質(zhì)（P＜0.05）；牛肉脂質(zhì)中磷脂中的9t18：1和15t18：1含量均顯著高于牛奶脂質(zhì)和羊肉脂質(zhì)（P＜0.05）；牛奶脂質(zhì)磷脂中的12t18：1和16t18：1的含量均顯著高于牛肉脂質(zhì)和羊肉脂質(zhì)（P＜0.05）。可見，反芻動(dòng)物脂質(zhì)磷脂反式脂肪酸的差異顯著，這可能是反芻動(dòng)物物種之間的差異和飼養(yǎng)條件不同所致。對(duì)于磷脂上結(jié)合的不同反式脂肪酸對(duì)人體健康的影響還需進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

以3種反芻動(dòng)物脂質(zhì)為研究對(duì)象，以氫化大豆油為對(duì)照，測定反芻動(dòng)物反式脂肪酸種類與含量，并利用銀離子固相萃取小柱測定反式十八碳烯酸的種類與含量。研究表明，3種反芻動(dòng)物脂質(zhì)之間存在差異，其中甘油三酯和磷脂中總反式脂肪酸含量最高的是羊肉脂質(zhì)，而磷脂中是牛肉脂質(zhì)總反式脂肪酸含量最高。通過PLS-DA分析3種反芻動(dòng)物反式脂肪酸異構(gòu)體之間的差異，羊肉脂質(zhì)中甘油三酯中的9t18：1和磷脂中的11t18：1含量均顯著高于牛奶脂質(zhì)和牛肉脂質(zhì)（P＜0.05）；牛肉脂質(zhì)中磷脂中的9t18：1和15t18：1含量均顯著高于牛奶脂質(zhì)和羊肉脂質(zhì)（P＜0.05）；牛奶脂質(zhì)磷脂中的12t18：1和16t18：1的含量均顯著高于牛肉脂質(zhì)和羊肉脂質(zhì)（P＜0.05）。這種差異是否是造成RTFA與ITFA對(duì)健康的影響差異，還需進(jìn)一步研究。