電子鼻結(jié)合頂空SPME-GC-MS分析毛竹冬筍的揮發(fā)性成分

董文慧， 孫春娃， 丁興萃， 李露雙， 章志遠

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院國家林業(yè)局竹子研究開發(fā)中心，浙江 杭州 310012； 2.浙江人文園林股份有限公司，浙江 杭州 310012)

中國現(xiàn)有竹林面積約 6.0×106hm2，其中毛竹林占地面積大約70%。中國年生產(chǎn)鮮竹筍量約 4.0×106t，年出口 1.0×106t以上，并且竹筍生產(chǎn)中主要是毛竹(Phyllostachysedulis)筍[1]。毛竹竹筍主要有冬筍和春筍，同時有少量鞭筍。毛竹竹筍味道鮮美，屬于綠色森林蔬菜，其含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、纖維素和維生素等，是中國傳統(tǒng)的食品之一。冬筍是立秋前后由毛竹的地下莖的側(cè)芽發(fā)育而成的筍芽，是中國傳統(tǒng)的食品之一，因尚末出土，筍質(zhì)幼嫩，味道鮮美、營養(yǎng)價值高，受到越來越多人的喜愛，被稱為“山珍”。目前關(guān)于竹筍的研究主要集中在蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪、維生素、糖類以及人體所需的大量礦物質(zhì)元素和微量元素等的方面[2-5]。但是對一些微量的次生代謝物質(zhì)、有機物質(zhì)研究較少，他們可能是影響竹筍口感、氣味的關(guān)鍵因素。不同培育方式下的竹筍的口感和營養(yǎng)物質(zhì)會有所差異 ，但是目前關(guān)于竹筍的揮發(fā)性成分的研究較少，而食品的呈味是各種成分相互作用的結(jié)果。相關(guān)研究結(jié)果表明，提高果蔬風味品質(zhì)可以提高果蔬的消費量，而香氣成分是果蔬風味物質(zhì)的重要組分，也是吸引消費者的主要因素之一，如果降低了許多風味物質(zhì)產(chǎn)生的積極影響，就會影響消費者的喜好[6-7]。生產(chǎn)實踐表明，冬筍除了營養(yǎng)豐富、口感美味之外，還含有未知的芳香氣味。前人用GC-MS檢測揮發(fā)性成分發(fā)現(xiàn)，與其他竹筍相比，未出土的毛竹筍筍體中含有含量相對較高的一種烴類物質(zhì)(古巴烯)、一種醇類物質(zhì)(順-3-乙烯醇)和一種酯類物質(zhì)(乙酸乙酯)，并且酯類物質(zhì)的相對含量較高,酯類物質(zhì)能產(chǎn)生使人愉快的芳香味[8-9]，順-3-己烯醇和古巴烯均具有清新香味[10-11]，兩者的相互作用是未出土的毛竹筍產(chǎn)生清新味的主要原因之一。據(jù)報道毛竹筍原筍筍體的揮發(fā)性成分主要是醛類物質(zhì)和芳香類的碳氫化合物等[12]。但是目前關(guān)于毛竹冬筍的揮發(fā)性成分鮮有報道。

電子鼻作為一種具有模糊評價屬性的人工嗅覺電子系統(tǒng)于20世紀末期發(fā)展起來，用來檢測、識別和分析揮發(fā)性成分，其代表的是揮發(fā)性物質(zhì)的整體信息。與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、頂空固相微萃取等技術(shù)相比，電子鼻無須前處理，具有快捷、操作簡便、成本低以及很高的靈活性等優(yōu)勢,廣泛應(yīng)用于食品、環(huán)境[13-15]等領(lǐng)域。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)以其分析速度快、靈敏度高、鑒別能力強等優(yōu)勢，成為分析物質(zhì)結(jié)構(gòu)、發(fā)現(xiàn)新成分的一項既簡單又成熟高效的檢測技術(shù)[16]，是目前食品安全分析領(lǐng)域最重要且主流的技術(shù)手段之一[17-18]。近年來質(zhì)譜庫的檢索功能不斷改進完善，GC-MS可以檢測到的未知成分越來越多，技術(shù)應(yīng)用也越來越普遍。GC-MS法研究竹筍過程中，夏勃[19]曾應(yīng)用GC-MS分析斑苦竹筍的組成成分，陸柏益等[20]和鄭炯等[21]采用GC-MS對萃取毛竹筍油和腌制麻竹筍揮發(fā)性成分開展成分分析。本研究以自然生長(CK)和施肥處理(EG)的2種不同處理的毛竹冬筍為研究對象，通過主成分分析以及線性判別分析探索2種處理竹筍風味的差異。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及樣品處理

毛竹冬筍試驗樣地位于浙江省湖州市吳興區(qū)妙西鎮(zhèn)。處理組為施氮∶磷∶鉀=1∶1∶1(質(zhì)量比)的復(fù)合肥料的毛竹冬筍，記為EG；對照組為自然條件下生長的毛竹冬筍，記為CK。2018年1月在各試驗地進行采樣，每種處理各10株，將采集回來的竹筍洗凈去殼，采用4分法切樣。

1.2 試驗儀器

電子秤、PEN3.5型便攜式電子鼻購于德國Airsense公司；固相微萃取(SPME)裝置購于美國 SUPELCO 公司； Agilent 7890N-5975氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)儀購于美國 Agilent 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 電子鼻測定 每個樣品混合均勻后，先稱量5 g放入標記好的錐形瓶中，用粘紙封口，密封30 min以富集氣體，用于電子鼻試驗的檢測，試驗每組重復(fù)3 次。室溫 (20±5) ℃下，采用頂空抽樣的方法進行氣體的收集。前期預(yù)試驗確定電子鼻的檢測從40 s左右開始趨于穩(wěn)定，因此為了保證數(shù)據(jù)穩(wěn)定性，本試驗的檢測時間設(shè)定為60 s，特征值時間點為50 s，為了減小上一個樣品殘留的氣味可能會影響到下一個測定的指標，清洗時間設(shè)置為200 s，每測試1個樣品后，電子鼻會自動清洗，而且在測量下一個樣品時，系統(tǒng)會自動提醒進樣以及去樣操作。在測量時，氣體的進樣流量為600 ml/min。電子鼻的氣體傳感器陣列由10 個不同的傳感器組成(表1)， 是電子鼻的重要組成部分，電子鼻通過轉(zhuǎn)化傳感器電信號的變化而獲取樣品中揮發(fā)性成分的整體信息。電子鼻自帶的WinMuster可以自動記錄10個傳感器每秒的G/G0值，其中G0代表初始電導(dǎo)率，即傳感器經(jīng)過標準活性炭過濾氣體的電導(dǎo)率，G代表傳感器接觸到樣品揮發(fā)物后的電導(dǎo)率。

表1 電子鼻傳感器性能描述

1.3.2 頂空-固相微萃取 向切碎后的竹筍樣品中加入液氮并研磨成粉，準確稱取0.29 g放入10 ml的SPME專用采用瓶中，加入2 ml超純水，用100 μm PDMS/DVB萃取頭進行萃取，磁力攪拌速度為600 r/min，30 ℃下頂空萃取30 min后取出，快速插入進樣口溫度為250 ℃的色譜儀進樣口中，解吸附4 min，同時啟動儀器采集數(shù)據(jù)。

1.3.3 GC-MS 色譜條件：載氣為氦氣(流速1.0 ml/min)，色譜柱為石英毛細管DB-5柱(60.00 mm×0.25 mm×0.25 μm)，進樣口溫度250 ℃，進樣方式：不分流進樣，升溫程序：初始溫度40 ℃，隨后升到130 ℃(速度2.5 ℃/min)，保持1 min，最終升溫到250 ℃(速度8.0 ℃/min)，汽化室溫度250 ℃。

質(zhì)譜條件：設(shè)置溫度為230 ℃，采用70 eV的高能電子轟擊，電流200 μA，接口溫度230 ℃，質(zhì)量掃描范圍m/z35～95。

檢索譜庫：NIST library和WILEY library 2個化合物檢索質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫。

1.4 數(shù)據(jù)處理

主成分分析(Principal component analysis，PCA)，線性判別分析(Linear discriminant analysis，LDA)由電子鼻自帶的軟件進行分析，采用Excel 2007整理試驗數(shù)據(jù)，采用SPSS 統(tǒng)計分析軟件對試驗結(jié)果進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和方差分析，繪圖采用Origin9。

2 結(jié)果與分析

2.1 電子鼻對不同處理毛竹冬筍的揮發(fā)性成分分析

2.1.1 電子鼻對不同處理毛竹冬筍的信號響應(yīng) 對毛竹冬筍進行電子鼻檢測，獲得電子鼻的10個傳感器的響應(yīng)圖(圖1)。圖中的每一條曲線分別代表了一個傳感器，曲線上的點代表隨著檢測時間的變化，毛竹冬筍的芳香成分通過傳感器時，電阻比會隨著時間的變化而變化。電阻比剛開始時比較低，隨著時間的增長以及揮發(fā)性物質(zhì)在傳感器表面進行富集，傳感器的電阻比會不斷增大，然后趨于平緩，最后達到一個相對穩(wěn)定的狀態(tài)。通過電子鼻傳感器對不同類型的毛竹冬筍芳香特征的響應(yīng)試驗，可得出電子鼻對毛竹冬筍的揮發(fā)性成分有明顯的響應(yīng)，并且每一個傳感器的響應(yīng)程度各不相同，表明利用電子鼻來初步識別不同類型的冬筍氣味品質(zhì)是有可能的。

圖1 電子鼻傳感器對毛竹冬筍揮發(fā)性物質(zhì)的響應(yīng)圖Fig.1 The response map of electronic nose sensor on winter moso bamboo shoots volatile compounds

2.1.2 電子鼻對不同處理的冬筍的信號響應(yīng)及分析 圖2表示毛竹冬筍揮發(fā)性成分經(jīng)過10個傳感器時的電阻比大小。對于不同處理的毛竹冬筍揮發(fā)性主要成分來看，傳感器2、6、7、9響應(yīng)值變化較為明顯，即氮氧化物、甲烷等短鏈烷烴、無機硫化物、有機硫化物這幾類化合物在不同處理的毛竹冬筍之間有明顯變化。8號傳感器代表的是醇醚醛酮類，由電子鼻檢測的結(jié)果是CK的響應(yīng)值略高于EG的響應(yīng)值，由GC-MS得出的結(jié)果是2種處理的醇類、醛類、酮類的揮發(fā)性成分的相對含量CK均略高于EG，兩種檢測方法的結(jié)果基本吻合。

圖2 傳感器對不同處理的毛竹冬筍響應(yīng)值變化的分析圖Fig.2 Analysis of sensor responses to winter moso bamboo shoots under different treatments

2.1.3 不同處理毛竹冬筍的PCA和LDA分析 主成分分析是一種利用降維的思想，把多指標轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個綜合指標，其中每個主成分都能夠反映原始變量的大部分信息，且所含信息互不重復(fù)的分析方法。而線性判別分析是一種能夠保證投影后模式樣本在新的空間中有最小的類內(nèi)距離和最大的類間距離，即模式在該空間中有最佳的可分離性的分析方法。由圖3可知，PCA分析法能夠區(qū)分出不同處理的毛竹冬筍。第一主成分和第二主成分的貢獻率總和為99.336%，第一主成分的貢獻率為94.681%，第二主成分的貢獻率為4.655%，因此可以說明這2個主成分基本上代表了樣品的主要信息。由圖4可知，判別式LD1和判別式LD2的貢獻率分別為92.821%和0.898%，總貢獻率為93.719%。在一般情況下，2個主成分的總貢獻率之和能夠超過70%～85%，可以初步說明其代表的信息具有全面性[22]。PCA分析中，對照毛竹冬筍(CK)和施用復(fù)合肥料的毛竹冬筍(EG)對電子鼻傳感器的感應(yīng)值距離較近，說明二者整體香氣成分接近，而在LDA分析中，CK和EG對傳感器的感應(yīng)值距離較遠，說明不同處理的冬筍整體香氣有差異。由此可得出，LDA和PCA分析方法在一定程度上都可以區(qū)分CK和EG，但是LDA比PCA能更好地區(qū)分CK和EG。

CK：對照毛竹冬筍；EG：施用復(fù)合肥料的毛竹冬筍。圖3 不同類型的毛竹冬筍PCA分析圖Fig.3 PCA analysis of different types of winter moso bamboo shoots

CK：對照毛竹冬筍；EG：施用復(fù)合肥料的毛竹冬筍。圖4 不同類型的毛竹冬筍LDA分析圖Fig.4 LDA analysis of different types of winter moso bamboo shoots

2.2 SPME-GC-MS檢測結(jié)果

2.2.1 檢測成分及相對含量 對不同處理的毛竹冬筍進行SPME-GC-MS成分分析，采用峰面積歸一化法計算各成分的相對含量，具體結(jié)果如表2所示。由表2可知，檢測到的34種物質(zhì)成分中，相對含量高于5%的成分有6種，分別為柏木醇、肉豆蔻醛、未知物、1，3-二羥基丙酮、5-羥甲基糠醛和2-羥基-丁酸酮，2種處理下相對含量均較高的有柏木醇、肉豆蔻醛、1，3-二羥基丙酮、5-羥甲基糠醛和2-羥基-丁酸酮，推測這5種物質(zhì)為冬筍自身特有成分。其中柏木醇的相對含量均為最高，達到28%以上。柏木醇(C15H26O)是首次從雪松中提取出來的天然產(chǎn)物，因此又稱雪松醇，其作為一種倍半萜醇，具有較高的沸點，廣泛存在于柏科和松科等多種植物的揮發(fā)油中，是合成一些香料的必不可少的中間體，具有愉快而溫和的杉木芳香[23-24]。它因持久的木香香氣，廣泛用于各種類型的香水、化妝品中以及衛(wèi)生用品等[25]，并且在毛竹竹稈，尤其是7年生的竹稈中相對含量較高[26]，因此推測柏木醇可能是冬筍清香味的主要成分之一。肉豆蔻醛在鮮椒中具有較高的相對含量值，是鮮椒的主要風味物質(zhì)之一[27]，推測其可能是引起毛竹竹筍辛辣味的主要成分之一。 糖分是毛竹竹筍甘甜味的主要呈味物質(zhì)之一，其含量是決定竹筍風味、品質(zhì)和營養(yǎng)價值的重要參數(shù)之一，甜味與葡萄糖、蔗糖、果糖等均有關(guān)系[28]。1，3-二羥基丙酮是一種最簡單的酮糖，屬于單糖中的非還原糖，帶有甜味,易溶于水[29-30]。5-羥甲基糠醛是由含糖物質(zhì)在加熱過程中產(chǎn)生的，普遍存在于含糖量較高的植物和食物中[31-32]。苯乙醛和4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)呋喃酮都與食品散發(fā)的清香味有關(guān)，都是很優(yōu)質(zhì)的香料物質(zhì)，苯乙醛具有濃郁的清香氣，天然存在于玫瑰油中；4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)呋喃酮廣泛應(yīng)用于食品、煙草等天然產(chǎn)物中[33-34]，這幾種酮類物質(zhì)和醛類物質(zhì)具有香味和甜味，因此推測它們是毛竹竹筍具有清香味的原因之一。

2.2.2 不同處理毛竹冬筍揮發(fā)性成分歸類分析 通過質(zhì)譜庫檢索匹配，不同處理毛竹冬筍樣品共鑒定出34種成分，其中醇類8種、醛類3種、酮類5種、烴類3種、酯類4種、酸類4種、酚類1種、吡嗪類4種、呋喃1種、未知物1種。由表3可知，CK和EG的相對含量按多少依次為：醇類>醛類>酮類>烴類>酯類>酸類>酚類。醇類物質(zhì)的相對含量最高，超過30%，其次是醛類物質(zhì)，醇類物質(zhì)有著令人愉快的香味和氣味，是影響風味物質(zhì)的重要化合物[35-36]。一般情況下，醛醇類化合物都具有揮發(fā)性的香氣，其是脂質(zhì)產(chǎn)生的降解產(chǎn)物，并且一些揮發(fā)性醇會產(chǎn)生輕柔的香氣[37]。苯甲醇可能是影響水煮竹筍的甜味和特征香氣的芳香族化合物的成分之一[12]。一些醛類物質(zhì)和酚類物質(zhì)具有澀味[38-39]。2種處理的毛竹冬筍都是醇類物質(zhì)的相對含量最高，醛類物質(zhì)的相對含量次之，酚類物質(zhì)的相對含量最低，并且醇類物質(zhì)的相對含量是醛類物質(zhì)的21.5倍，是酚類的214.0倍，說明冬筍中有相對含量較高的醇類物質(zhì)。2種處理的毛竹冬筍的醇類、醛類、酯類、酸類和酚類的含量均為CK均略高于EG，說明CK的冬筍中含香味的揮發(fā)性氣體較多。由電子鼻分析結(jié)果得出，CK的新鮮冬筍距離原點坐標軸較遠，因此其在第一主成分上的貢獻率較高，其主要揮發(fā)性成分電阻比值相對較高，與GC-MS檢測結(jié)果基本吻合。

表2 毛竹冬筍成分及相對含量(相對峰面積)

CK：對照毛竹冬筍；EG：施用復(fù)合肥料的毛竹冬筍。

表3 不同處理冬筍揮發(fā)性成分歸類分析

3 結(jié) 論

本次試驗利用了電子鼻和SPME-GC-MS對不同處理的毛竹冬筍進行成分分析。由SPME-GC-MS分析結(jié)果表明，毛竹冬筍的風味物質(zhì)是由柏木醇、肉豆蔻醛、1，3-二羥基丙酮、5-羥甲基糠醛和2-羥基-丁酸酮。由SPME-GC-MS得出，2種處理的毛竹冬筍的揮發(fā)性成分主要是醇類、醛類，CK均高于EG，與電子鼻檢測結(jié)果一致。PCA和LDA分析結(jié)果均表明CK和EG之間有所不同，但是LDA對CK與EG的分離效果相對較好，說明通過電子鼻以及LDA分析可以區(qū)分CK和EG 2種處理的毛竹冬筍。

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