渦流空化改善大豆分離蛋白溶解性的分子間作用機(jī)制

任仙娥，李春枝，楊 鋒，黃永春，閻柳娟

（廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西高校糖資源加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 柳州 545006）

大豆蛋白氨基酸組成合理，含有能降低膽固醇、預(yù)防心血管疾病的生理活性成分，并具有良好的加工性能以及較低的成本，常作為重要的食品配料廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)[1]。大豆分離蛋白是一種重要的商用大豆蛋白產(chǎn)品，主要成分為大豆球蛋白和β-伴球蛋白，這些蛋白組分在生產(chǎn)加工過(guò)程中受到酸沉、高溫的影響，極易發(fā)生變性，變性后的蛋白質(zhì)進(jìn)一步聚集形成大的聚集體甚至沉淀，導(dǎo)致商用大豆分離蛋白的溶解性較差[2]。蛋白質(zhì)的大部分功能性質(zhì)都與溶解性有關(guān)，低溶解性使得很多功能性質(zhì)也變差。商用大豆分離蛋白的低溶解性極大地限制了它在食品工業(yè)中的應(yīng)用[3]。因此，很多物理、化學(xué)和生物學(xué)方法都被用來(lái)改性大豆蛋白以提高其溶解性，進(jìn)而改善其功能性質(zhì)[4-6]。

空化技術(shù)是一項(xiàng)食品物理加工新技術(shù)。在空化過(guò)程中，空化泡潰滅的瞬間會(huì)產(chǎn)生局部極端瞬時(shí)高溫、高壓，并伴有強(qiáng)烈的沖擊波、微射流、湍流、高剪切力，同時(shí)還產(chǎn)生自由基等效應(yīng)，這些效應(yīng)能誘導(dǎo)或加速一些物理化學(xué)反應(yīng)的發(fā)生[7-8]。目前常用的空化方式有超聲空化和水力空化[9]。Ashokkumar[10]、O’Sullivan[11]和白復(fù)笑[12]等研究表明，超聲空化能破壞蛋白質(zhì)分子之間的相互作用，使蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生變化、大的聚集體解聚、分子結(jié)構(gòu)部分展開、表面疏水性增加，進(jìn)而使部分功能性質(zhì)得到改善。本課題組前期研究結(jié)果表明，基于渦流的水力空化能使大豆分離蛋白粒徑減小，表面疏水性增加，二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，溶解性可由處理前的（45.23f2.48）%增加至（89.24f1.81）%，與此同時(shí)，其乳化性和起泡性等功能性質(zhì)也得到很大改善[13-14]。蛋白質(zhì)的溶解性和功能性質(zhì)與其構(gòu)象密切相關(guān)，而蛋白質(zhì)的構(gòu)象是通過(guò)離子鍵、氫鍵、二硫鍵、疏水相互作用等分子間作用力來(lái)維持的[15]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究渦流空化引起的大豆分離蛋白分子間作用力的變化，并分析它與溶解性改善之間的關(guān)聯(lián)，來(lái)探討渦流空化改善大豆分離蛋白溶解性的作用機(jī)制，為水力空化技術(shù)在蛋白質(zhì)改性領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白（蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥90%）購(gòu)于山東禹王生態(tài)食品有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

T6新世紀(jì)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；Avanti J-26 XPI高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；BSA224S電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；Mini-PROTEAN Tetra Cell垂直電泳系統(tǒng) 美國(guó)伯樂(lè)公司。

渦流空化實(shí)驗(yàn)裝置由實(shí)驗(yàn)室自制，其結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖1，由儲(chǔ)液罐、壓力表、渦流泵、閥門和管道組成。流體從儲(chǔ)液罐流經(jīng)渦流泵，再回到儲(chǔ)液罐。渦流泵中電機(jī)驅(qū)動(dòng)葉輪旋轉(zhuǎn)，當(dāng)流體流經(jīng)旋轉(zhuǎn)的葉輪時(shí)，產(chǎn)生漩渦，導(dǎo)致中心壓力降低，當(dāng)壓力低于液體的蒸汽壓時(shí)，空化泡產(chǎn)生，隨著葉輪的旋轉(zhuǎn)，空化泡又被甩出，當(dāng)壓力增大時(shí)，空化泡破滅，產(chǎn)生空化效應(yīng)。

圖 1 渦流空化裝置圖Fig. 1 Schematic diagram of swirling cavitation

1.3 方法

1.3.1 渦流空化處理大豆分離蛋白

用去離子水將大豆分離蛋白粉末配成3 g/100 mL的分散液，待其充分溶解后，倒入儲(chǔ)液罐中，開啟冷卻水，開啟渦流泵，調(diào)節(jié)壓力，分別在0.2、0.4、0.6 MPa下處理不同時(shí)間（5、10、30、60 min）。經(jīng)處理后的樣品凍干后備用。

1.3.2 還原十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

還原十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）參照J(rèn)iang Lianzhou等[16]的方法，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)13%的分離膠、4%的濃縮膠。將蛋白質(zhì)樣品稀釋至3 mg/mL，取40 μL稀釋后的蛋白液與80 μL樣品緩沖液（3.55 mL去離子水、1.25 mL 0.5 mol/L pH 6.8的Tris-HCl、2.5 mL甘油、2.0 mL 10 g/100 mL SDS和0.2 mL 0.5 g/100 mL溴酚藍(lán)混合均勻后于室溫下貯存，使用時(shí)取出950 μL與50 μLβ-巰基乙醇混合），混合均勻后于95 ℃下加熱5 min，冷卻后上樣，上樣量為10 μL。電泳時(shí)蛋白質(zhì)樣品在濃縮膠中電流為16 mA，進(jìn)入分離膠后將電流調(diào)為28 mA。電泳結(jié)束后，先對(duì)其進(jìn)行固定，然后采用考馬斯亮藍(lán)R250染色，再進(jìn)行脫色，直至出現(xiàn)清晰的蛋白條帶為止，最后使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像處理。

1.3.3 分子間作用力的測(cè)定

參照Tan[17]和劉書成[18]等的方法，略作修改，具體操作步驟如下：取0.6 g樣品加入20 mL S1（0.6 mol/L NaCl），充分?jǐn)嚢枞芙夂笥?0 000 r/min離心10 min后取出上清液。再向所得沉淀中加入20 mL S2（1.5 mol/L尿素和0.6 mol/L NaCl的混合液），充分?jǐn)嚢枞芙夂笥?0 000 r/min離心10 min后取出上清液。再向所得沉淀中加入20 mL S3（8 mol/L尿素和0.6 mol/L NaCl的混合液），充分?jǐn)嚢枞芙夂笥?0 000 r/min離心10 min后取出上清液。再向上述所得沉淀中加入20 mL S4（0.5 mol/Lβ-巰基乙醇、8 mol/L尿素和0.6 mol/L NaCl的混合液，pH 7）充分?jǐn)嚢枞芙夂笥?0 000 r/min離心10 min后取出上清液。向上述每一步離心所得上清液中分別加入等體積的20 g/100 mL三氯乙酸，于10 000 r/min離心10 min，棄上清液，向所得沉淀中（包括未溶于S4的沉淀）分別加入1 mL 1 mol/L NaOH溶液，利用Lowry法測(cè)定其蛋白質(zhì)含量[19]。以溶解于S1的蛋白質(zhì)含量占總蛋白質(zhì)含量的比例來(lái)表示離子鍵含量，以溶解于S2的蛋白質(zhì)含量占總蛋白質(zhì)含量的比例來(lái)表示氫鍵含量，以溶解于S3的蛋白質(zhì)含量占總蛋白含量的比例來(lái)表示疏水相互作用的強(qiáng)弱，以溶解于S4的蛋白質(zhì)含量占總蛋白質(zhì)含量的比例來(lái)表示二硫鍵含量，以經(jīng)S4提取后最終所得沉淀的蛋白質(zhì)含量占總蛋白質(zhì)含量的比例來(lái)表示非二硫共價(jià)鍵含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，利用SPSS 21軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan法進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，相關(guān)性分析采用Pearson分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 渦流空化對(duì)大豆分離蛋白分子質(zhì)量分布的影響

大豆蛋白的主要成分為大豆球蛋白和β-伴球蛋白。大豆球蛋白由一個(gè)酸性多肽和一個(gè)堿性多肽通過(guò)二硫鍵連接，β-伴球蛋白由α、α’和β3 個(gè)亞基組成[1]。為了判斷大豆分離蛋白經(jīng)渦流空化處理后其溶解性的改善是否由蛋白質(zhì)的水解引起，取出經(jīng)渦流空化處理時(shí)間較長(zhǎng)（30 min和60 min）的樣品，通過(guò)還原SDS-PAGE來(lái)說(shuō)明渦流空化是否引起大豆分離蛋白肽鍵的斷裂導(dǎo)致其分子質(zhì)量發(fā)生變化。

圖 2 渦流空化對(duì)大豆分離蛋白分子質(zhì)量分布的影響Fig. 2 Effect of swirling cavitation on molecular mass distribution of SPI

由圖2可以看出，不同壓力下渦流空化處理30 min和60 min后均未引起大豆蛋白各條帶的變化，無(wú)小分子質(zhì)量條帶的產(chǎn)生，說(shuō)明渦流空化處理并未使大豆分離蛋白的肽鍵斷裂，所以溶解性的改善不是由蛋白質(zhì)的水解引起的。Hu Hao等[20]在研究超聲波對(duì)大豆分離蛋白理化性質(zhì)的影響時(shí)也發(fā)現(xiàn)不同功率的超聲波處理能改善大豆分離蛋白的溶解性，但是并不引起肽鍵的斷裂，因此其認(rèn)為超聲波處理后大豆分離蛋白溶解性的改善不是由蛋白質(zhì)的水解引起的，而是由構(gòu)象的變化引起的。O’Sullivan等[21]也報(bào)道過(guò)相似的結(jié)論。

2.2 渦流空化對(duì)大豆分離蛋白分子間作用力的影響

2.2.1 渦流空化對(duì)大豆分離蛋白離子鍵含量的影響

圖 3 渦流空化對(duì)大豆分離蛋白離子鍵含量的影響Fig. 3 Effect of swirling cavitation on the content of ionic bonds in SPI

由圖3可知，大豆分離蛋白在未處理時(shí)離子鍵含量為（18.34f0.95）%，經(jīng)渦流空化處理后離子鍵含量顯著增加（P＜0.05）。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)離子鍵含量不斷增加，在不同壓力下處理60 min后，離子鍵含量分別達(dá)到（44.93f1.66）%（0.2 MPa）、（56.04f2.75）%（0.4 MPa）和（68.02f4.26）%（0.6 MPa）。前期研究結(jié)果表明，經(jīng)渦流空化處理后，大豆分離蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，一些大的聚集體解聚，平均粒徑降低，分子結(jié)構(gòu)部分展開，更多的帶電氨基酸殘基暴露于分子表面[13]，這有利于離子鍵的形成。Jambrak等[22]研究發(fā)現(xiàn)，超聲空化能改變?nèi)榍宓鞍椎母呒?jí)結(jié)構(gòu)，也使帶電氨基酸殘基數(shù)量增加，溶解性增加。

由圖3還可以看出，處理相同時(shí)間時(shí)，壓力越大離子鍵含量增加越明顯，這與空化現(xiàn)象的形成有關(guān)。更高的壓力使流體流經(jīng)渦流泵的速率更高，導(dǎo)致漩渦中心的壓力下降得更多，從而形成更多的空化泡，空化強(qiáng)度也更大[23]，蛋白質(zhì)樣品的解聚程度更大，從而暴露出更多的氨基酸殘基，有利于離子鍵的形成。

2.2.2 渦流空化對(duì)大豆分離蛋白氫鍵含量的影響

圖 4 渦流空化對(duì)大豆分離蛋白氫鍵含量的影響Fig. 4 Effect of swirling cavitation on the content of hydrogen bonds in SPI

氫鍵是一種弱鍵，在維系和促進(jìn)蛋白質(zhì)構(gòu)象形成，特別是在二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成中起著極其重要的作用[24]。由圖4可知，渦流空化處理對(duì)大豆分離蛋白氫鍵含量的影響與其處理壓力和時(shí)間有關(guān)。在空化壓力為0.2 MPa時(shí)，處理5 min后，氫鍵含量有所增加，但隨著處理時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，氫鍵含量開始降低；在空化壓力為0.4 MPa時(shí)，氫鍵含量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，但是處理時(shí)間超過(guò)30 min后，氫鍵含量顯著降低（P＜0.05）；在空化壓力為0.6 MPa時(shí)，氫鍵含量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)顯著降低（P＜0.05），處理60 min后氫鍵含量可由0 min時(shí)的（6.87f0.77）%減小到（2.88f0.39）%。劉書成等[18]研究表明，氫鍵對(duì)溫度比較敏感，溫度越高，氫鍵越弱，50 ℃的熱效應(yīng)已經(jīng)能對(duì)氫鍵產(chǎn)生強(qiáng)烈的破壞作用。渦流空化過(guò)程中產(chǎn)生局部瞬時(shí)高溫等空化效應(yīng)，會(huì)破壞氫鍵，導(dǎo)致氫鍵含量下降。同時(shí)，氫鍵斷裂使大豆分離蛋白發(fā)生解聚，高級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，分子展開，更多的側(cè)鏈基團(tuán)暴露出來(lái)，又可形成新的氫鍵。由此推測(cè)，渦流空化處理過(guò)程中氫鍵的斷裂和形成同時(shí)發(fā)生，而不同壓力產(chǎn)生的空化效應(yīng)有所差別，導(dǎo)致氫鍵形成和斷裂的速率不同，所以渦流空化在不同壓力和處理時(shí)間下對(duì)氫鍵的影響不同。另外，前期的研究結(jié)果表明，渦流空化處理使大豆分離蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，其中β-折疊含量增加，α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲含量均降低，但是增加和降低的幅度隨處理壓力和時(shí)間的不同而不同[13]。α-螺旋含量的降低意味著蛋白分子內(nèi)部相鄰肽鏈之間的氫鍵受到破壞，而β-折疊含量的增加則說(shuō)明又有新的氫鍵形成，這也說(shuō)明了渦流空化處理過(guò)程中氫鍵的斷裂和形成同時(shí)發(fā)生。張文等[25]在研究超聲波對(duì)花生蛋白分子結(jié)構(gòu)的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)超聲波的空化作用能破壞蛋白質(zhì)分子內(nèi)氫鍵，使其二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。齊寶坤等[26]發(fā)現(xiàn)熱處理能使大豆球蛋白分子中的氫鍵發(fā)生變化，導(dǎo)致其二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)而影響其溶解性。

2.2.3 渦流空化對(duì)大豆分離蛋白疏水相互作用的影響

圖 5 渦流空化對(duì)大豆分離蛋白疏水相互作用的影響Fig. 5 Effect of swirling cavitation on the content of hydrophobic interaction in SPI

疏水相互作用是疏水基團(tuán)為了避開水分子而被迫靠近的現(xiàn)象，它在維持蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和四級(jí)結(jié)構(gòu)的形成中占有突出的地位[24]。由圖5可知，在空化壓力為0.2 MPa和0.4 MPa時(shí)，處理初期疏水相互作用增加，這是因?yàn)榭栈幚硎沟鞍踪|(zhì)的結(jié)構(gòu)展開，大的聚集體解聚，包埋在分子內(nèi)部的疏水性氨基酸殘基暴露出來(lái)，有利于疏水相互作用的增加；但是隨著處理時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，疏水相互作用下降。而在0.6 MPa時(shí)，疏水相互作用則隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)均顯著降低（P＜0.05）。在處理60 min后，所有經(jīng)過(guò)渦流空化處理后大豆分離蛋白的疏水相互作用均顯著低于未處理的（P＜0.05），可由未處理時(shí)的（34.55f1.86）%分別減小到（20.26f1.52）%（0.2 MPa）、（14.75f1.61）%（0.4 MPa）和（7.46f1.44）%（0.6 MPa）。這說(shuō)明隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)和壓力的增大，空化效應(yīng)對(duì)疏水相互作用的破壞更強(qiáng)，所以雖然疏水基團(tuán)暴露出來(lái)，但疏水相互作用還是降低的。Hu Hao等[20]在研究超聲波對(duì)大豆分離蛋白理化性質(zhì)的影響時(shí)也發(fā)現(xiàn)，超聲空化產(chǎn)生的湍流、高壓和高剪切等空化效應(yīng)也能破壞蛋白分子間的疏水相互作用，并且隨著超聲空化強(qiáng)度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，疏水相互作用的破壞增加，溶解性顯著增加。

2.2.4 渦流空化對(duì)大豆分離蛋白二硫鍵含量的影響

二硫鍵是蛋白質(zhì)多肽鏈內(nèi)或不同鏈間的兩個(gè)半胱氨酸殘基的巰基氧化形成的，它對(duì)蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)的形成與穩(wěn)定起著重要作用[24]。由圖6可知，未處理的大豆分離蛋白二硫鍵含量為（24.16f1.14）%。與未處理的蛋白相比，渦流空化處理能顯著降低二硫鍵含量（P＜0.05），且隨處理壓力和時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，降低幅度隨著空化壓力的變化而不同，其中在0.6 MPa下二硫鍵含量降低最多。大豆分離蛋白溶液經(jīng)0.2、0.4 MPa和0.6 MPa處理60 min后二硫鍵含量分別為（12.57f1.13）%、（10.42f0.90）%和（10.34f2.21）%。二硫鍵含量降低的原因是渦流空化時(shí)產(chǎn)生的局部極端高溫、高壓、高剪切力和湍流等作用能使二硫鍵斷裂。文鵬程等[27]在研究不同處理?xiàng)l件對(duì)乳鐵蛋白構(gòu)象的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，超聲空化處理能使乳鐵蛋白的二硫鍵含量降低33.7%；Hu Hao等[28]也發(fā)現(xiàn)超聲空化處理能使大豆分離蛋白的二硫鍵斷裂轉(zhuǎn)化為巰基，導(dǎo)致其平均粒徑也減小，溶解性增加；畢爽[29]和Petruccelli[30]等研究表明，二硫鍵的斷裂能使蛋白分子的構(gòu)象發(fā)生改變，結(jié)構(gòu)變得松散，更多的親水基團(tuán)暴露出來(lái)，溶解性增加。

圖 6 渦流空化對(duì)大豆分離蛋白二硫鍵含量的影響Fig. 6 Effect of swirling cavitation on the content of disulfide bonds in SPI

2.2.5 渦流空化對(duì)大豆分離蛋白非二硫共價(jià)鍵含量的影響

圖 7 渦流空化對(duì)大豆分離蛋白非二硫共價(jià)鍵含量的影響Fig. 7 Effect of swirling cavitation on the content of non-disulfide covalent bonds in SPI

由圖7可知，渦流空化處理對(duì)大豆分離蛋白非二硫共價(jià)鍵含量的影響隨處理壓力的不同而不同。在0.2 MPa下非二硫共價(jià)鍵含量未發(fā)生顯著變化（P＞0.05）；在0.4 MPa下非二硫共價(jià)鍵含量隨處理時(shí)間的不同有不同程度的降低；在0.6 MPa下非二硫共價(jià)鍵含量在處理30 min后顯著降低（P＜0.05）。這說(shuō)明渦流空化在較高壓力下產(chǎn)生的較強(qiáng)的空化效應(yīng)能使大豆分離蛋白的非二硫共價(jià)鍵斷裂。姜梅等[31]在研究高壓均質(zhì)對(duì)豆乳蛋白質(zhì)溶解性的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)高壓均質(zhì)產(chǎn)生的高速剪切、空穴和渦旋作用也使共價(jià)鍵斷裂，蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)展開，水化作用增強(qiáng)，溶解性增加。

2.3 大豆分離蛋白溶解性與分子間作用力之間的相關(guān)性分析結(jié)果

為了探討渦流空化處理對(duì)大豆分離蛋白溶解性改善的分子作用機(jī)制，將前期研究得到的大豆分離蛋白在渦流空化處理過(guò)程中溶解性變化的數(shù)據(jù)[13]與本研究中圖3～7各分子間作用力變化的數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表1所示。

表 1 大豆分離蛋白溶解性與各分子間作用力的相關(guān)性Table 1 Correlation analysis between intermolecular forces and solubility of SPI

大豆分離蛋白的溶解性與其離子鍵含量之間存在極顯著正相關(guān)（r＝0.754）（P＜0.01），與疏水相互作用和二硫鍵含量之間均極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為-0.714、-0.839，與氫鍵含量和非二硫共價(jià)鍵含量無(wú)顯著相關(guān)（P＞0.05）。由此可見(jiàn)，大豆分離蛋白在渦流空化處理過(guò)程中，溶解性的增加是由離子鍵的形成、疏水相互作用的破壞和二硫鍵的斷裂引起的。

3 結(jié) 論

通過(guò)研究大豆分離蛋白在渦流空化處理過(guò)程中分子間作用力的變化，探討了溶解性改善與分子間作用力變化之間的關(guān)系，得到以下結(jié)論：1）渦流空化處理過(guò)程中，大豆分離蛋白溶解性的改善不是由肽鍵斷裂引起的；2）渦流空化處理使大豆分離蛋白的分子間作用力發(fā)生變化，其溶解性的改善是由離子鍵的形成、疏水相互作用的破壞和二硫鍵的斷裂引起的。