GA3與CPPU對葡萄果銹相關(guān)物質(zhì)合成及基因表達(dá)的影響

馮 嬌， 侯旭東， 董禮花， 陶建敏

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇 南京 210095； 2.灌南縣蔬菜辦公室，江蘇 灌南 223500)

陽光玫瑰(VitislabruscanaBailey×V.viniferaL . Shine Muscat)是二倍體鮮食葡萄品種[1]，引自于日本，因其果粒較大，且品質(zhì)優(yōu)良，受到大量葡萄生產(chǎn)者和消費者的歡迎。但中國大多數(shù)地區(qū)栽培的陽光玫瑰成熟時漿果表面卻出現(xiàn)微小的紅褐色斑點，稱為果銹，影響果面光潔度，降低了葡萄的市場價值，嚴(yán)重影響經(jīng)濟(jì)效益。果銹是一層褐色的木栓化次生保護(hù)組織，形狀為條狀或不規(guī)則銹斑，主要在果皮表面發(fā)生[2-4]。砂梨和蘋果上的果銹是由生長應(yīng)力和外在因素導(dǎo)致微觀裂隙，隨后通過外表皮細(xì)胞的細(xì)胞壁內(nèi)側(cè)木栓質(zhì)的積累形成高塑性的外周膜引起的果皮生理性紊亂[5]。

果銹是果實成熟期的一種生理紊亂現(xiàn)象?；ㄆ诙嘤?、低溫、高濕、植株營養(yǎng)失調(diào)、病蟲害、用藥不當(dāng)、機(jī)械損傷、果園通風(fēng)不良等都是誘發(fā)果銹生成的外界環(huán)境因素[6]。Suehiro[7]等推測白藜蘆醇等酚類化合物、PPO等多酚氧化酶基因與葡萄果銹生成相關(guān)；研究結(jié)果表明，咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因(COMT)和肉桂酸-4-羥化酶(C4H酶)基因等木栓質(zhì)合成基因的表達(dá)加強(qiáng)，外表皮細(xì)胞的細(xì)胞壁內(nèi)側(cè)木栓質(zhì)的積累，形成果銹[8-10]。從果銹的形成途徑來看，果銹的重要組分木栓層的形成與木質(zhì)素合成有關(guān)[5,11]，木質(zhì)素的合成，促進(jìn)木栓形成層出現(xiàn)，從而在一定程度上促進(jìn)銹斑的形成[12]。

GA3(赤霉素)和CPPU(氯吡脲)作為植物生長調(diào)節(jié)劑在葡萄的生產(chǎn)栽培中已有廣泛應(yīng)用。GA3和CPPU的使用顯著抑制果銹的生成，提高葡萄的果實品質(zhì)[13-14]。目前已有研究結(jié)果表明，外源GA3可防止蘋果果銹形成[15]，適當(dāng)濃度的外源綠原酸處理可顯著降低金冠蘋果果銹指數(shù)[16]，套袋也可以在一定程度上控制蘋果、梨、葡萄果實表面果銹的生成，降低果銹發(fā)生程度，提高果面光潔度[17]。馮嬌等從轉(zhuǎn)錄組測序角度，初步探究了GA3和CPPU抑制葡萄果銹生成的機(jī)理[3]，本研究結(jié)合之前的測序結(jié)果以及相關(guān)文獻(xiàn)，同樣以GA3和不同濃度的CPPU組合處理陽光玫瑰葡萄果穗，通過體視顯微鏡觀察同一成熟時期不同處理的葡萄果皮特征，從果銹生成相關(guān)酚類物質(zhì)和木質(zhì)素含量等生理方面及相關(guān)基因表達(dá)等角度闡述GA3和CPPU對果銹生成的影響，探究該品種的防銹技術(shù)，旨在為新型品種陽光玫瑰的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)栽培提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗于2016年 5-10月在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)湯山葡萄實驗基地進(jìn)行。供試品種為7年生陽光玫瑰葡萄，采用平棚架避雨栽培，株行距為 3.0 m×6.0 m，“H”型樹形，土、肥、水管理及病蟲害防治同常規(guī)。

1.2 方法

1.2.1 田間處理與樣品采集 選取樹體生長勢基本一致的陽光玫瑰葡萄樹，處理前將花穗修剪至距離穗尖約6 cm的位置。于花后2周分別用25 mg/L GA3(處理Ⅰ)，25 mg/L GA3+5 mg/L CPPU(處理Ⅱ)，25 mg/L GA3+10 mg/L CPPU(處理Ⅲ)，25 mg/L GA3+15 mg/L CPPU(處理Ⅳ)浸蘸花穗 5～10 s。處理前集中疏果，每穗大小及遮陰情況保持一致?！癏”型樹形的每一個主蔓作為一個處理，4個處理隨機(jī)分布于6棵樹，每個處理3個主蔓，余下主蔓用清水處理作為對照(CK)。

果實進(jìn)入轉(zhuǎn)色期(7月31日)開始，每隔7 d取1次樣品，從每個處理果穗的上、中、下部隨機(jī)取50粒大小均勻、成熟度一致的果實，用冰袋帶回實驗室，剝離果皮，液氮速凍，-70 ℃冷凍保存，用于熒光定量PCR試驗；待果實完全成熟時(9月18日)，采集5個處理的葡萄果實，通過體視顯微鏡觀察果銹發(fā)生情況，取果皮置于-70 ℃冰箱中保存，用于測定白藜蘆醇、香豆酸、丁香酸等酚類物質(zhì)及木質(zhì)素含量等。

1.2.2 試劑與儀器 赤霉酸(上海同瑞生物科技有限公司產(chǎn)品)，CPPU(四川省蘭月科技有限公司產(chǎn)品)，Na2CO3、冰乙酸、溴乙酰、高氯酸、Folin-Ciocalteu試劑、甲醇分析純、乙酸乙酯、鹽酸、抗壞血酸、甲醇(色譜純)、乙醇、沒食子酸、香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、兒茶素、丁香酸和白藜蘆醇標(biāo)品均購自上海源葉生物公司，體視顯微鏡(LEICA S8AP0)，酶標(biāo)儀(德國TECAN公司產(chǎn)品)，SB-5200DT超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品)，超高效液相色譜儀(美國Waters公司產(chǎn)品)等。

1.2.3 果銹指數(shù)統(tǒng)計 參照張勃等[12]的方法，從7月31日起，對CK和各處理果實分別進(jìn)行分級和銹斑率統(tǒng)計。根據(jù)果銹程度將果實分級：無銹果為0級，果銹面積﹤5%為1級，果銹面積 6%～15%為2級，果銹面積 16%～25%為3級，果銹面積>25%為4級。

果銹指數(shù)=(0級×a+1級×b+2級×c+3級×d+4級×e)×100/(4級×n)。其中a、b、c、d、e分別為0～4級果的統(tǒng)計數(shù)，n為樣本總數(shù)。

1.2.4 體視顯微鏡觀察 利用體視顯微鏡(放大25倍)觀察同一成熟時期(9月18日)CK和4種不同處理陽光玫瑰葡萄果實的果皮特征，并拍照記錄果皮果銹的發(fā)生情況。

1.2.5 單體酚類物質(zhì)含量測定 采用反相高效液相色譜法測定陽光玫瑰葡萄果皮中單體酚類物質(zhì)的含量。分別取3 g同一成熟時期(9月18日)CK和不同處理的陽光玫瑰葡萄果皮，研磨后溶于25 ml 100%甲醇中，加入80 mg抗壞血酸(溶于15ml純水中)，再加入10 ml 6 mol/L鹽酸，將所有溶液置于100 ml錐形瓶中，超聲波降解處理2 min，充氮氣排出錐形瓶內(nèi)的空氣，密封后置于35 ℃ 提取16 h后，12 000 r/min、4 ℃ 離心20 min，吸取上清液，40 ℃ 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲醇，用30 ml乙酸乙酯溶解后先萃取1次，之后再用20 ml乙酸乙酯萃取2次，合并所有萃取液，在40 ℃ 條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干再溶于5 ml 50%甲醇(色譜純)中，置于-70 ℃ 條件下避光保存。將經(jīng)過處理的果皮樣品在確定的色譜條件下進(jìn)樣，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。

1.2.6 白藜蘆醇含量測定 采用高效液相色譜法測定陽光玫瑰葡萄果皮中白藜蘆醇含量。分別稱取1 g同一成熟時期(9月18日)的CK和不同處理的果皮樣品，研磨后迅速與25 ml 80%的乙醇混勻，在60 ℃ 水浴鍋中水浴30 min，4 ℃ 8 000 r/min離心15 min，吸取上清液。在液氮中速凍至固態(tài)后，放入冷凍干燥器中凍干至粉末狀態(tài)(避光)，溶解在2 ml 50%的乙醇中，轉(zhuǎn)移至2 ml離心管中，離心后吸取上清液，儲存于-70 ℃ 備用。上樣前用1.0 ml注射器吸取處理好的樣品通過0.2 μm的有機(jī)系濾膜過濾，使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。

1.2.7 總酚含量測定 總酚含量的測定采用Folin-Ciocalteu試劑法。分別取同一成熟時期(9月18日)CK和不同處理的果皮經(jīng)液氮研磨后，準(zhǔn)確稱取2 g于50 ml錐形瓶中，加入10 ml甲醇(分析純，含2% HCl)，在室溫、黑暗條件下提取24 h，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，吸出上清液。吸取200 μl上清液于5.0 ml的離心管中，加入1.0 ml的Folin-Ciocalteu試劑，0.8 ml 7.5%的Na2CO3溶液，緩慢攪拌反應(yīng)30 min后，用酶標(biāo)儀在765 nm處比色測定吸光度OD值。沒食子酸作標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.8 木質(zhì)素含量測定 樣品制備：將同一成熟時期(9月18日)CK和不同處理的陽光玫瑰葡萄果皮用剪刀剪碎，然后將樣品絕對烘干，研成粉末，用電子天平準(zhǔn)確稱取果皮0.02 g各3份。將制備好的樣品粉末放入5 ml試管中，加入25%的溴乙酰-乙酸溶液(質(zhì)量比)2.00 ml和高氯酸0.08 ml，將管口密封，于70 ℃ 恒溫水浴30 min，每隔10 min振蕩試管。取四分之一的反應(yīng)液，移入已裝有1.0 ml 2 mol/L NaOH和2.5 ml冰乙酸混合液的容量瓶內(nèi)，振蕩充分混勻并用冰乙酸定容至10.0 ml。以冰乙酸為空白溶液，用酶標(biāo)儀對樣品溶液在波長260 nm處進(jìn)行掃描測定吸光度。

參照Hatfield等[18]的方法，Lignin=Abs×liters×100%/Wsample，Lignin為木質(zhì)素含量，Abs為樣品溶液木質(zhì)素吸光度，Liters為樣品溶液定容體積(ml)，Wsample為樣品干質(zhì)量(g)。

1.2.9 實時熒光定量PCR 用RNA試劑盒(Foregene)提取果皮總RNA，以總RNA為模板利用Takara Prime ScriptTMRT-PCR試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并將合成后的cDNA用無菌ddH2O(雙蒸水)稀釋，濃度稀釋至150 μg/μl。實時熒光定量PCR以VvUbiquitin為內(nèi)參基因(表1)。實時熒光定量PCR 20 μl反應(yīng)體系為：Takara SYBR PremixExTaq(TaKaRa)10.0 μl，上游引物和下游引物各0.4 μl，稀釋10倍的cDNA 1.0 μl和8.2 μl去離子水。反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s，40個循環(huán)。每個樣品做3次平行反應(yīng)，運(yùn)用ABI7300軟件和2-△△Ct的方法計算相對表達(dá)量。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計分析

所有測定重復(fù)3次，數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007和SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 陽光玫瑰不同處理間果銹指數(shù)的比較

從7月31日開始，統(tǒng)計不同處理果面的果銹情況，并計算果銹指數(shù)。7月31日至8月14日CK和不同處理果面都沒有果銹發(fā)生。從8月16日起，極少數(shù)CK果面開始出現(xiàn)少量銹斑，隨著葡萄果實成熟，出現(xiàn)果銹的葡萄變多，銹斑面積增大，果銹指數(shù)急劇增長，直至9月中旬CK的果銹指數(shù)趨于穩(wěn)定。處理Ⅰ自8月25日起果面出現(xiàn)少量銹斑，伴隨成熟，果銹指數(shù)呈上升趨勢。處理Ⅱ自8月31日起少量果實果面出現(xiàn)極少銹斑，不同于CK和處理Ⅰ，處理Ⅱ的葡萄果實銹斑面積小，出現(xiàn)果銹的葡萄少，果銹指數(shù)上升趨勢相對小。處理Ⅲ和處理Ⅳ的陽光玫瑰直至9月中旬開始成熟時才有極少量果實果面出現(xiàn)果銹，果銹指數(shù)很低，幾乎可以忽略不計(圖1)。

CK：對照；處理Ⅰ：25 mg/L GA3；處理Ⅱ：25 mg/L GA3+5 mg/L CPPU；處理Ⅲ：25 mg/L GA3+10 mg/L CPPU；處理Ⅳ：25 mg/L GA3+15 mg/L CPPU。圖1 陽光玫瑰不同處理間果銹指數(shù)變化動態(tài)Fig.1 The dynamic change of fruit russet index of Shine Muscat under different treatments

2.2 同一成熟時期不同處理陽光玫瑰葡萄果皮特征差異

圖2顯示，同一成熟時期不同處理的陽光玫瑰果皮表面存在顯著差異。CK、處理Ⅰ和處理Ⅱ的葡萄果皮均有果銹出現(xiàn)，且果銹依次減少，處理Ⅲ和處理Ⅳ的葡萄果皮幾乎看不到果銹。從果皮顏色來看，CK、處理Ⅰ、處理Ⅱ、處理Ⅲ和處理Ⅳ的葡萄果皮顏色從黃色逐漸到黃綠色。

CK、處理Ⅰ、處理Ⅱ、處理Ⅲ、處理Ⅳ見圖1注。圖2 同一成熟時期不同處理陽光玫瑰葡萄在體視顯微鏡下果皮特征差異Fig.2 Differences in peel characteristics of Shine Muscat grapes with different treatments at the same maturity stage under stereomicroscope

2.3 GA3與不同濃度的CPPU處理對陽光玫瑰葡萄果銹相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖3可知，陽光玫瑰葡萄果實發(fā)育過程中，從8月21日開始，對照果實PAL基因的表達(dá)水平急劇上升，此時CK果實表面開始出現(xiàn)果銹，在果實成熟時PAL基因的表達(dá)達(dá)到最大峰值，之后由于過于成熟，表達(dá)水平相對下降；處理Ⅰ和處理ⅡPAL基因在8月28日表達(dá)水平急劇上升，此時處理Ⅰ果實表面已出現(xiàn)銹斑，處理Ⅱ果實表面開始出現(xiàn)銹斑，且與CK果實相比，處于同一成熟時期時，與對照相比，PAL基因表達(dá)量相對降低；處理Ⅲ和處理Ⅳ在果實成熟過程中，基因表達(dá)水平呈緩慢上升趨勢，至果實成熟時表達(dá)量變化幅度不大，這與成熟時期處理Ⅲ和處理Ⅳ葡萄果實表面也未出現(xiàn)果銹有關(guān)。

圖4顯示，陽光玫瑰葡萄果實成熟過程中，白藜蘆醇合成酶(RS)基因的表達(dá)量緩慢上升，CK果實成熟期表達(dá)水平最高。與對照相比，處理Ⅰ的葡萄果實RS基因的表達(dá)水平相對降低，在8月14日、8月28日和9月4日之間差異顯著，其余時期差異不顯著；相比于對照，處理Ⅱ表達(dá)水平下降，差異顯著；相比于對照，處理Ⅲ和處理Ⅳ表達(dá)水平大幅下降，差異極顯著。表明，RS基因的表達(dá)趨勢與果實成熟進(jìn)程相一致。

CK、處理Ⅰ、處理Ⅱ、處理Ⅲ、處理Ⅳ見圖1注。圖3 果實成熟過程中PAL基因的表達(dá)水平變化Fig.3 Changes of expression level of PAL gene during fruit maturation

2.4 同一成熟時期不同處理陽光玫瑰葡萄果皮單體酚類物質(zhì)含量差異

反相超高效液相色譜結(jié)果(表2)顯示，香豆酸、丁香酸和阿魏酸整體含量較高，變化幅度相對較大；沒食子酸、兒茶素含量偏低，咖啡酸含量最低。隨著CPPU處理濃度增大，香豆酸、咖啡酸、丁香酸含量呈下降趨勢，阿魏酸含量先降后升。CK兒茶素含量最低，處理Ⅰ和處理Ⅱ的兒茶素含量上升，處理Ⅲ和處理Ⅳ果皮兒茶素含量相對降低，但仍高于CK。CK和處理Ⅰ沒食子酸含量無顯著差異，與處理Ⅱ、處理Ⅲ和處理Ⅳ含量差異顯著，呈先增大后降低的趨勢。6種單體酚的標(biāo)樣色譜圖及經(jīng)5種不同處理后葡萄果皮中6種單體酚含量的色譜圖如圖5。

CK、處理Ⅰ、處理Ⅱ、處理Ⅲ、處理Ⅳ見圖1注。圖4 果實成熟過程中RS基因的表達(dá)水平變化Fig.4 Changes of expression level of RS gene during fruit maturation

表2 UPLC測得的陽光玫瑰葡萄果皮單體酚類物質(zhì)含量

CK、處理Ⅰ、處理Ⅱ、處理Ⅲ、處理Ⅳ見圖1注。

CK、處理Ⅰ、處理Ⅱ、處理Ⅲ、處理Ⅳ見圖1注。1:沒食子酸;2:香豆酸;3:兒茶素;4:咖啡酸;5:丁香酸;6:阿魏酸。圖5 標(biāo)樣及不同處理色譜圖Fig.5 Chromatogram of different treatment and standard sample

2.5 同一成熟時期不同處理陽光玫瑰葡萄果皮白藜蘆醇含量差異

超高效液相色譜結(jié)果(圖6)顯示，同一成熟時期，與CK相比，經(jīng)GA3+CPPU處理的陽光玫瑰葡萄果皮中白藜蘆醇含量降低，處理濃度越大，含量越低，且差異顯著。處理Ⅲ和處理Ⅳ之間差異不顯著，這與不同處理同一成熟時期成熟度不同有關(guān)，成熟度越高，白藜蘆醇含量越高。

CK、處理Ⅰ、處理Ⅱ、處理Ⅲ、處理Ⅳ見圖1注。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖6 UPLC測得的不同處理陽光玫瑰葡萄果皮白藜蘆醇含量的差異Fig.6 Difference of resveratrol conent in different treatments of the peel of Shine Muscat grapes by UPLC

2.6 同一成熟時期不同處理陽光玫瑰葡萄果皮總酚含量差異

由圖7可知，同一成熟時期，經(jīng)過GA3+CPPU處理后的陽光玫瑰葡萄果皮總酚含量下降，與CK相比，處理Ⅰ差異不顯著，處理Ⅱ、處理Ⅲ和處理Ⅳ差異顯著；處理Ⅰ、處理Ⅱ和處理Ⅲ之間無顯著差異，處理Ⅲ和處理Ⅳ之間無顯著差異。以上結(jié)果表明，GA3+CPPU抑制陽光玫瑰葡萄果皮中總酚的合成，抑制作用與處理濃度成正相關(guān)。

CK、處理Ⅰ、處理Ⅱ、處理Ⅲ、處理Ⅳ見圖1注。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖7 同一成熟時期不同處理陽光玫瑰葡萄果皮總酚含量差異Fig.7 Difference of total phenolic content in different treatments of the peel of Shine Muscat grapes at the same maturity stage

2.7 同一成熟時期不同處理陽光玫瑰葡萄果皮木質(zhì)素含量差異

由圖8可知，同一成熟時期，經(jīng)GA3+CPPU處理后的陽光玫瑰葡萄果皮木質(zhì)素含量降低。與CK相比，處理Ⅰ無顯著差異，處理Ⅱ、處理Ⅲ和處理Ⅳ差異顯著；處理Ⅲ和處理Ⅳ之間無顯著差異。結(jié)果表明，GA3+CPPU抑制陽光玫瑰葡萄果皮中木質(zhì)素的合成，濃度增大，抑制作用越顯著,CPPU濃度達(dá)到10 mg/L和15 mg/L時，抑制作用不再增強(qiáng)。

CK、處理Ⅰ、處理Ⅱ、處理Ⅲ、處理Ⅳ見圖1注。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖8 同一成熟時期不同處理陽光玫瑰葡萄果皮木質(zhì)素含量差異Fig.8 Difference of lignin content in different treatments of the peel of Shine Muscat grapes at the same maturity stage

3 討 論

從果銹的發(fā)生結(jié)果來看，葡萄果實達(dá)到一定成熟度時才會出現(xiàn)銹斑，未處理的陽光玫瑰果銹更明顯，可能與其成熟度更高有關(guān)。這與前人在CPPU推遲脫落酸合成高峰且使其峰值變小上的研究結(jié)果相一致[19]。推測CPPU推遲了果實的成熟期，促進(jìn)IAA 合成，IAA可能抑制果銹生成[11,20]，因而果銹減少，具體機(jī)理尚待研究。

GA3搭配不同濃度的CPPU處理陽光玫瑰葡萄果穗，伴隨處理濃度增大成熟期依次推遲，成熟時同一時期CK成熟度最高；與對照相比，處理濃度依次增大，白藜蘆醇含量和總酚含量依次降低，這與孫建平[21]的研究結(jié)果一致，高成熟階段的葡萄果實酚類物質(zhì)生物活性高于低成熟階段的葡萄果實。香豆酸、丁香酸和阿魏酸3種酚酸類物質(zhì)變化幅度較大，隨著CPPU濃度增大而下降，與總酚含量變化趨勢存在伴隨性?？Х人帷]食子酸和兒茶素含量變化幅度相對較小，CPPU處理濃度增大，咖啡酸含量降低；CK果皮的兒茶素含量最低，處理Ⅰ和處理Ⅱ的果皮兒茶素含量上升，處理Ⅲ和處理Ⅳ的果皮兒茶素含量相對降低，但仍高于CK；與兒茶素類似，隨處理濃度增大，沒食子酸含量呈先升高后降低的趨勢。這可能是由于CK果皮中一部分兒茶素和沒食子酸最終轉(zhuǎn)化為木質(zhì)素，促進(jìn)木栓形成層出現(xiàn)，進(jìn)而在一定程度上促進(jìn)果銹形成，果銹指數(shù)升高。

苯丙烷類代謝途徑是植物次生物質(zhì)代謝中的重要途徑，與酚酸、類黃酮和白藜蘆醇等酚類物質(zhì)及木質(zhì)素等許多次生代謝物的合成有關(guān)[12]。在蘋果和梨上的研究結(jié)果表明，苯丙烷代謝的次級產(chǎn)物代謝途徑參與了果銹形成過程[22]。苯丙烷代謝途徑中，苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶(PAL)的催化下轉(zhuǎn)化為肉桂酸，肉桂酸羥化酶(C4H)催化肉桂酸轉(zhuǎn)化為香豆酸，香豆酸在4-香豆酸-CoA連接酶(4CL)的催化下活化為4-香豆酰-CoA，結(jié)合乙酰-CoA在白藜蘆醇合成酶(RS)的催化下合成白藜蘆醇；香豆酸在酶的催化作用下，經(jīng)咖啡酸、阿魏酸和芥子酸等中間產(chǎn)物，生成香豆醇、松柏醇和芥子醇，依次聚合形成3種木質(zhì)素單體，最終聚合成苯丙烷合成途徑的終產(chǎn)物——木質(zhì)素[23-24]。木質(zhì)素是木栓層形成，果實木質(zhì)化的標(biāo)志[25]。果銹是一層木栓化次生保護(hù)組織[2]，酚類物質(zhì)、木質(zhì)素的含量變化與果銹生成密切相關(guān)。

PAL是苯丙烷代謝途徑的起始限速酶，它的轉(zhuǎn)錄水平直接影響酚類物質(zhì)和木質(zhì)素的合成水平[26]。RS是二苯乙烯合酶(STS)中的一類，是白藜蘆醇等芪類化合物合成途徑中特有的酶[27]。在果實成熟過程中，PAL基因表達(dá)水平總體呈上升趨勢，果實成熟后有所下降，RS基因表達(dá)水平持續(xù)上調(diào)，與果實成熟進(jìn)程相一致。果實成熟時期，CK果實成熟度最高，PAL和RS基因表達(dá)量呈最大值，對應(yīng)于CK果實成熟時期總酚、香豆酸等單體酚、白藜蘆醇等酚類物質(zhì)和木質(zhì)素含量最高。與CK相比，果實成熟時期，處理Ⅰ、處理Ⅱ、處理Ⅲ和處理Ⅳ的基因表達(dá)水平總體依次呈顯著下降的趨勢，對應(yīng)于同一成熟時期處理Ⅰ、處理Ⅱ、處理Ⅲ和處理Ⅳ的果實總酚等酚類物質(zhì)和木質(zhì)素含量依次下降。同時，各處理葡萄果皮PAL基因的轉(zhuǎn)錄水平變化趨勢與其表面果銹的出現(xiàn)時間順序相一致。以上結(jié)果表明，PAL和RS基因與葡萄果銹出現(xiàn)在一定程度上具有相關(guān)性。

從生理生化角度分析，同一成熟時期，CK葡萄果皮酚類物質(zhì)含量最多，木質(zhì)素合成最多，促進(jìn)木栓形成層出現(xiàn)，從而在一定程度上促進(jìn)果面銹斑形成[28]；處理Ⅰ和處理Ⅱ的陽光玫瑰葡萄果皮酚類物質(zhì)和木質(zhì)素含量依次減少，在一定程度上抑制木栓形成層的發(fā)生，但果皮表面仍有不同程度的銹斑生成，CPPU濃度加大，果銹顯著減少；處理Ⅲ和處理Ⅳ的葡萄酚類物質(zhì)和木質(zhì)素含量很低，木栓層活動弱，果實果面幾乎無銹斑。綜上所述，同一成熟時期，GA3+CPPU處理顯著降低葡萄果皮中白藜蘆醇、香豆酸等酚類物質(zhì)含量和木質(zhì)素含量，木栓層活動受到抑制，一定程度上抑制果銹生成，CPPU濃度為10 mg/L和15 mg/L時，果面幾乎無銹斑。

本試驗結(jié)果表明，GA3與不同濃度的CPPU組合處理陽光玫瑰果穗，能顯著減少果皮表面銹斑生成。然而在果皮表面果銹顯著減少的前提下，與5 mg/L CPPU相比，10 mg/L CPPU和15 mg/L CPPU處理后的葡萄果實成熟期推遲，成熟時風(fēng)味下降，果實硬度提高，容易出現(xiàn)僵果，商品性顯著下降。因此總體來說，使用25 mg/L GA3+5 mg/L CPPU處理的陽光玫瑰葡萄果面潔凈，銹斑較少，成熟期適中，顯著提高商品價值。因此，GA3與CPPU組合浸蘸果穗是生產(chǎn)上解決陽光玫瑰葡萄果銹問題的有效方法，推薦使用25 mg/L GA3+5 mg/L CPPU的處理。

參考文獻(xiàn)：

[1] YAMADA M, YAMANE A, SATO N, et al. New grape cultivar ‘Shine Muscat’[J]. Bulletin of the National Institute of Fruit Tree Science, 2008,7：21-38.

[2] OGORO A, ONO T, KAGAMI H, et al. Skin-browning occurred on berries of ‘Suihou’ grape[J]. Bull Okayama Agri Exp Sta, 2007, 25:5-10.

[3] 馮 嬌,王 武,侯旭東,等. 基于轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)探究GA3和CPPU抑制葡萄果銹產(chǎn)生的機(jī)理[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報,2017,33(4):895-903.

[4] 聶繼云,重雅鳳,馬智勇,等. 金冠蘋果果銹的發(fā)生原因及防治[J].北方果樹,2001(3):3-4.

[5] WANG Y Z, DAI M S, CAI D Y, et al. A review for the molecular research of russet/semi-russet of sand pear exocarp and their genetic characters [J]. Scientia Horticulturae, 2016，210：138-142.

[6] 吳 江,程建徽,張月華,等. 黃綠色葡萄品種果皮銹斑問題及防治措施[J]. 中外葡萄與葡萄酒,2006(6):41-42.

[7] SUEHIRO Y, MOCHIDA K, ITAMURA H, et al. Skin browning and expression ofPPO,STS, andCHSgenes in the grape berries of ‘Shine Muscat’[J]. Journal-Japanese Society for Horticultural Science, 2014, 83(2)：122-132.

[8] LEGAY S, GUERRIERO G, DELERUELLE A, et al. Apple russeting as seen through the RNA-Seq lens：strong alterations in the exocarp cell wall [J]. Plant Mol Biol, 2015, 88(1/2):21-40.

[9] WANG Y Z, DAI M S, ZHANG S J, et al. Exploring candidate genes for pericarp russet pigmentation of sand pear (Pyruspyrifolia) via RNA-Seq data in two genotypes contra sting for pericarp color[J]. PLoS One, 2014, 9(1):e83675.

[10] WANG Y Z, ZHANG S, DAI M S, et al. Pigmentation in sand pear (Pyruspyrifolia) fruit：biochemical characterization, gene discovery and expression analysis with exocarp pigmentation mutant[J]. Plant Mol Biol, 2014，85:123-134.

[11] JEAN-JACQUES M , JEAN-CLAUDE S, ANNIE F, et al. Phenolic compounds and polyphenoloxidase in relation to browning in grapes and wine[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 1991, 30(3):441-486.

[12] 張 勃. 套袋對黃冠梨果實銹斑形成和發(fā)育的影響[D]. 蘭州:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué),2004.

[13] 辛守鵬,劉 帥,余 陽,等.赤霉素與細(xì)胞分裂素對葡萄果實鄰近葉光合特性及果實品質(zhì)的影響[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報,2015,26(7)：1814-1820.

[14] RETAMALES J, BANGERTH F, COOPER T, et al. Effects of CPPU and GA3on fruit quality of ‘Sultanina’ table grape[J]. Plant Bioregulators in Horticulture, 1995，394：149-158.

[15] BARANDOOZI F N, TALAIE A. The effect of gibberellins on russeting in ‘Golden Delicious’ apples[J]. Journal of Horticulture and Forestry, 2009, 1(4)：61-64.

[16] 李健花,高晶晶,馮新新,等. ‘金冠’蘋果與其無銹芽變的果皮性狀比較和防銹技術(shù)研究[J]. 園藝學(xué)報, 2014,41(1)：35-43.

[17] 柯凡君,張紹鈴,陶書田,等.不同果袋對′黃金′和′豐水′梨發(fā)育微環(huán)境及果實品質(zhì)的影響[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2011,34(2)：33-37.

[18] HATFIELD R D, GRABBER J, RALPH J, et al. Using the acetyl bromide assay to determine lignin concentrations in herbaceous plants：some cautionary notes[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 1999, 47(2)：628-632.

[19] 王央杰,李三玉,王向陽. CPPU對巨峰葡萄果粒肥大和內(nèi)源激素水平的影響[J]. 園藝學(xué)報, 1997,24(1)：84-86.

[20] MOCHIDA K, MAKI S, OHNISHI A, et al. Relationship between skin-browning symptom (called ‘kasuri-sho’) and mineral nutrient contents in the skin of ‘Shine Muscat’ grapes[J]. Bull Shimane Agri Exp Sta, 2013，41:41-50.

[21] 孫建平. 不同種葡萄果皮中酚類物質(zhì)的分離及其生物活性研究[D]. 楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2003.

[22] HENG W, LIU L, WANG M D, et al. Differentially expressed genes related to the formation of russet fruit skin in a mutant of ‘Dangshansuli’ pear (PyrusbretchnederiRehd.) determined by suppression subtractive hybridization[J]. Euphytica, 2014, 196(2)：285-297.

[23] 秦晨亮,丁 玲,代紅軍. 赤霞珠葡萄果實發(fā)育過程中酚類物質(zhì)含量與相關(guān)酶活性的關(guān)系[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報,2015,27(1):1922-1926.

[24] VILLALOBOS-GONZALEZ L, PENA-NEIRA A, FREDDY IBAN E Z, et al. Long-term effects of abscisic acid (ABA) on the grape berry phenylpropanoid pathway：Gene expression and metabolite content[J]. Plant Physical and Biochemistry, 2016, (105):213-223.

[25] 吳錦程,唐朝暉,陳 群,等.不同貯藏溫度對枇杷果肉木質(zhì)化及相關(guān)酶活性的影響[J].武漢植物學(xué)研究,2006,24(3)：235-239.

[26] CHEN J Y, WEN P F, KONG W F, et al. Changes and subcellular localizations of the enzymes involved in phenylpropanoid metabolism during grape berry development[J]. Journal of Plant Physiology, 2006,163:115-127.

[27] ZHANG E H, GUO X F, MENG Z F, et al. Construction, expression and characterization ofArabidopsisthaliana4CLandArachishypogaeaRSfusion gene 4CL:RSin Escherichia coli[J]. World J Microbiol Biotechnol, 2015,31:1379-1385.

[28] 陳建中,葛水蓮,王有年,等. 桃內(nèi)果皮木質(zhì)化與其相關(guān)酶的關(guān)系[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,37(9):100-103.