石斛與粉葛體外體內(nèi)降糖降脂協(xié)同作用研究

許子楊 敬思群 林映君 丁佳敏 周 揚(yáng) 于白音

(1. 韶關(guān)學(xué)院英東食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005；2. 韶關(guān)學(xué)院英東生命科學(xué)學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005)

醫(yī)學(xué)營(yíng)養(yǎng)療法是糖尿病管理的一個(gè)重要組成部分[1]，而通過(guò)添加藥食同源的中藥營(yíng)養(yǎng)的中藥營(yíng)養(yǎng)治療已成為研究熱點(diǎn)并在動(dòng)物試驗(yàn)獲得理想療效[2-3]。鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)具有很高的藥用價(jià)值[4]，其主要功能性成分包括石斛多糖、石斛堿、氨基酸、多肽類、酚類化合物和部分金屬元素[5-6]，在所有活性成分中多糖含量是最高的(18%～30%)。多項(xiàng)研究表明，石斛具有降血糖[7-9]、降血脂[10-11]、抗腫瘤[12]、抗氧化[13-14]、提高免疫力[15]等作用。粉葛(PuerariathomsoniiBenth)為豆科多年生藤本植物，藥用價(jià)值高，可促進(jìn)人腦的血液循環(huán)、增強(qiáng)記憶、降低血脂血糖、減肥健美[16]，研究表明粉葛中的化學(xué)成分含有異黃酮、三萜類、淀粉及礦物元素等[17-19]，其中粉葛總黃酮具有改善2型糖尿病病人胰島素抵抗的作用[20]。火山粉葛是中國(guó)國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品，丹霞鐵皮石斛是中國(guó)鐵皮石斛中的名貴優(yōu)質(zhì)品種，僅分布于粵北丹霞地貌巖石上，韶關(guān)石斛產(chǎn)業(yè)逐步成為粵北地區(qū)的特色產(chǎn)業(yè)。

咀嚼片是一種服用方便、療效顯著的制劑形式，經(jīng)咀嚼后崩解時(shí)間大大節(jié)省，溶解度高，生物利用度也較高。但關(guān)于將石斛和粉葛復(fù)合研制咀嚼片尚未見(jiàn)報(bào)道，也未見(jiàn)關(guān)于石斛、粉葛及其食品的系統(tǒng)的體外體內(nèi)協(xié)同降糖降脂作用研究。有報(bào)道[21]表明，石斛、葛根配伍無(wú)“十九畏”和“十八反”等配伍禁忌。

試驗(yàn)擬在前人[22-24]研究的基礎(chǔ)上建立高糖、高脂果蠅模型，以海藻糖、甘油三酯、總蛋白含量為考察指標(biāo)，評(píng)價(jià)石斛與粉葛體內(nèi)的降糖降脂作用協(xié)同作用，為進(jìn)一步的機(jī)制研究提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

乙醇：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

石斛粉葛咀嚼片：實(shí)驗(yàn)室自制[25]；

α-葡萄糖苷酶(來(lái)源于黑曲霉)： S10050-1ku， 活力≥50 Units/mg Protein，上海源葉生物科技有限公司；

對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)：含量>98%，上海寶曼生物科技有限公司；

阿卡波糖：拜耳醫(yī)藥保健有限公司；

鹽酸二甲雙胍片：齊魯制藥有限公司；

甘油三酯測(cè)定試劑盒：南京建成生物工程研究所；

總蛋白定量測(cè)試盒：武漢博士德生物工程有限公司；

海藻糖測(cè)定試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；

蔗糖、瓊脂、玉米粉、酵母粉、蔗糖和棕櫚酸等：市售；

黑檀體果蠅：中山大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)與遺傳實(shí)驗(yàn)室；

普通培養(yǎng)基配方：蒸餾水1 L，酵母25.000 g，玉米粉67.050 g，大豆粉9.180 g，瓊脂粉6.000 g，蔗糖40.000 g，麥芽糖42.400 g，對(duì)羥基苯甲酸甲酯0.25 mL，無(wú)水乙醇2.50 mL，丙酸6.875 g；

高糖培養(yǎng)基配方：普通培養(yǎng)基添加20%的蔗糖；

高脂培養(yǎng)基配方：普通培養(yǎng)基添加20%的棕櫚烯酸。

1.1.2 儀器設(shè)備

全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)分析儀：SHE-3000G型，北京塞爾福知心科技有限公司；

智能光照培養(yǎng)箱：GZ-250-GII型，韶關(guān)廣智科技設(shè)備有限公司；

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：H1650R型，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；

雙人單面凈化工作：SW CJ-2G型，蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司；

體視顯微鏡：PXS-210型，梧州奧卡光學(xué)儀器有限公司。

1.2 樣品制備

1.2.1 石斛粉葛咀嚼片 以丹霞鐵皮石斛、火山粉葛為原料，以玉米淀粉、菊粉、甘露醇、木糖醇為輔料，經(jīng)配料、制軟材、濕法造粒、干燥、整粒、壓片、包裝等工序制作而成。最佳工藝配方為[25]：原料中石斛∶粉葛為1∶4，原輔料比[(石斛+粉葛)∶輔料(玉米淀粉+菊粉+木糖醇+甘露醇)]為2∶3，輔料配比(玉米淀粉∶菊粉∶木糖醇∶甘露醇)為4∶3∶1∶1，潤(rùn)濕劑60%乙醇的添加量為0.4 mL/g，硬脂酸鎂1.5%。

1.2.2 醇提液的制備 將咀嚼片粉碎，過(guò)40目篩，稱量10 g樣品按粉液比1∶20 (g/mL)，用70%乙醇在90 ℃條件下回流提取3 h。將提取液抽濾，分別旋蒸至溶液體積<100 mL，使用乙醇定容至100 mL容量瓶中，即得0.1 g/mL 咀嚼片醇提液，備用。

1.2.3 水提液的制備 稱量10 g樣品按粉液比1∶10 (g/mL)，用蒸餾水回流提取3 h。將提取液抽濾，分別旋蒸至溶液體積<100 mL，用蒸餾水定容至100 mL 容量瓶中，即得0.1 g/mL咀嚼片水提液，備用。

1.2.4 阿卡波糖溶液的制備 準(zhǔn)確稱取5 g阿卡波糖，放入燒杯中用蒸餾水溶解，定容于50 mL容量瓶備用。

1.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性

以阿卡波糖為對(duì)照。參照蔣鶯[26]的方法(PNPG法)進(jìn)行。將反應(yīng)液置于酶標(biāo)儀405 nm下測(cè)定吸光度，每個(gè)樣品同時(shí)做3個(gè)平行試驗(yàn)。酶活性抑制率按式(1)計(jì)算：

(1)

式中：

R——酶活性抑制率，%；

A空白——不加待測(cè)樣品反應(yīng)后的吸收值；

A樣品——加入待測(cè)樣品反應(yīng)后的吸收值；

A背景——只加待測(cè)樣品的吸收值。

1.4 果蠅降糖降脂試驗(yàn)

參照段寅慧[27]的方法進(jìn)行。果蠅分為正常對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和給藥組，以鹽酸二甲雙胍為陽(yáng)性對(duì)照。給藥組又分為石斛組、粉葛組、石斛粉葛組。各組配方見(jiàn)表1。

將培養(yǎng)3 d的雄性果蠅隨機(jī)分組，正常對(duì)照組喂養(yǎng)普通培養(yǎng)基，隨機(jī)挑選出的果蠅2型糖尿病模型喂養(yǎng)高糖培養(yǎng)基、高脂培養(yǎng)基7 d后，再隨機(jī)分為模型組和咀嚼片給藥組，給藥組是指在培養(yǎng)基中分別加入石斛粉葛咀嚼片、粉葛咀嚼片、石斛咀嚼片，7 d后測(cè)定蛋白質(zhì)、甘油三酯和海藻糖指標(biāo)。果蠅模型試驗(yàn)分組詳見(jiàn)表2。

表1 咀嚼片配方Table 1 Formula of chewable tablet

表2 果蠅模型試驗(yàn)分組Table 2 High glucose drosophila model experiment grouping

海藻糖、甘油三酯、總蛋白含量：按試劑盒方法進(jìn)行測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“X±S”表示，統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 22.0用于分析差異的意義，P<0.05，顯著性差異；P<0.01，極顯著性差異，每個(gè)試驗(yàn)做3個(gè)平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 石斛粉葛咀嚼片對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制能力

從圖1可知，各組對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用都呈劑量—效應(yīng)關(guān)系。石斛咀嚼片水提液、粉葛咀嚼片水提液、石斛粉葛咀嚼片水提液與阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性強(qiáng)弱順序?yàn)椋喊⒖úㄌ?石斛咀嚼片水提液>石斛粉葛咀嚼片水提液>粉葛咀嚼片水提液；石斛咀嚼片醇提液、粉葛咀嚼片醇提液、石斛粉葛咀嚼片醇提液對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性強(qiáng)弱順序?yàn)椋喊⒖úㄌ?粉葛咀嚼片>石斛粉葛咀嚼片醇提液>石斛咀嚼片醇提液。各組對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制能力都呈劑量—效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)濃度為5 mg/mL時(shí)，石斛粉葛咀嚼片水提液抑制率為28.55%，醇提液抑制率為21.60%，水提液的抑制能力略強(qiáng)于醇提液。綜上，石斛粉葛咀嚼片有一定的α-葡萄糖苷酶活性抑制作用，但弱于阿卡波糖。

多糖是鐵皮石斛最主要的化學(xué)成分，水溶性好[28]，粉葛中主要化學(xué)成分為葛根素、大豆苷元等異黃酮類化合物[29]，因此各組咀嚼片的水提液以石斛咀嚼片對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用最強(qiáng)，而鐵皮石斛乙醇提取物中成分眾多，主要含有菲類化合物、聯(lián)芐類、茐酮類、酚酸類、黃酮、生物堿、揮發(fā)油、微量元素等[30]，各組咀嚼片的醇提液以粉葛咀嚼片作用最強(qiáng)，可能是火山粉葛的醇溶性總黃酮含量高所致，有待進(jìn)一步試驗(yàn)研究。

圖1 α-葡萄糖苷酶抑制活性Figure 1 Effect of concentration of sample on inhibitory activity of α-glucosidase

協(xié)同作用分析：水提液對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性的IC50值由小到大的順序?yàn)椋菏捉榔嵋?石斛粉葛咀嚼片水提液<粉葛咀嚼片水提液，以石斛咀嚼片作用最強(qiáng)，其次是石斛粉葛咀嚼片，粉葛咀嚼片抑制作用最弱；而醇提液對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性的IC50值由小到大的順序?yàn)椋悍鄹鹁捉榔继嵋?石斛粉葛咀嚼片醇提液<石斛咀嚼片醇提液，以粉葛咀嚼片作用最強(qiáng)，其次是石斛粉葛咀嚼片，石斛咀嚼片抑制作用最弱。因此，石斛與粉葛對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性無(wú)顯著的協(xié)同作用。

2.2 石斛粉葛咀嚼片對(duì)高糖誘導(dǎo)的果蠅2型糖尿病模型糖脂代謝的影響

由表3可知，高糖模型組與正常組相比，總蛋白含量有所降低，但無(wú)顯著差別，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；甘油三酯含量升高極顯著，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；海藻糖含量升高極明顯，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。模型建立。給藥后，(石斛+粉葛)咀嚼片組與高糖模型組相比，總蛋白含量無(wú)顯著差別，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；甘油三酯含量和海藻糖含量均極明顯降低，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。因此，石斛粉葛咀嚼片有一定的降血糖作用。

2.3 石斛粉葛咀嚼片對(duì)高脂誘導(dǎo)的果蠅2型糖尿病模型糖脂代謝的影響

由表4可知，高脂模型組與正常組相比，總蛋白含量有所降低，但無(wú)顯著差別，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；甘油三酯含量升高極顯著，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；海藻糖含量升高極顯著，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，模型建立。給藥后，(石斛+粉葛)組與高脂模型組相比，總蛋白含量有所升高，但無(wú)顯著差別，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；甘油三酯含量降低極顯著，有顯著性差異(P<0.01)；海藻糖含量降低顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。因此，石斛粉葛咀嚼片有一定的降血脂作用。這源于鐵皮石斛、粉葛異黃酮化合物及葛根素都有降血糖、降血脂的作用[31-33]。

表3高糖模型組果蠅的總蛋白質(zhì)含量、甘油三酯含量、海藻糖含量?
Table 3 The total protein content,triglyceride content and trehalose content of hyperglycemia model group

組別總蛋白含量/(mg·mL-1)甘油三酯含量/(μg·mg-1)海藻糖含量/(mg·mL-1)正常組 3.62±0.210.28±0.022.44±0.03高糖模型組3.51±0.090.83±0.05??5.81±0.16??陽(yáng)性對(duì)照組3.58±0.050.32±0.04##3.21±0.09##咀嚼片組 3.51±0.060.35±0.02##3.59±0.03##

? “*”表示與空白組比較P<0.05，“**”表示與空白組比較P<0.01；“#”表示與模型組比較P<0.05，“##”表示與模型組比較P<0.01。

2.4 石斛、粉葛協(xié)同降糖降脂作用

由表5可知：高糖組、高脂組中，皆以(石斛+粉葛)組降脂作用最強(qiáng)，其次是石斛組，最弱的是粉葛組，石斛與粉葛合用效果都優(yōu)于各自單獨(dú)使用效果，因此石斛與粉葛有體內(nèi)協(xié)同降糖降脂作用。

體內(nèi)試驗(yàn)表明，石斛和粉葛具有協(xié)同輔助降糖降血脂作用。石斛與粉葛在體外降糖試驗(yàn)中未顯示協(xié)同降糖作用，但在體內(nèi)試驗(yàn)中卻顯示有協(xié)同作用。

表4高脂模型組總蛋白質(zhì)含量、甘油三酯含量、海藻糖含量?
Table 4 Total protein content,triglyceride content and trehalose content of high-fat model group

組別總蛋白含量/(mg·mL-1)甘油三酯含量/(μg·mg-1)海藻糖含量/(mg·mL-1)正常組 3.62±0.210.28±0.022.44±0.03高脂模型組3.50±0.061.57±0.09??4.12±0.13??陽(yáng)性對(duì)照組3.60±0.020.44±0.11##2.85±0.10##咀嚼片組 3.93±0.040.59±0.03##3.56±0.01#

? “*”表示與空白組比較P<0.05，“**”表示與空白組比較P<0.01；“#”表示與模型組比較P<0.05，“##”表示與模型組比較P<0.01。

表5 石斛和粉葛協(xié)同降糖降脂作用分析(給藥7 d后)Table 5 Analysis of hypoglycemic and lipid-lowering synergistic effects between Dendrobium and Pueraria thomsonii after 7 d medication

3 結(jié)論

各組咀嚼片的水提液、醇提液對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用皆呈劑量效應(yīng)關(guān)系。咀嚼片水提液以石斛咀嚼片作用最強(qiáng)，咀嚼片醇提液以粉葛咀嚼片抑制作用強(qiáng)，而水提液的抑制作用略強(qiáng)于醇提液，多糖是石斛的主要有效成分，醇溶性總黃酮是粉葛的主要有效成分，可以推測(cè)石斛體外降糖活性要強(qiáng)于火山粉葛；石斛組、粉葛組和(石斛+粉葛)組對(duì)高糖高脂誘導(dǎo)的果蠅模型的甘油三酯含量及海藻糖含量均有降低作用，但對(duì)蛋白質(zhì)含量無(wú)顯著影響，其中以(石斛+粉葛)組作用效果最佳，說(shuō)明石斛和粉葛具有體內(nèi)協(xié)同降糖降脂作用。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)石斛和粉葛體外降糖作用與體內(nèi)降糖作用不一致，與尹紅力等[34]關(guān)于黑木耳多糖報(bào)道不一致，除了原料不同以外，更重要的是體內(nèi)代謝通路可能存在一些調(diào)節(jié)因子在起作用，因此關(guān)于石斛和粉葛協(xié)同降糖降脂機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。