土鱉蟲活性肽組分對急性血瘀模型大鼠血液流變學(xué)、血脂四項(xiàng)指標(biāo)及血液因子含量的影響

姜 珊 王少平 代 龍 張加余 高 鵬 劉子菡 王喻淇

(1. 濱州醫(yī)學(xué)院，山東 煙臺 264003； 2. 山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250300；3. 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 102488)

土鱉蟲為鱉蠊科昆蟲地鱉或冀地鱉的雌蟲干燥體，為中醫(yī)臨床傳統(tǒng)用藥。其最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]，又稱土元、土鱉子、地烏龜，能活血逐瘀、續(xù)筋接骨，臨床主要用于跌打損傷、筋損骨折、血瘀經(jīng)閉以及產(chǎn)后血瘀腹痛等癥[2]。土鱉蟲蛋白質(zhì)含量占總蟲體質(zhì)量的60%，且所含的氨基酸種類完整，幾乎包括構(gòu)成蛋白質(zhì)的所有氨基酸[3]。但是，大分子蛋白無法被人體吸收，只能經(jīng)過胃腸道蛋白消化酶的作用轉(zhuǎn)變?yōu)樾》肿踊钚噪暮蠓侥馨l(fā)揮藥效[4-7]。仿生酶解動(dòng)物蛋白制備的活性物質(zhì)主要以小肽或寡肽形式存在，被認(rèn)為是動(dòng)物類中藥真正起效的物質(zhì)基礎(chǔ)[8-10]。

中醫(yī)“血瘀證”是一類疾病的統(tǒng)稱，主要包括高血脂、高血壓、血管狹窄、動(dòng)脈粥樣硬化和腦血栓等病癥。其病理表現(xiàn)為全血黏度上升、血細(xì)胞壓積升高、血小板聚集性增強(qiáng)、電泳時(shí)間加長、血管功能失調(diào)、促血管生成因子減少、自由基增加和局部組織缺血造成壞死等[11-12]。

據(jù)報(bào)道[13]，土鱉蟲體內(nèi)含有具有纖溶活性的物質(zhì)，具有顯著的活血化瘀功效。目前大部分研究[14-16]是關(guān)于土鱉蟲干粉和土鱉蟲蛋白質(zhì)具有纖溶活性的報(bào)道，土鱉蟲乙醇(水)提取物均可以改善大鼠機(jī)體凝血因子、抗氧化/氧化因子的水平，并促進(jìn)血管生成。韓雅莉等[17]從地鱉蟲中分離出3種具有纖溶活性的蛋白質(zhì)EFF1、EFF2和EFF3，其中EFF2活性最強(qiáng)。而土鱉蟲活性肽是由土鱉蟲蛋白質(zhì)經(jīng)仿生酶解而來，結(jié)合蛋白質(zhì)體內(nèi)消化過程，推斷土鱉蟲活性肽具有纖溶活性。但是以土鱉蟲活性肽為材料研究其對“血瘀證”的作用機(jī)制未見報(bào)道。同時(shí)對于土鱉蟲活性肽中存在的活性小肽組分也沒有明確信息。

試驗(yàn)擬以土鱉蟲活性肽為研究材料，基于多種分離方式聯(lián)合檢測手段并行的原則，分離純化獲得土鱉蟲活性肽組分，并探討分離組分對急性血瘀模型大鼠血液流變學(xué)、血脂四項(xiàng)指標(biāo)及血液因子含量的影響，為動(dòng)物藥治療血瘀證提供新的研究思路和試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

土鱉蟲藥材：中華冀地鱉[Steleophagaplancyi(Boleny)]，山東省長清土元養(yǎng)殖公司；

SD大鼠：8周齡，體重180～200 g，許可證號SCXK(魯)20140007，山東濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；

凝血酶：500 U/g，深圳生化制劑廠；

牛血纖維蛋白原：純度95.3%，沈陽拜英生物科技有限公司；

胃蛋白酶(2 500 U/mg)、胰蛋白酶(5 000 U/mg)：上海國藥試劑集團(tuán)有限公司；

大孔吸附樹脂：DA201-C型，滄州寶恩樹脂有限公司；

Sephadex G25：南京?？藸柹锟萍加邢薰荆?/p>

T-CHO、TG、HDL和LDL試劑盒：南京建成生物工程研究所有限公司；

NO、SOD、t-PA和FIBELISA試劑盒：上海酶聯(lián)生物科技公司。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱：BPH-9082型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

恒溫水浴鍋：HH-601型，鎮(zhèn)江瑞祥儀器有限公司；

十萬分之一天平：MS104型，梅特勒—托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司；

超聲振蕩儀：KQ2200DV型，杭州法蘭特超聲波科技有限公司；

全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀：LH 750型，貝克曼庫爾特中國儀器公司；

恒溫旋轉(zhuǎn)儀：N-1100VEYeLa型，日本東京理化儀器公司；

多功能電導(dǎo)儀：FE30型，梅特勒—托利多(上海)精密儀器公司；

小型電滲析儀：LH320型，遼寧金科水處理有效公司；

膜處理設(shè)備：DKH-43型，上海陶氏膜處理集團(tuán)。

1.3 方法

1.3.1 土鱉蟲活性肽的制備 根據(jù)課題組[18]前期的研究，取土鱉蟲藥材(過80目篩)500 g，加10倍量去離子水，加熱至沸，放至室溫。用稀鹽酸調(diào)pH至2.0，加1%胃蛋白酶，37 ℃酶解1.0 h；再用氫氧化鈉溶液調(diào)pH至9.0，加1%胰蛋白酶，酶解3.0 h后加熱滅酶15 min，放涼后冷藏12 h，離心，收集上清液。調(diào)整上清液濃度到500 mg/mL，pH值至6.5，分裝入電滲析儀器內(nèi)，平衡15 min 后進(jìn)行除鹽操作2.5 h，收集土鱉蟲活性肽溶液，備用。

1.3.2 纖溶活性測定 采用尿激酶為對照藥物進(jìn)行體外纖溶活性測定[19]，以溶圈面積為縱坐標(biāo)，尿激酶活力(U)的對數(shù)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 土鱉活性肽的分離純化

(1) 超濾和納濾分離：取土鱉蟲活性肽溶液，用截留分子量為3 kDa的超濾膜和截留分子量為1 kDa納濾膜進(jìn)行分段，收集分子量>3，1～3，<1 kDa的酶解液，經(jīng)冷凍干燥后進(jìn)行纖溶活力測定，篩選出纖溶活力最高的組分。

(2) DA201-C型大孔吸附樹脂分離：根據(jù)文獻(xiàn)[20]修改如下，將1.3.3(1)獲得的纖溶活性最高的組分離心過濾后，調(diào)整pH值至6.0，上樣質(zhì)量濃度為20 mg/mL，上樣體積為0.02 BV，上樣流速2 BV/h；上樣結(jié)束后吸附3 h。再依次用去離子水、25%乙醇溶液、50%乙醇溶液、75%乙醇溶液進(jìn)行洗脫，收集各洗脫液后分別凍干后測定纖溶活性。

(3) 葡聚糖凝膠G-25分離：將1.3.3(2)獲得的纖溶活性最高的組分用去離子水溶解后上樣，上樣質(zhì)量濃度為10 mg/mL，上樣體積為0.02 BV，用去離子水進(jìn)行洗脫，流速為0.2 mL/min，每1.0 mL收集一試管，采用可見—紫外分光光度儀檢測每個(gè)試管在220 nm下的吸光度(A)，至最后幾個(gè)試管的吸光度和去離子水相同時(shí)停止洗脫。將各洗脫峰分別凍干并測定纖溶活性。

(4) RP-HPLC分離：將1.3.3(3)獲得的纖溶活性最高組分采用RP-HPLC進(jìn)行分離純化。色譜條件：色譜柱為Agilent BOZAX300SB-C18肽色譜柱；檢測波長220 nm；流速1.0 mL/min；流動(dòng)相A為乙腈(含0.1%三氟乙酸)，流動(dòng)相B為純水(0.1%三氟乙酸)，梯度洗脫方法為0～50 min，95% B～50% B；50～65 min，50% B～95% B；進(jìn)樣量50 μL。對各洗脫峰進(jìn)行制備，凍干后進(jìn)行纖溶活性測定。

1.3.4 土鱉蟲活性肽對急性血瘀模型大鼠的影響

(1) 急性血瘀大鼠造模及給藥：根據(jù)文獻(xiàn)[21]修改如下，90只雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后隨機(jī)分為5組，即空白組、模型組、尿激酶陽性組、土鱉活性肽組分F2高劑量組、土鱉活性肽組分F2低劑量組。除空白組以外，其他組大鼠每天定量給予50 g高脂飼料和4.0 mL高脂乳劑，空白組大鼠給予普通飼料，持續(xù)45 d。同時(shí)，用高脂飼料和高脂乳劑飼養(yǎng)15 d后，每只老鼠肌肉注射0.2 mL 鹽酸腎上腺素注射液(除空白組)。注射30 min后冷水浴(4 ℃)15 min，持續(xù)30 d造模。按照體表面積方法計(jì)算，尿激酶組給藥劑量1.0×105U/kg，土鱉活性肽組分F2高、低劑量組按照預(yù)試驗(yàn)結(jié)果確定的給藥濃度分別為50，25 mg/kg，模型組和空白組給予生理鹽水。所有樣品均用生理鹽水溶解，肌內(nèi)注射給藥15 d，給藥期間持續(xù)給予高脂飼料。

(2) 血液取樣：末次給藥5 h后，于大鼠腹主動(dòng)脈取血3.0 mL，注入肝素鈉的玻璃硅化管內(nèi)，離心取血漿；同時(shí)取5.0 mL血液注入未加入抗凝劑的EP管，離心取血清。

(3) 生化指標(biāo)測定：采用全血液自動(dòng)分析儀、血流變分析儀對各組大鼠血漿進(jìn)行血液流變指標(biāo)檢測，并測定血清中HDL/LDL、TG、T-CHO、SOD、NO、t-PA和FIB的含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0和Graphpad Prism進(jìn)行處理，試驗(yàn)數(shù)據(jù)為3個(gè)平行樣品的平均值，以Mean±SD表示，LSD檢驗(yàn)兩兩比較；若方差不齊，檢驗(yàn)其差異性則采用H-G檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖溶活性測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

以溶圈面積為縱坐標(biāo)，尿激酶活力的對數(shù)為橫坐標(biāo)得到的線性方程為Y=1.564X-1.863 5，R2=0.997 2，線性范圍為1.337 6～5.987 1 cm2。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定結(jié)果Figure 1 Standard curve measurement results

2.2 土鱉活性肽分離純化

2.2.1 超濾和納濾分離的活性肽 超濾試驗(yàn)結(jié)果表明，分子量>3 kDa活性肽溶液無纖溶活性，而分子量<3 kDa 活性肽溶液具有明顯活性，因此對分子量<3 kDa活性肽溶液進(jìn)行納濾分離。如表1所示，分子量1～3 kDa 活性肽溶液和分子量<1 kDa活性肽溶液均有纖溶活性，但是分子量1～3 kDa活性肽溶液纖溶活性更強(qiáng)，對結(jié)果進(jìn)行分析得出：<1 kDa活性肽溶液多為游離氨基酸，氨基酸并不能直接發(fā)揮活性作用，而>3 kDa活性肽溶液多為滅活后殘留的胰蛋白酶、胃蛋白酶，幾乎沒有活性。1～3 kDa活性肽溶液多為活性肽集中存在區(qū)域，故選定該分子質(zhì)量范圍的酶解液進(jìn)行分離純化。

表1超濾和納濾分離土鱉蟲活性肽溶液纖溶活力
Table 1 Determination of fibrinolytic activity ofE.steleophagaactive peptide solution obtained by ultrafiltration and nanofiltration

土鱉活性肽溶液分子量/kDa溶圈面積/cm2活力/(U·g-1)>30.00000.00<31.53942997.76<11.10531582.121～32.00615959.35

2.2.2 DA201-C型吸附樹脂、葡聚糖凝膠G-25和RP-HPLC分離的活性肽 DA201-C型吸附樹脂處理后的去離子水洗脫液纖溶活性為0，可直接舍棄；其他3個(gè)洗脫組分的纖溶活性順序?yàn)?0%乙醇洗脫液(13 159.89 U/g)>25%乙醇洗脫液(4 107.95 U/g)>75%乙醇洗脫液(515.87 U/g)。說明DA201-C樹脂分離的活性較強(qiáng)的肽多為中等極性。然后采用葡聚糖凝膠G-25對50%乙醇洗脫液進(jìn)行分離純化，獲得的P1、P2和P3洗脫峰(圖2)的纖溶活性分別為1 674.33，62 044.61，8 615.63 U/g，因此選定活性最強(qiáng)的P2洗脫組分繼續(xù)分離純化。由圖3可知，經(jīng)過RP-HPLC色譜柱分離后，可獲得5個(gè)色譜峰(F1～F5)。其中，F(xiàn)2的纖溶活性(167 808.97 U/g)遠(yuǎn)大于其他峰，故選擇土鱉蟲生物活性肽F2進(jìn)行藥理試驗(yàn)。

2.3 土鱉蟲活性肽組分F2對急性血瘀模型大鼠影響

2.3.1 血細(xì)胞、血液流變指標(biāo) 如表2所示，尿激酶組大鼠紅細(xì)胞壓積、血小板計(jì)數(shù)明顯降低，并與模型組比較具有顯著性差異，說明尿激酶可以明顯改善血液流動(dòng)。土鱉蟲活性肽組分F2高、低劑量組也具有使兩項(xiàng)指標(biāo)降低的作用，其中高劑量組與模型組差異顯著(P<0.05)。對表3中血流變試驗(yàn)結(jié)果分析得出，尿激酶組對其改善效果較佳且與模型組比較具有極顯著性差異(P<0.01)。土鱉蟲活性肽組分F2高、低劑量組均能降低急性“血瘀證”大鼠在高、中、低切度下的血流變值，且與模型組相比具有極顯著性差異(P<0.01)，說明土鱉蟲活性肽組分F2具有改善急性“血瘀證”大鼠的血液流變指標(biāo)的作用。土鱉蟲活性肽組分F2高、低劑量組除低切下具有差異外，其他切度下沒有顯著性差異，說明治療效果和劑量間沒有關(guān)系。

圖2 葡聚糖凝膠G-25層析分離純化結(jié)果Figure 2 Sephadex gel G-25 chromatography separation and purification results

圖3 RP-HPLC分離圖譜Figure 3 RP-HPLC liquid phase separation spectrum

2.3.2 血脂四項(xiàng)指標(biāo)的檢測 由圖4可知，經(jīng)過長期給予高脂喂養(yǎng)后，模型組大鼠血液內(nèi)TG、T-CHO、HDL-C和LDL-C的含量較空白組明顯上升，具有極顯著性差異著性差異(P<0.01)。陽性藥物尿激酶組明顯降低大鼠血液內(nèi)TG、T-CHO、HDL-C和LDL-C的含量。土鱉蟲活性肽組分F2高、低劑量給藥后，血脂四項(xiàng)均有下降趨勢，與模型組比較具有顯著性差異(P<0.05)。說明土鱉蟲活性肽可下調(diào)高脂血大鼠血液內(nèi)TG、T-CHO、HDL-C和LDL-C的含量。土鱉蟲活性肽組分F2高、低劑量組之間差異不顯著，說明治療效果和劑量間相關(guān)性不明顯。

表2 血細(xì)胞檢測結(jié)果?Table 2 Blood cell test results

? **. 與空白組比有極顯著性差異(P<0.01)；△. 與模型組比有顯著性差異(P<0.05)，△△. 與模型組比有極顯(P<0.01)。

表3 血液流變指標(biāo)檢測結(jié)果?Table 3 Blood rheology index test results

? **. 與空白組比有極顯著性差異(P<0.01)；△. 與模型組比有顯著性差異(P<0.05)，△△. 與模型組比有極顯著性差異(P<0.01)；●. 與低劑量組比有顯著性差異(P<0.05)。

2.3.3 血液因子含量的測定 如圖5所示，血清SOD含量測定結(jié)果表明，造模后模型組大鼠血清中SOD含量降低，只有(15.511 1±0.884 3) μmol/mL，與空白組比具有極顯著差異(P<0.01)。連續(xù)給藥后，尿激酶組和土鱉蟲活性肽組分F2高、低劑量組大鼠血清中SOD含量均升高。其中，土鱉蟲活性肽組分F2高劑量組與模型組大鼠相比具有極顯著性差異(P<0.01)。

1. 空白組 2. 模型組 3. 尿激酶組 4. F2高劑量組 5. F2低劑量組 *. 與空白組相比有顯著性差異(P<0.05) **. 與空白組相比有極顯著差異(P<0.01)圖4 各樣本血清HDL、LDL、TG和T-CHO含量測定結(jié)果Figure 4 Results of serum HDL, LDL, TG and T-CHO determination in each sample

1. 空白組 2. 模型組 3. 尿激酶組 4. F2高劑量組 5. F2低劑量組 *. 與空白組相比有顯著性差異(P<0.05) **. 與空白組相比有極顯著差異(P<0.01) △△. 與模型組比有顯著性差異(P<0.05) ●. 與尿激酶組比有顯著性差異(P<0.05) ●●. 與尿激酶組比有極顯著差異(P<0.01)圖5 各樣本血清SOD、NO、FIB和t-PA含量測定結(jié)果Figure 5 Results of determination of serum SOD, NO, FIB and t-PA in each sample

NO在體內(nèi)作為血管擴(kuò)張機(jī)動(dòng)因子，主要起到擴(kuò)張血管、降低血壓、降低血黏度作用，為血瘀證改善的主要評價(jià)指標(biāo)。血清中NO含量結(jié)果表明，急性血瘀證模型組大鼠血清NO含量比空白組大鼠NO含量降低明顯，具有極顯著性差異(P<0.01)；連續(xù)給藥治療15 d后，各組大鼠血清NO含量均有升高，除尿激酶組外，其他各組與模型組均具有顯著性差異(P<0.05)?？紤]到尿激酶屬于直接纖溶劑，并不具有調(diào)節(jié)血清NO功能。

血液內(nèi)t-PA含量下降，造成FIB含量增加，使得大鼠具有形成血栓的潛在危險(xiǎn)性。連續(xù)給藥后，試驗(yàn)各組大鼠血清內(nèi)t-PA含量增加，對應(yīng)的纖維蛋白FIB含量減少，與模型組比，均具有顯著性差異(P<0.05)，說明恢復(fù)效果良好。其中，尿激酶作為t-PA直接作用藥物，尿激酶組大鼠血清中t-PA含量恢復(fù)最好，基本達(dá)到了空白組水平，與模型組比較具有極顯著性差異(P<0.01)。

以上說明，土鱉蟲活性肽組分F2治療“血瘀證”的機(jī)理可能是上調(diào)NO、t-PA，使血液內(nèi)FIB含量減少，從而降低血液黏度，使血細(xì)胞指數(shù)下降。

3 結(jié)論

試驗(yàn)將分離純化得到的纖溶活性肽進(jìn)行藥效研究，采用高脂乳劑灌胃+高脂飼料飼養(yǎng)并結(jié)合注射鹽酸腎上腺素與冰水冷浴方法，復(fù)制大鼠急性血瘀證模型，以大鼠血細(xì)胞和血液流變分析，血脂四項(xiàng)(HDL、LDL、T-CHO、TG)為指標(biāo)衡量土鱉蟲活性肽組分F2的治療作用，結(jié)果顯示F2組分能顯著降低大鼠血清內(nèi)TG、T-CHO、HDL和LDL的含量，上調(diào)NO、t-PA使得FIB含量減少，從而降低血液黏度，改善血液流動(dòng)性，土鱉蟲活性肽F2組分對急性血瘀模型大鼠產(chǎn)生了影響。說明采用上述工藝對土鱉蟲活性肽進(jìn)行分離是可行的。同時(shí)也證明，土鱉蟲活性肽可能是土鱉蟲“活血化瘀”作用的重要物質(zhì)。

試驗(yàn)過程也存在一些不足，如：最終分離組分F2的氨基酸組成是否與活性之間存在緊密聯(lián)系，目前尚未知；分離組分F2究竟是通過哪種途徑或者通路來調(diào)控相關(guān)因子含量，試驗(yàn)沒有涉及。針對存在的問題，后期會(huì)對F2組分進(jìn)行LC-MS分析，獲得其氨基酸序列。并進(jìn)行更加深入的研究，揭示其作用機(jī)制。