免疫球蛋白基因重排在濾泡性淋巴瘤中的應(yīng)用

許 潔，崔 倩，張科平，陳 潔，林丹義，徐方平，朱小蘭，駱新蘭

濾泡性淋巴瘤(follicular lymphoma, FL)起源于濾泡生發(fā)中心B細(xì)胞一類非霍奇金淋巴瘤，由于其癥狀不明顯，就診時(shí)，多數(shù)已為Ⅱ～Ⅲ期，因此早期診斷十分重要[1]。FL與淋巴濾泡反應(yīng)性增生的鑒別診斷，絕大多數(shù)病例依據(jù)組織學(xué)特征并結(jié)合臨床表現(xiàn)便可以做出明確診斷，也有不少疑難病例借助免疫組化、分子遺傳等技術(shù)進(jìn)行鑒別和確診，基因重排分析確定B細(xì)胞增生的克隆性，有助于解決這一問題[2]。本文應(yīng)用PCR-GeneScan法檢測39例FL免疫球蛋白重鏈/輕鏈(IgH/L)基因重排，統(tǒng)計(jì)分析克隆性IgH/L基因重排與腫瘤分級的關(guān)系，探討其對于濾泡性淋巴瘤早期診斷的作用。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集2016年9月～2019年2月廣東省人民醫(yī)院病理科診斷的39例FL石蠟標(biāo)本，均為手術(shù)標(biāo)本，平均年齡(54.64±17.47)歲，根據(jù)WHO(2008)淋巴造血系統(tǒng)腫瘤分級標(biāo)準(zhǔn)[3]，其中15例為FL1，7例為FL2，17例為FL3(11例為FL3A，6例為FL3B)。

1.2 主要儀器與試劑基因重排檢測試劑盒(IgH3+IgK,PCR毛細(xì)管電泳法，CL220001),基因重排檢測試劑盒(HE，PCR毛細(xì)管電泳法，CL220004)，基因重排檢測試劑盒(IgL，PCR毛細(xì)管電泳法，CL220006)由上海源奇生物公司提供，引物序列均來源于BIOMEN-2的研究成果[4]；QIAamp石蠟標(biāo)本DNA提取試劑盒(56404)購于德國Qiagen公司；去離子甲酰胺HIDI(ABI公司)；分子內(nèi)標(biāo)GS500Liz(ABI公司)；POP7膠(ABI公司)；基因擴(kuò)增PCR儀(美國ABI Veriti)；基因測序儀(美國ABI3500DX)；Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific公司)。

1.3 基因組DNA提取切取10 μm厚組織4片，切片貼于干凈的玻片上。二甲苯脫蠟至水后，按照HE染色片所選取的腫瘤區(qū)域小心用無菌刀片將腫瘤組織刮入1.5 mL的EP管中。應(yīng)用QIAamp石蠟組織DNA抽提試劑盒提取DNA。DNA利用Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì)檢測其濃度及吸光度(A)值，經(jīng)0.8%瓊脂糖電泳判定其質(zhì)量。

1.4 PCR+基因掃描法(1)PCR反應(yīng)體系采用基因重排檢測試劑盒(上海源奇生物公司)包括：模板DNA至少100 ng；PCR預(yù)混反應(yīng)液包括IgH管A、B、C，IgK管A、B，IgL，對照基因管(引物序列參照BIOMED-2研究結(jié)果[4])；Ampli Taq Gold DNA聚合酶。各反應(yīng)體系配制：PCR反應(yīng)液16 μL+ Ampli Taq Gold DNA聚合酶1 μL+DNA(包括待檢樣本，相應(yīng)的陽性對照、空白對照)3 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 7 min，95 ℃ 45 s、60 ℃ 45 s、72 ℃ 90 s,合計(jì)40個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min，4 ℃保存。(2)基因掃描試劑配制：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1 μL+LIZ500 0.5 μL+HIDI 10 μL，變性條件：95 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min，將上述變性產(chǎn)物在基因測序儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳。(3)結(jié)果判讀：對照基因管若在100、200、300、395 bp收集到ROX熒光信號，表示DNA的質(zhì)量符合實(shí)驗(yàn)要求，相應(yīng)的陽性對照在有效的范圍內(nèi)收集到不連續(xù)的熒光信號，而空白對照未收集除引物峰以外的熒光信號，如實(shí)驗(yàn)滿足以上有效條件，在有效范圍內(nèi)的1個(gè)或2個(gè)強(qiáng)陽性條帶的樣本提示基因重排為陽性，反之為陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用χ2檢驗(yàn)和Spearman等級相關(guān)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

39例FL中有29例(29/39，74.36%)IgH/L基因重排陽性，其中，F(xiàn)L1基因重排的檢出比例為8/15，F(xiàn)L2重排的檢出比例為5/7，F(xiàn)L3重排的檢出比例為16/17，僅1例FL3B未檢出克隆性重排。Spearman等級相關(guān)檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示，IgH/L基因重排在FL3中的檢測率高于FL1、FL2，其檢出率與FL的分級呈顯著正相關(guān)(rp=0.376,P<0.001)，F(xiàn)L1、FL2和FL3中表達(dá)差異有顯著性(P=0.004)，F(xiàn)L3A(11/11)與FL3B(5/6)檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.209)；15例IgH基因重排陽性(15/39，38.46%)，聯(lián)合IgK，檢出率提升至74.36%(29/39)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)。

3 討論

FL是最常見的惰性淋巴瘤，根據(jù)WHO(2008)淋巴造血系統(tǒng)腫瘤分級標(biāo)準(zhǔn)，F(xiàn)L可分為3級，其中FL1和FL2屬于低級別淋巴瘤，F(xiàn)L3屬于高級別淋巴瘤，F(xiàn)L3可進(jìn)一步分為3A和3B[3]。FL3尤其是FL3B常伴彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma)區(qū)域[5]。非霍奇金淋巴瘤是一種原發(fā)于淋巴結(jié)及其他淋巴組織的惡性腫瘤，克隆性重排是克隆性增生和譜系來源的標(biāo)志，已被公認(rèn)為淋巴瘤診斷、鑒別診斷和治療后監(jiān)測的重要指標(biāo)[6]；本組39例FL中，29例(29/39，74.36%)IgH/L基因重排陽性，檢出率與國內(nèi)報(bào)道相近[7-9]，其中FL1基因重排的檢出比例為8/15，F(xiàn)L2重排的檢出比例為5/7，而FL3重排的檢出比例為16/17，僅1例FL3B未檢出克隆性重排，F(xiàn)L1、FL2和FL3中克隆性重排的檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，F(xiàn)L3A與FL3B檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IgH/L基因重排在FL3中的檢測率高于FL1、FL2，其檢出比例與FL的分級呈正相關(guān)。80%～90%的FL中發(fā)現(xiàn)t(14;15)(q32;q21)染色體易位，其在FL形成和形成早期是一個(gè)關(guān)鍵性的分子改變，在FL1～2級中約占85%，而FL3級尤其是FL3B級中t(14;15)易位少見，僅占15%～30%，形成這種差異可能與FL3B級中無殘留的濾泡中心細(xì)胞有關(guān)[10]。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PCR-GeneScan檢測IgH/L基因重排在FL3的檢出率高，有效地彌補(bǔ)了單純FISH法檢測t(14;15)(q32;q21)染色體易位的缺陷。對于FL，由于發(fā)生體細(xì)胞超突變，導(dǎo)致VH基因片段的缺失，使IgH基因擴(kuò)增出現(xiàn)假陰性而檢出率降低，IgK重排很少受體細(xì)胞超突變的影響，因此聯(lián)合IgK重排的檢測可大大提高診斷的檢出率[11-12]，本組39例FL中，15例(15/39，38.46%)IgH基因重排陽性，聯(lián)合IgK檢出率提升至74.36%(29/39)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。IgH、IgL基因重排被認(rèn)為可作為B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤的輔助診斷方法，近年開展的PCR法基因重排檢測技術(shù)，克服了傳統(tǒng)技術(shù)存在操作繁雜、耗時(shí)長等缺點(diǎn)，廣泛被應(yīng)用；分析技術(shù)目前臨床上主要為凝膠電泳異源雙鏈分析和基因掃描分析?；驋呙杩梢援a(chǎn)生清晰的峰圖，可以探測到0.5%～1.0%的克隆性淋巴細(xì)胞，即使有一個(gè)堿基的差別，基因掃描后通過圖像峰的位置、高度、大小展示，是一種十分靈敏和精確的檢驗(yàn)手段，有著廣泛的應(yīng)用空間[13]。本實(shí)驗(yàn)使用PCR-GeneScan檢測IgH/L基因重排，利用Ig基因重排檢測對濾泡性淋巴瘤的診斷有輔助性作用，并且利用PCR-GeneScan法可提高重排檢測的敏感性和特異性，對于濾泡性淋巴瘤的早期診斷有一定的價(jià)值，值得推廣。