黃鱔醛酮還原酶的定點(diǎn)突變及對(duì)其酶活性的影響

闞延澤， 孫文秀， 李 偉

(長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,湖北 荊州 434025)

醛酮還原酶(AKR)是一類依賴NADH/NADPH作為輔酶將醛酮類物質(zhì)還原為相應(yīng)醇類物質(zhì)的氧化還原酶[1-2]。它們?cè)谏锝鐝V泛分布，植物、動(dòng)物和微生物中均有報(bào)道[3]。已知的醛酮還原酶數(shù)量眾多，包括16個(gè)家族近200個(gè)成員[4]。序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)醛酮還原酶之間具有一定的序列同源性，都具有一個(gè)典型的(α/β)8桶狀結(jié)構(gòu)[5]。其中，醛酮還原酶負(fù)責(zé)底物催化的關(guān)鍵氨基酸一般由相對(duì)保守的催化四聯(lián)體(D-Y-K-H)組成[6-7]。醛酮還原酶底物廣泛，包括醛酮類化合物、芳香類化合物、醛糖和類固醇等[3-4]。每個(gè)醛酮還原酶家族都有其特異性底物，同時(shí)在機(jī)體內(nèi)行使獨(dú)特的生物學(xué)功能，例如AKR7家族可以降解致癌羰基化合物，在生物體內(nèi)參與機(jī)體的保護(hù)和防御[8]；AKR1C亞家族具有代謝人體性激素的能力，參與人體激素代謝和調(diào)節(jié)[9-10]；醛糖還原酶(AR)通過(guò)將葡萄糖催化還原成山梨醇，同時(shí)減輕果糖和山梨醇在周圍組織細(xì)胞中的過(guò)多積累，從而達(dá)到抑制糖尿病的功能[11-12]。代海艷等[13]重組表達(dá)了黃鱔醛酮還原酶基因Eakr，發(fā)現(xiàn)含該重組基因的菌株比野生菌株抗羰基化合物脅迫的能力增強(qiáng)。除此之外，國(guó)內(nèi)外對(duì)魚(yú)類醛酮還原酶基因及功能的研究相對(duì)匱乏。僅有少數(shù)羅非魚(yú)醛酮還原酶AKR1A1羰基解毒作用的報(bào)道[14]。黃鱔醛酮還原酶Eakr的氨基酸序列與已報(bào)道的所有醛酮還原酶家族成員同源性均小于25%，且其催化四聯(lián)體氨基酸為D-Y-A-H，這與其他已知醛酮還原酶的催化四聯(lián)體存在一個(gè)氨基酸的差別。本研究擬通過(guò)將黃鱔Eakr第81位丙氨酸(A)進(jìn)行定點(diǎn)突變?yōu)橘嚢彼?K)，分析突變蛋白EakrA81K的底物譜，比較野生型(Eakr)和突變型蛋白(EakrA81K)對(duì)不同代謝底物的活性變化，為深入了解黃鱔醛酮還原酶Eakr的功能及其催化四聯(lián)體在底物識(shí)別上的作用提供重要的參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

BL21(DE3)菌株購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司。含pET-28a-Eakr的BL21(DE3)菌株，含pET-28a (+)空白質(zhì)粒的BL21(DE3)菌株，均由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存于長(zhǎng)江大學(xué)生物醫(yī)藥研究所。Ni離子親和層析柱購(gòu)于上海七海復(fù)泰生物技術(shù)有限公司。質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化有限公司。DNA凝膠回收試劑盒、PfuDNA聚合酶購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。酶反應(yīng)底物丙酮醛、苯甲醛、反式丁烯醛購(gòu)自上海阿拉丁生化技術(shù)股份有限公司。3-戊酮、2,3-戊二酮、2,4-戊二酮購(gòu)自上海麥克林生化技術(shù)有限公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 黃鱔Eakr基因A81K位點(diǎn)的定點(diǎn)突變

用快速質(zhì)粒DNA中量提取試劑盒，從含pET-28a-Eakr質(zhì)粒的BL21(DE3)菌中提取質(zhì)粒DNA。用突變引物對(duì)F1：5′-GCCGAATTCATGCCTGTGGTTCCCAAAG-3′和Rm：5′-TCTGCACAGCTGGTGCCTTATCTCCAGAGGACT-3′擴(kuò)增突變位點(diǎn)及上游片段；用突變引物對(duì)Fm：5′-AAGTCCTCTGGAGATAAGGCACCAGCTGTGCAGAG-3′和R1：5′-CCGAAGCTTTTAGCTCCTGTACTATCGC-3′擴(kuò)增突變位點(diǎn)及下游片段。引物中突變位點(diǎn)堿基用斜體標(biāo)出，酶切位點(diǎn)用下劃線標(biāo)出。將第1次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收、純化后等量混勻，利用F1和R1引物進(jìn)行重疊PCR擴(kuò)增。每次PCR擴(kuò)增均采用Tran Start Fast Pfu DNA Polymerase高保真DNA聚合酶以降低錯(cuò)義突變。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收、純化后連接T載體后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中，送上海鉑尚生物技術(shù)公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.3 表達(dá)載體構(gòu)建及重組蛋白表達(dá)及純化

提取經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證過(guò)的質(zhì)粒DNA，采用限制內(nèi)切酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ進(jìn)行雙酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳、回收后純化，并連接到同樣雙酶切的pET-28a(+)中。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)卡納霉素抗性篩選、菌落PCR驗(yàn)證及SDS-PAGE電泳檢測(cè)獲得陽(yáng)性表達(dá)菌株。

將野生型和突變型陽(yáng)性重組菌按 1∶50分別接種到200 ml 新鮮LB培養(yǎng)基，200 r/min培養(yǎng)至OD600約為0.6時(shí)，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，37 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h，將誘導(dǎo)表達(dá)完成后的菌液在4 ℃ 10 000 r/min條件下離心15 min，棄上清液，收集菌體加入PBS(pH8.5)洗滌菌體，重懸后，用超聲波破碎菌體細(xì)胞(工作5 s，間隔15 s，工作80次)；將細(xì)胞破碎液在4 ℃、10 000 r/min離心15 min，棄上清液，收集沉淀，加入適量PBS 緩沖液(pH=8.5，50 mmol/L，含6 mol/L鹽酸胍)重懸，于4 ℃中靜置1 h以上去除包涵體，再次離心，收集上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后加入鎳離子親和層析柱中結(jié)合12 h，用不同咪唑濃度(20 mmol/L，100 mmol/L，200 mmol/L，300 mmol/L)的PBS緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫液收集裝入透析袋中，密封后于4 ℃透析過(guò)夜，收集透析后進(jìn)行12%的SDS-PAGA電泳檢測(cè)。

1.4 EakrA81K酶活性檢測(cè)及底物特異性分析

利用普析通用公司TU-1900紫外分光光度計(jì)測(cè)定還原型輔酶NADPH在340 nm處吸光值的變化來(lái)評(píng)價(jià)Eakr和EakrA81K的活性。酶活性單位定義為：醛酮還原酶在最適條件下1 min消耗1 μmol的NADPH為1個(gè)酶活性單位(U)。取比色皿，依次加入1 000 μl 50.0 mmol/L PBS(pH=5.0)，50 μl酶液，850 μl底物(約10.0 mmol/L)，80 μl甲醇，37 ℃保溫10 min后，加入20 μl 0.1 mmol/LNADPH，總體系為2 ml，將比色皿放入紫外分光光度計(jì)中，測(cè)定340 nm處吸光值的變化并記錄，每個(gè)底物重復(fù)3次。酶活性計(jì)算按照Chen等[15]報(bào)道的方法進(jìn)行，米氏常數(shù)(Km)和催化常數(shù)(kcat)參照文獻(xiàn)[16]計(jì)算。

按照上述方法，分別測(cè)量Eakr和EakrA81K重組蛋白對(duì)苯甲醛、鄰苯二甲醛、甲醛、戊二醛、反式丁烯醛、甘油醛、2,3-丁二酮、丙酮、醋酸甲羥孕酮、蒽酮、黃體酮、甲睪酮、甲酸、戊酸雌二醇、2-戊酮、3-戊酮、2,3-戊二酮、2,4-戊二酮、葡萄糖等底物的酶活性。

1.5 野生型與突變型蛋白的溫度及pH耐受性分析

在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中，取等量野生型與突變型蛋白分別與甲醛(10 mmol/L)混勻后在不同溫度(10 ℃， 20 ℃，30 ℃，35 ℃，37 ℃，40 ℃，50 ℃)靜置3 min或在不同pH(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5)的PBS緩沖溶液中靜置3 min測(cè)定其相對(duì)酶活性，以其最適反應(yīng)溫度或最適pH下的相對(duì)酶活性為100%，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.6 數(shù)據(jù)處理及分析

2 結(jié)果與分析

2.1 黃鱔醛酮還原酶基因的定點(diǎn)突變

通過(guò)引物對(duì)Fm和R1及引物對(duì)F1和Rm PCR擴(kuò)增后分別得到了1條約750 bp的條帶和1條約250 bp的條帶，大小與預(yù)期相符(圖1a)；將上述PCR片段回收純化后等量混合進(jìn)行重疊PCR反應(yīng)，得到了1條特異的分子量約1 000 bp的條帶(圖1b)，證明重疊PCR已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)了上下游基因片段的融合。將上述重疊PCR片段經(jīng)過(guò)回收、純化克隆測(cè)序后得知，黃鱔Eakr基因的第81號(hào)位氨基酸對(duì)應(yīng)的堿基已經(jīng)由原來(lái)的GCT突變成了AAG，其對(duì)應(yīng)氨基酸也已由丙氨酸(A)突變成賴氨酸(K)；除此以外，測(cè)序結(jié)果表明，該突變基因沒(méi)有產(chǎn)生其他錯(cuò)義突變。

泳道1～2：擴(kuò)增的下游片段；3～4：擴(kuò)增的上游片段；5～6：擴(kuò)增的重疊片段；M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖1 重疊 PCR擴(kuò)增突變基因電泳Fig.1 Electrophoresis of the gene mutation products from SOE-PCR amplification

2.2 重組蛋白EakrA81K的純化

將含有pET-EakrA81K的重組菌株經(jīng)過(guò)0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后，表達(dá)了1條分子量約38 000的蛋白，這表明陽(yáng)性重組子成功實(shí)現(xiàn)了融合表達(dá)；EakrA81K蛋白約占大腸桿菌總蛋白的40%以上，通過(guò)Ni離子親和層析，實(shí)現(xiàn)了突變體蛋白EakrA81K的純化(圖2)。

1：空白質(zhì)粒菌株；2：誘導(dǎo)前的含pET-28-EakrA81K菌株；3：誘導(dǎo)后的含pET-28-EakrA81K菌株；4：20 mmol咪唑洗脫后蛋白；5：100 mmol咪唑洗脫蛋白；6：200 mmol咪唑洗脫蛋白；M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖2 重組EakrA81K蛋白的SDS-PAGE電泳Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis of EakrA81K protein

2.3 重組蛋白EakrA81K的底物特異性及酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)

以NADPH為輔酶，檢測(cè)重組蛋白EakrA81K對(duì)醛、酮類物質(zhì)的還原活性。結(jié)果表明：該重組蛋白對(duì)所測(cè)醛類物質(zhì)及中長(zhǎng)鏈酮類物質(zhì)具有良好的還原活性,但對(duì)醇、糖、酸類物質(zhì)酶活性極低或未檢測(cè)到(表1)。其中，對(duì)3-戊酮活性最高，其酶比活力約0.882 U/mg。在所測(cè)底物中，重組蛋白EakrA81K與醛類物質(zhì)的米氏常數(shù)(Km)均低于酮類物質(zhì)，說(shuō)明該酶和醛類物質(zhì)的親和力更高。甲醛的米氏常數(shù)最低(2.957 mmol/L)，說(shuō)明所測(cè)底物中甲醛和EakrA81K結(jié)合效率最高。同時(shí)，隨著底物碳原子數(shù)目的增加，底物的米氏常數(shù)值也隨之升高，結(jié)合效率降低(表1)。

表1 EakrA81K底物譜及酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)

“-”表示未檢測(cè)到活性。

2.4 A81K定點(diǎn)突變對(duì)酶活性的影響

表2表明，野生型黃鱔醛酮還原酶Eakr最適底物為2,3-丁二酮。Eakr對(duì)2-戊酮的還原活性僅為對(duì)2,3-丁二酮活性的4.6%，而對(duì)2,4-戊二酮的酶活性僅為對(duì)2,3-丁二酮酶活性的5.6%。但是，野生型蛋白對(duì)含有3-位酮基團(tuán)的3-戊酮和2,3-戊二酮的酶活性較高，分別為對(duì)2,3-丁二酮酶活性的73.0%和84.5%。由此可知，Eakr在底物選擇上更傾向于3-位酮基，當(dāng)?shù)孜锝Y(jié)構(gòu)中存在與3-位酮基相鄰的2-位酮基時(shí)還原活性更好。相比突變前，突變型重組蛋白EakrA81K對(duì)甲醛、2-戊酮、甘油醛、2,4-戊二酮和戊二醛等底物的活性顯著升高(表2)。突變型蛋白EakrA81K最適底物為3-戊酮 (Km=12.257)，對(duì)2-戊酮(Km=9.136)的還原活性為對(duì)3-戊酮活性的66.7%。分析其米氏常數(shù)，顯然突變型蛋白對(duì)2-戊酮的親和力更高(表1)。

表2 野生型Eakr和突變型蛋白EakrA81K的酶比活力

P<0.01時(shí)表示差異極顯著，P<0.05時(shí)表示差異顯著。

2.5 溫度和pH對(duì)Eakr以及EakrA81K蛋白的影響

使用甲醛作為底物，研究了pH和溫度對(duì)Eakr以及EakrA81K蛋白酶活性的影響。結(jié)果表明，在pH為4時(shí)野生型蛋白Eakr活性最高，pH為4.5時(shí)其依然保持70%左右的酶活性，當(dāng)pH繼續(xù)升高后Eakr的活性急劇下降。相似地，突變型蛋白EakrA81K在pH 4.5～5.5時(shí)保持70%以上的酶活性，在此pH范圍之外，對(duì)甲醛的還原活性急劇下降(圖3)。由此看出，A81K位點(diǎn)突變稍降低了黃鱔醛酮還原酶的酸度耐受能力。

圖3 不同pH條件下野生型Eakr及突變型蛋白EakrA81K的相對(duì)酶活性Fig.3 The relative activity of Eakr and EakrA81K in different pH condition

同樣地，溫度對(duì)野生型Eakr及突變型蛋白EakrA81K具有相似的影響。Eakr在35 ℃活性最高，在 30～40 ℃可保持50%以上的酶活性；EakrA81K最適反應(yīng)溫度為37 ℃，在溫度 35～40 ℃時(shí)保持80%以上的酶活性(圖4)。從相對(duì)酶活性上分析，突變型蛋白比野生型蛋白的溫度耐受性略高。

圖4 不同溫度下野生型Eakr及突變型蛋白EakrA81K的相對(duì)酶活性Fig.4 The relative activity of Eakr and EakrA81K under different temperature

3 討 論

本研究通過(guò)重疊PCR技術(shù)將黃鱔醛酮還原酶Eakr催化四聯(lián)體中81位氨基酸丙氨酸(A)突變?yōu)橘嚢彼?K)后，實(shí)現(xiàn)了突變蛋白EakrA81K的重組表達(dá)及純化。根據(jù)已知的醛酮還原酶底物譜，分析了突變型蛋白底物特異性。結(jié)果表明，突變型蛋白EakrA81K對(duì)醛類物質(zhì)以及中長(zhǎng)鏈酮類物質(zhì)具有較高的還原活性；野生型醛酮還原酶Eakr及突變型EakrA81K蛋白均沒(méi)有檢測(cè)到對(duì)醇、糖、酸類物質(zhì)的還原活性，這表明黃鱔醛酮還原酶可能不屬于醛糖還原酶或醛醇還原酶家族的成員。突變型蛋白EakrA81K與醛類物質(zhì)親和力較好，但隨著底物碳原子數(shù)目的增加，酶與底物親和力下降，這可能是碳原子數(shù)目增加導(dǎo)致底物與酶難以靠近造成的。Wang等[17]對(duì)人的醛酮還原酶LEK底物譜的研究也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，隨底物的碳原子數(shù)量增多，LEK與底物親和力降低，還原活性下降。A81K位點(diǎn)突變導(dǎo)致酶對(duì)大部分底物的活性顯著提升，這可能是因?yàn)橘嚢彼?K)是一種具有較長(zhǎng)側(cè)鏈的堿性氨基酸，它可以通過(guò)與底物形成氫鍵等方式幫助底物與酶分子結(jié)合進(jìn)入活性中心完成還原反應(yīng)。野生型Eakr蛋白在還原中長(zhǎng)鏈酮類時(shí)選擇3-位酮基作為催化位點(diǎn)，而2-位酮基的存在對(duì)底物與酶的結(jié)合起到促進(jìn)作用。類似試驗(yàn)結(jié)果也在氧化葡萄糖酸桿菌的醛酮還原酶AKR5C3的研究中報(bào)道過(guò)[18]。突變型蛋白EakrA81K對(duì)含3-位酮基的化合物表現(xiàn)良好的還原活性，且對(duì)含2-位酮基的底物還原活性大大增強(qiáng)。但當(dāng)?shù)孜?,3-位同時(shí)存在酮基時(shí)，EakrA81K對(duì)其還原活性顯著下降。推測(cè)，底物2-位酮基的存在對(duì)3-位酮基的還原產(chǎn)生了非競(jìng)爭(zhēng)性抑制是導(dǎo)致該酶對(duì)此類二酮類底物酶活性降低的主要原因。以上結(jié)果表明黃鱔醛酮還原酶Eakr第81位氨基酸在底物識(shí)別上具有重要作用。該研究為深入了解魚(yú)類醛酮還原酶的生物學(xué)功能提供了方向和基礎(chǔ)資料，同時(shí)為研究Eakr底物結(jié)合位點(diǎn)，拓寬底物譜以及酶改造提供了重要參考資料。

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