櫻桃番茄果實光澤度測定方法的建立和應用

周 蓉, 徐麗萍, 王銀磊, 趙麗萍, 余文貴, 趙統(tǒng)敏

(1.江蘇省農業(yè)科學院蔬菜研究所，江蘇 南京 210014； 2.江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，江蘇 南京 210014； 3.西寧市蔬菜研究所，青海 西寧 810016)

櫻桃番茄可作蔬菜或水果生食，深受消費者的喜愛。隨著人們生活水平的提高，消費者對櫻桃番茄的要求不再局限于口感，外觀品質好的櫻桃番茄具有較好的市場。隨著果蔬國際貿易的逐漸擴大，符合國際果蔬市場需求的優(yōu)質櫻桃番茄也需要有良好的外觀品質。因此，櫻桃番茄果實的外觀品質(如色澤和形狀等)直接影響其市場價值。近年來，人們對果實色澤特征的描述已經從感官的定性描述逐漸轉向色度值的定量描述[1]。常用的定量描述方法有色差計法、比色法和色卡法[1]。目前對果實色澤的研究應用最多的是色差計法[2-3]。光澤度是櫻桃番茄果實的一個重要外觀性狀，具有高光澤性狀的櫻桃番茄由于鮮艷和亮麗的外表，深受廣大消費者的喜愛，其市場價格比低光澤的櫻桃番茄高。關于番茄色澤的報道很多，但多數集中在顏色方面，極少涉及光澤方面[4-7]。

番茄果實表面的光澤度是一項難以測量的外觀參數，研究人員往往根據個人經驗，用肉眼觀察的方法評價果實的光澤度[8]。肉眼觀察的方法個人主觀性較強，容易產生視覺疲勞，測量誤差較大，且不適于大規(guī)模光澤度的評價，不利于企業(yè)的大批量分類[1]。周冰鈺等將黃瓜果實外表皮剝下后鋪平，利用光澤度儀HYD-09測得果實的光澤值[9]。然而，該方法對果實具有破壞性，需要厚薄均勻且平整的果皮，且外界自然光會影響測量結果，不利于大規(guī)模測量。潘磊慶等發(fā)明一種蘋果表面光澤度檢測裝置，對蘋果進行拍攝，通過圖像處理識別系統(tǒng)給出蘋果光澤度等級[10]。該方法要求具備圖像拍攝和處理系統(tǒng)，技術要求較高，操作較為復雜。目前，相關基礎研究和市場應用均急需一種準確快速且非破壞性的測定櫻桃番茄果實表面光澤度的方法。然而，國內外尚無櫻桃番茄果實表面光澤度測定方法及光澤度評價方法的報道。從櫻桃番茄品質看，果皮光澤性狀是影響外觀品質的主要因素之一，也是主要經濟性狀之一。因此，培育外觀、內在品質俱佳的優(yōu)良番茄品種，已成為當今番茄育種的主要目標。在傳統(tǒng)育種中，對果皮光澤度性狀的鑒定需要等到果實成熟期，耗時較長[9]。利用分子標記輔助選擇育種，可以縮短育種周期，加快番茄育種進程[11]。

因此，為了定量描述番茄果實的光澤度，本研究將利用分光測色計檢測櫻桃番茄的多個顏色參數，篩選評價櫻桃番茄光澤度的最佳顏色參數；通過摸索試驗條件，建立一種快速、準確、非破壞性的測定櫻桃番茄果實光澤度的方法。再基于建立的方法，進一步選擇高光澤和低光澤的櫻桃番茄材料作為親本，構建F2群體，選擇具有極端光澤度的F2代單株，為番茄果實光澤度相關分子標記的開發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 用于建立櫻桃番茄果實光澤度測定方法的植物材料

以江蘇省農業(yè)科學院蔬菜研究所番茄課題組提供的10個櫻桃番茄基因型(WJ-1至WJ-10)為試驗材料，于2015年春季種植在江蘇省農業(yè)科學院六合基地塑料大棚內，用于櫻桃番茄果實光澤度評價方法的建立。櫻桃番茄植株按常規(guī)方法進行管理。

1.2 不同光澤度櫻桃番茄果實顏色參數的測定

在盛果期，從10個基因型櫻桃番茄植株的第3～4個果穗，隨機選取76個成熟度一致的果實，利用分光測色計CM-700D(日本柯尼卡美能達公司產品)測定櫻桃番茄果實表面色澤，每個果實沿赤道面測定5個點后求平均值，獲得每個果實最終的L*、a*、b*和G值。L*、a*和b*值的色空間是最常用的物體顏色空間。L*值0表示黑色，100表示白色，各種灰白在0和100之間；a*(紅綠色差)值大于0表示紅色，小于0表示綠色，絕對值越大，紅色或綠色越深；b*(黃藍色差)值大于0表示黃色，小于0表示藍色，絕對值越大，黃色或藍色越深。G(8°角光澤)值表示物體表面的光澤度。參考Gomez等[4]和周蓉等[3]的方法，計算獲得a*/b*、(a*/b*)2、色調(H)、色度(C)、番茄顏色指數(TCI)這5個色澤參數。其中，色調= ATAN(a*/b*)2，色度= (a*2+b*2)1/2，TCI=L*×[(a*2+b*2)1/2]。在使用分光測色計CM-700D前，用清潔的標準板進行校準。去除櫻桃番茄果實表面的污漬，避免外界光照進入測量孔。同時，通過5個人對多份櫻桃番茄品種果實的肉眼觀察和光澤度評價，獲得高光澤和低光澤的櫻桃番茄作為參照，對76個櫻桃番茄果實進行肉眼分級。根據光澤水平的高低將櫻桃番茄果實分為4個等級，具有低光澤度的番茄果實定為1級，具有高光澤度的番茄果實定為4級，介于二者之間的果實光澤度定為2級(中等光澤度且偏向于1級)和3級(中等光澤度且偏向于4級)。

1.3 櫻桃番茄果實光澤測定方法的建立

取成熟櫻桃番茄果實，在自然和4個不同水平的手動施壓情況下放置在測量口，測定G值，其中手動施壓1級為輕微施壓，2級為中等施壓，3級為較重施壓，4級為嚴重施壓，以6個果實作為重復。取16個成熟果實，自然放置后，在果實表面同一位置重復測定G值2次。取14個成熟果實，自然放置后，在晴天室內開啟2個日光燈、1個日光燈、自然光和黑暗的外界環(huán)境下測定G值。取9個成熟果實，自然放置后，每個果實沿赤道面測定4個、5個、6個、8個點的G值，同時在覆蓋整個果實表面的23個點測定G值。

隨機選取4個番茄植株，從每個植株的第1果序、第2果序和第3果序分別取3個成熟果實，每個果實沿赤道面選取5個點測定G值。在同一番茄植株上，選取8種不同成熟度的果實，同一成熟度選取3個果實，每個果實沿赤道面選取5個點測定G值。

取13個成熟果實，每個果實沿赤道面選取5個點，在采摘當天(0 d)、采摘后1 d、2 d和4 d測定G值。

1.4 親本材料的篩選和F2群體的構建

為了評價市場上主栽品種和本課題組櫻桃番茄果實光澤度，對市場上13份櫻桃番茄品種(M1～M13)和本課題組9份高代自交系櫻桃番茄材料(J1～J9)的果實進行G值測定。每個品種測定8個果實，每個果實沿赤道面選取5個點，并進行肉眼觀察評價果實光澤度。然后，選取本課題組的1個高光澤(J8)和1個低光澤(J9)櫻桃番茄，分別取14個成熟度一致的果實和6個不同成熟度的果實進行G值測定。為了開發(fā)番茄果實光澤度相關的分子標記，利用高光澤和低光澤櫻桃番茄構建F2群體。以高光澤櫻桃番茄(J8，即P1)和低光澤櫻桃番茄(J9，即P2)為親本，2015年春季在江蘇省農業(yè)科學院六合基地正反交獲得F1，2015年秋季在連云港贛榆基地F1植株自交產生F2群體。2016年春季種植正交F2代169個單株，反交F2代178個單株。2017年春季種植正交F2代304個單株。2016年和2017年春季均種植P1、P2和F1。所有試驗材料由江蘇省農業(yè)科學院蔬菜研究所番茄課題組提供，并按常規(guī)方法進行管理。

1.5 F2代單株果實表面光澤度的測定和分級

利用已優(yōu)化的番茄果實光澤測定方法，隨機選取P1和P2的12個單株進行G值測定，同時將P1果實光澤度定為4級，P2果實光澤度定為1級。對F2代單株成熟果實進行G值測定和肉眼光澤度分級。每個植株選擇具有代表性的8個成熟果實，選取每個果實赤道面的5個點測定G值，這5個點G值的平均值作為該果實最終G值，8個果實G值的平均值作為該單株果實最終G值。同時，通過肉眼觀察，對每個單株的成熟果實進行光澤度分級，與P1果實光澤度相似的定為4級，與P2果實光澤度相似的定為1級，介于P1和P2之間的果實光澤度定為2級(中等光澤度且偏向于P2果實光澤度)和3級(中等光澤度且偏向于P1果實光澤度)。

1.6 數據分析

利用SPSS(SPSS Inc., Chicago, IL, 美國)進行Person相關性分析。

2 結果與分析

2.1 櫻桃番茄果實光澤度測定參數的篩選和測定方法的優(yōu)化

通過76個櫻桃番茄表面色澤參數與肉眼光澤度分級值的比較可以看出，L*和G這2個色澤參數與肉眼光澤度分級值分別呈顯著負相關和極顯著正相關，相關系數(r)分別為-0.206和0.788(表1)，因此，G值可以用于櫻桃番茄果實光澤的有效評價。

表1 76個櫻桃番茄的果實色澤參數與肉眼光澤度分級值的相關性

*表示相關顯著；**表示相關極顯著。

與自然放置相比，手動施壓會減小番茄果實的G值，且施壓力度越大，G值越小(圖1)。利用CM-700D分光測色計對番茄果實表面同一個點2次測定的結果完全一致。在2個日光燈、1個日光燈、自然光和黑暗的外界條件下測定的G值一致。在自然光條件下自然放置，每個果實表面選取4個、5個、6個、8個點與選取23個點測定的G值之間呈極顯著相關，相關系數(r)分別0.913**、 0.977**、0.944**和0.970**。同一植株3個果序的果實光澤度之間無顯著差異，且同一植株不同成熟度的果實光澤度之間也無顯著差異。采摘后1 d、2 d和4 d與采摘當天番茄果實的G值均呈極顯著正相關，相關系數(r)分別為0.877**、0.812**和0.807**(表2)。

圖1 外界壓力對櫻桃番茄果實表面G值測定結果的影響Fig.1 The effect of the outside pressure on the measured G value of cherry tomato surface

表2 櫻桃番茄采摘后不同時間與采摘當天G值的相關性

2.2 高光澤和低光澤櫻桃番茄材料的選擇

在市場上搜集的13份櫻桃番茄品種中，圣桃6號果實光澤度最高(G=42.7)，紫皮球果實最暗(G=19.9)，這13份品種果實的平均G值為31.8(圖2)。同時，根據肉眼觀察結果，初步選取本課題組的9份櫻桃番茄基因型，其中5份是高光澤材料(J1、J2、J3、J4和J8)，4份是低光澤的材料(J5、J6、J7和J9)。J8的G值最高(42.7)，J9的G值最低(25.3)(圖2)。對于J8和J9而言，14個成熟度一致的果實G值之間無顯著差異。

在6個不同成熟期，J8果實的G值均顯著高于J9，J8果實G值在不同成熟期差異不顯著，而J9果實G值在成熟后期顯著下降(圖3)。由J8和J9果實的照片也可以看出，J8果實光澤度顯著高于J9。

2.3 櫻桃番茄F2代單株果實光澤度的比較

為了篩選具有不同光澤度的F2代單株，并進一步證實G值與肉眼觀測值的相關性，對正反交F2代單株果實的光澤度進行了調查和測定。結果表明，2016年春季正交F2代169個單株、反交F2代178個單株和2017年春季種植正交F2代304個單株的番茄果實G值和肉眼分級值均存在極顯著相關性，相關系數(r)分別為0.761**、0.826**和0.679**。2016年春季正反交F2代347個單株和2年正交F2代473個單株的番茄果實G值和肉眼分級值呈極顯著相關性，r值分別為0.792**和0.705**。對于本試驗F2代的所有單株(651株)來說，G值和肉眼分級值的r值為0.736**。

M1～M12為市場上櫻桃番茄品種，J1～J9為本課題組的櫻桃番茄高代自交系。圖2 不同櫻桃番茄材料果實G值的差異Fig.2 Difference of G value of cherry tomato cultivars and inbred lines

G表示果實為綠色，G-RⅠ～G-RⅣ表示果實從綠色向紅色轉變，R表示果實為紅色。同一自交系內不同字母表示差異達到顯著水平(P<0.05)。圖3 6個不同成熟度的櫻桃番茄J8和J9果實G值及照片比較Fig.3 The G value and photos of cherry tomato J8 and J9 fruits at different mature degrees

2016年春季正交F2代169個單株中，果實G≤22.0的單株6個，果實G為22.1～24.0的單株7個，果實G為38.1～40.0的單株4個，果實G為40.1～42.0的單株1個，果實G大于42.0的單株4個(圖4)。2016年反交F2代178個單株中，果實G≤22.0的單株4個，果實G為22.1～24.0的單株10個，果實G為40.1～42.0的單株2個(圖4)。由于正交F2代單株中高光澤度的果實數目較多，因此，2017年春季增加正交F2代的種植數量。在2017年春季正交F2代304個單株中，果實G≤22.0的單株6個，果實G為22.1～24.0的單株5個，果實G為38.1～40.0的單株11個，果實G為40.1～42.1的單株6個，果實G>42.0的單株1個(圖4)。此外，F1單株果實的G值均在30.1至32.0之間，P1的G值在40.1至42.0之間，P2的G值在24.1至26.0之間(圖4)。

a:≤22.0;b:22.1～24.0;c:24.1～26.0;d:26.1～28.0;e:28.1～30.0;f:30.1～32.0;g:32.1～34.0;h:34.1～36.0;i:36.1～38.0;j:38.1～40.0;k:40.1～42.0;l:>42.0。箭頭表示F1、P1和P2的G值所在的范圍。A:2016年正交F2群體;B:2016年反交F2群體;C:2017年正交F2群體。圖4 櫻桃番茄F2群體單株果實表面光澤度Fig.4 Glossiness of fruits from the plants of cherry tomato F2 population

3 討 論

櫻桃番茄果實有無光澤屬于感官品質性狀，是重要的農藝性狀之一，與番茄的經濟價值密切相關。根據光澤的有無或高低可以將番茄果實分為不同類別，如高光澤、低光澤甚至無光澤。高光澤的番茄具有光鮮油亮的外表，能夠更好地吸引消費者，具有較好的商品性。因此，建立櫻桃番茄果實光澤測定方法有利于番茄的高品質育種，可以提高番茄的商品價值。而且，番茄是研究果實發(fā)育的模式作物，具有穩(wěn)定的遺傳轉化體系[12-13]。因此，研究番茄果實光澤性狀可以為光澤分子標記輔助育種體系的建立和果皮光澤形成的遺傳機理研究奠定基礎。本研究首次結合顏色參數G值建立了一種快速準確地測定櫻桃番茄光澤度的方法，并利用該方法篩選得到高光澤和低光澤的櫻桃番茄材料，構建了F2群體，篩選獲得具有極端光澤度的F2代單株。

對于果實光澤度的評價，肉眼觀察的方法誤差大，不適于大規(guī)模應用。周冰鈺等[9]利用光澤度儀評價黃瓜表面光澤度的方法對果實具有破壞性，也不適于大規(guī)模應用。潘磊慶等[10]利用圖像處理識別系統(tǒng)劃分蘋果光澤度等級的方法要求具備圖像拍攝和處理系統(tǒng)，技術要求高，操作復雜。目前，相關基礎研究和市場應用中均急需一種準確快速且非破壞地測定櫻桃番茄果實表面光澤度的方法。顏色參數L*代表明亮度，L*值越大表示所測樣品的表面越亮[14]。劉德春等發(fā)現L*值對臍橙果皮光澤度的評價結果與肉眼觀測結果一致[1]。然而，本研究中，櫻桃番茄果實表面L*值與肉眼評價的光澤度呈顯著負相關，因此，L*值不適于櫻桃番茄果實光澤度的評價。本研究首次利用G值(即8°角光澤度)這個顏色參數來評價櫻桃番茄果實的光澤度，76個櫻桃番茄果實的G值與肉眼光澤度分級值呈極顯著正相關，說明G值可以作為櫻桃番茄果實光澤度評價的有效指標。

在測定櫻桃番茄果實光澤度時，外界壓力會對G值造成較大影響。因此，在測定過程中，為了減輕外界壓力的影響，應該將待測櫻桃番茄自然放置在儀器測量口處。光照條件不會影響G值測定結果，因此，無需考慮測定環(huán)境的光照條件。在測定不同品種番茄果實G值時，無需考慮果序的差異，選取相同成熟度的果實，每個果實沿赤道面取5個點測定即可，這是由于同一植株不同果序相同成熟度的果實之間G值無顯著差異。櫻桃番茄采摘后1 d、2 d和4 d與采摘當天測定的G值呈極顯著正相關，但采摘后1 d的相關性最大。因此，為了更準確地評價櫻桃番茄果實的光澤度，應在采摘后盡早完成果實表面光澤度的測定?？傊?，在測定櫻桃番茄光澤度時，首先采收植株上具有代表性的成熟度一致的果實，剔除裂果，打開分光測色計CM-700D，零位校準和空白校準后，取干凈果實自然置于測量口，使果實表面覆蓋住測量口，不留肉眼可見的縫隙，不施加外界壓力，每個果實隨機取赤道面5個點進行G值測定，每個品種至少選取3個果實。

大多數重要農藝性狀受到多個基因、環(huán)境及環(huán)境與基因互作的影響，這些性狀的遺傳機制往往復雜[15]，如番茄的光澤度性狀。確定數量性狀位點(Quantitative trait loci, QTL)，對于該性狀的標記開發(fā)和遺傳分析具有重要意義[16]。傳統(tǒng)的QTL定位方法需要對目標性狀的所有個體進行基因型和表型鑒定，費用成本高且效率低[17]。群體分組分析(Bulked segregant analysis，BSA)可以實現目標基因的快速定位以及與目標性狀緊密連鎖的分子標記的開發(fā)[18]。為了構建極端混池，為BSA測序分析做準備，本研究利用市場上櫻桃番茄品種和本課題組的櫻桃番茄材料，用上述快速準確測定櫻桃番茄光澤度的方法，選取了具有高光澤度(J8，G= 42.7)和低光澤度(J9，G= 25.3)的高代自交系番茄材料作為親本。2016年春季，對正反交F2代單株果實的光澤度進行了肉眼觀察評價和G值測定，發(fā)現反交群體中高光澤度單株較少，因此，本研究選取正交F2群體作進一步研究。擴大群體可以增加BSA測序結果的準確性。黃瓜果實的光澤度不僅受自身基因的控制，還受外在環(huán)境條件的影響[19]。Petit等也發(fā)現番茄果實的光澤度對環(huán)境條件(比如季節(jié))比較敏感[8]。因此，為了降低季節(jié)因素對果實光澤度的影響，我們未在秋季進行試驗，而是在2017年春季種植304個正交F2群體，獲得高光澤度和低光澤度的單株分別有18個和11個。結合2016年和2017年春季正交F2代單株果實G值測定結果，共選擇了27個高光澤度和24個低光澤度單株進行極端混池，用于后續(xù)BSA測序。由于部分單株可能同時含有高光澤度和低光澤度的果實[8]，這會影響測序結果的準確性和分子標記的開發(fā)。因此，我們在選擇具有極端性狀的F2代單株時已剔除這樣的單株。本研究為櫻桃番茄果實光澤度表型指標的測定、評價和材料篩選提供了快速有效的方法，這將為櫻桃番茄果實光澤度分子標記輔助育種體系的建立,果皮光澤形成的遺傳機理和光澤度基因調控研究奠定基礎，有利于加快高品質櫻桃番茄育種進程。

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