組織工程技術(shù)在兒童下尿路重建修復(fù)中的若干問(wèn)題

於明明 陳 方,2,3

在小兒泌尿外科，很多先天性疾病及外傷都需要足夠的自體組織用于重建修復(fù)。傳統(tǒng)手術(shù)治療能在一定程度上解決很多問(wèn)題，但也存在不少并發(fā)癥。以?xún)和螂字亟槔?，目前臨床上主要采取腸膀胱成形術(shù)，但其并發(fā)癥繁多，包括尿路感染、尿漏、結(jié)石、代謝紊亂、腸黏膜分泌物多，甚至惡變等[1,2]。此外，很多患兒缺乏足夠的自體組織用于重建，也會(huì)限制手術(shù)的實(shí)施。此時(shí)，組織工程技術(shù)是一個(gè)很好的替代選擇，它將細(xì)胞與生物材料、生物工程原理相結(jié)合，制造出與目標(biāo)組織具有相似結(jié)構(gòu)和功能的替代組織。組織工程技術(shù)較傳統(tǒng)手術(shù)方式最大的優(yōu)勢(shì)在于無(wú)需犧牲自體替代組織，不僅可以減輕手術(shù)創(chuàng)傷，而且能夠很好地解決部分患兒因尿路缺損面積過(guò)大或者需要多次手術(shù)造成的自體替代組織不足的難題。組織工程技術(shù)已經(jīng)能夠構(gòu)建出與正常組織結(jié)構(gòu)相似并具有一定功能的膀胱和尿道組織，但在實(shí)際臨床應(yīng)用中的效果并不理想，這些工程化的下尿路組織移植到患兒體內(nèi)后容易發(fā)生纖維化和結(jié)構(gòu)改變，且重建部位的功能也難以達(dá)到正常水平。因此，利用組織工程技術(shù)重建和修復(fù)尿路缺損的效果尚不如傳統(tǒng)手術(shù)方式，遠(yuǎn)未達(dá)到彌補(bǔ)傳統(tǒng)手術(shù)不足的效果，這也促使研究者們不斷重認(rèn)識(shí)、重思考[3,4]。

一、下尿路組織工程的臨床前研究

組織工程最基礎(chǔ)的兩個(gè)組成部分是支架和種子細(xì)胞，細(xì)胞是工程化組織的來(lái)源，而支架為細(xì)胞的增殖、分化以及遷移等行為提供空間，并且為組織形成提供結(jié)構(gòu)支持[5]。

尿路的結(jié)構(gòu)與功能特點(diǎn)對(duì)支架的選擇提出了很高的要求。一個(gè)理想的支架應(yīng)包含以下特性：良好的生物相容性、可有序降解性、特定的空間結(jié)構(gòu)、適當(dāng)?shù)牧W(xué)強(qiáng)度以及能為細(xì)胞提供良好的生物環(huán)境。目前常用的支架主要有天然支架和人工合成支架。天然支架主要來(lái)源于機(jī)體組織或天然高分子聚合物，如小腸黏膜下層(small intestine submucosa，SIS)、膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)以及膠原蛋白、絲素蛋白等，其優(yōu)點(diǎn)在于具有良好的生物活性、生物相容性以及低免疫原性，缺點(diǎn)是差異性較大、制備及滅菌存在一定困難[6-10]。而人工合成支架常以合成的高分子聚合物為材料，如聚乙醇酸、聚乳酸、聚己內(nèi)酯、聚乙二醇、聚乳酸-乙醇酸等，其性質(zhì)均一，產(chǎn)量高，可調(diào)節(jié)性強(qiáng)，但在生物活性、免疫原性及炎癥反應(yīng)等方面表現(xiàn)不如天然材料[11-15]。

常見(jiàn)的種子細(xì)胞主要包括各種成熟細(xì)胞和干細(xì)胞。自體的尿路上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞是兒童下尿路組織工程技術(shù)最常用的種子細(xì)胞，因其不存在免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)，已被多次應(yīng)用于臨床研究中[16]。而干細(xì)胞具有良好的分化性、可塑性、自我更新能力，且能夠調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、血管化水平等，常用來(lái)彌補(bǔ)成熟細(xì)胞的不足，在臨床前研究中有著廣泛的應(yīng)用[5]。

下尿路組織工程技術(shù)已經(jīng)在臨床前研究中取得了不錯(cuò)的成果，在諸多動(dòng)物(如大鼠、兔、狗及豬等)體內(nèi)能重建出接近正常結(jié)構(gòu)和功能的膀胱與尿道，顯示出組織工程技術(shù)在下尿路重建修復(fù)中的強(qiáng)大優(yōu)越性，并為其臨床轉(zhuǎn)化奠定了一定基礎(chǔ)[17-20]。

二、組織工程技術(shù)在兒童下尿路重建修復(fù)中的臨床應(yīng)用

1. 膀胱:據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，有30例患兒利用組織工程技術(shù)重建修復(fù)了膀胱。早在十幾年前，Atala等[21]首次將成熟的組織工程技術(shù)應(yīng)用于臨床。該研究對(duì)7例脊髓脊膜膨出伴膀胱疾病的患兒通過(guò)膀胱活檢術(shù)取得膀胱上皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞，在體外培養(yǎng)擴(kuò)增后將這些自體細(xì)胞接種在可降解的膠原支架或膠原-PGA復(fù)合支架上，隨后移植到體內(nèi)重建膀胱并伴或不伴大網(wǎng)膜包裹，取得了初步成效。研究結(jié)果表明使用復(fù)合支架并伴大網(wǎng)膜包裹的膀胱重建效果相對(duì)較好，漏尿點(diǎn)壓、容量及順應(yīng)性均有改善，但重建后膀胱的順應(yīng)性及容量隨年齡繼續(xù)增長(zhǎng)的效果難以令人滿(mǎn)意。隨后，Joseph等[22]利用相似的方法在10例神經(jīng)源性膀胱患兒中進(jìn)行了二期臨床研究，但結(jié)果仍不理想。該研究采用自體膀胱上皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞結(jié)合聚乙酸/聚乳酸可降解支架，術(shù)后1年和3年隨訪(fǎng)，發(fā)現(xiàn)患兒膀胱容量和順應(yīng)性沒(méi)有顯著改善，所有患兒出現(xiàn)了并發(fā)癥，其中4例出現(xiàn)了嚴(yán)重腸梗阻或膀胱破裂。SIS是臨床使用最多的天然支架，并且可以不結(jié)合細(xì)胞而單獨(dú)應(yīng)用，盡管此前SIS在臨床前研究中取得了不錯(cuò)的效果，但臨床應(yīng)用時(shí)效果很一般。Caione等[23]將SIS移植到5例膀胱外翻術(shù)后膀胱功能欠佳的患兒體內(nèi)重建膀胱時(shí)，發(fā)現(xiàn)SIS植入后可以逐漸被正常膀胱上皮和肌層替代，術(shù)后6個(gè)月膀胱容量和順應(yīng)性有明顯改善，證明了SIS重建膀胱的可行性；但重建的膀胱組織中肌肉含量很低，術(shù)后18個(gè)月隨訪(fǎng)發(fā)現(xiàn)膀胱容量及順應(yīng)性沒(méi)有持續(xù)顯著提升。同樣，Schaefer等[24]利用SIS對(duì)6例患兒(1例膀胱外翻術(shù)后、1例膀胱輸尿管反流術(shù)后、2例脊柱裂和2例膀胱外翻)重建膀胱，效果也不理想。該研究發(fā)現(xiàn)SIS雖然可以轉(zhuǎn)化為膀胱組織，但其中結(jié)締組織含量過(guò)高，僅2例形成了規(guī)則的尿路上皮；術(shù)后膀胱順應(yīng)性沒(méi)有顯著提升，并且有3例出現(xiàn)了并發(fā)癥(2例膀胱結(jié)石和1例膀胱破裂)。另外，Zhang等[25]通過(guò)對(duì)15例神經(jīng)源性膀胱患者(含2例兒童)的臨床研究發(fā)現(xiàn)，SIS重建膀胱的遠(yuǎn)期成功率為60%(膀胱容量和最大逼尿肌壓有了顯著改善)，有1例患兒術(shù)后出現(xiàn)了膀胱結(jié)石。值得一提的是，Schaefer等[24]還發(fā)現(xiàn)膀胱外翻患者行自體細(xì)胞重建的膀胱組織中依然會(huì)出現(xiàn)膀胱外翻的病理變化-Von Brunn細(xì)胞巢，證實(shí)病態(tài)組織來(lái)源的成熟細(xì)胞會(huì)將其病理特性傳遞到其重建的組織中[26]?？偟膩?lái)說(shuō)，組織工程技術(shù)在兒童膀胱重建修復(fù)中的初步應(yīng)用效果一般，雖然重建的膀胱在短期內(nèi)順應(yīng)性和容量提升尚可，但難以具備與年齡增長(zhǎng)相匹配的持續(xù)提升能力，并且面臨相對(duì)較高的術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率，其效果尚不及傳統(tǒng)手術(shù)的效果。

2. 尿道：組織工程技術(shù)在兒童尿道重建修復(fù)中的臨床研究相比膀胱較少，目前研究共涉及16例患兒。Fossum等[27]最早將通過(guò)膀胱灌洗獲得的膀胱上皮細(xì)胞在體外擴(kuò)增后接種在脫細(xì)胞真皮上重建尿道治療重度尿道下裂，術(shù)后6例患兒均能以站姿從成形的尿道口正常排尿，這說(shuō)明了組織工程技術(shù)重建兒童尿道的可行性；但術(shù)后(隨訪(fǎng)3～5.5年)并發(fā)癥相對(duì)較多，包括1例尿道狹窄、1例吻合口梗阻及2例尿道瘺。Bhargava等[28]研究通過(guò)口腔黏膜活檢分離培養(yǎng)角化細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，隨后將兩者接種到去真皮脫細(xì)胞基質(zhì)上，再將其用于5例尿道狹窄(由硬化性苔蘚引起)患兒的尿道重建修復(fù)，雖然初次移植的成功率為100%，但在隨后近3年的隨訪(fǎng)中發(fā)現(xiàn)5例患兒均出現(xiàn)了輕重不一的并發(fā)癥，其中2例因尿道纖維化或尿道收縮需要完全或部分切除重建的尿道段，整體遠(yuǎn)期成功率為零。Raya-Rivera等[29]研究結(jié)果相對(duì)樂(lè)觀(guān)很多，研究者通過(guò)膀胱活檢術(shù)獲取5例尿道膜部損傷患兒的自體膀胱上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，分離培養(yǎng)后分別接種于管狀聚乙醇酸支架的內(nèi)外兩層，然后植入體內(nèi)重建后尿道。結(jié)果顯示僅1例術(shù)后2周出現(xiàn)了尿道狹窄(隨后行尿道內(nèi)切開(kāi)術(shù)解決)，術(shù)后3個(gè)月尿道活檢顯示所有重建的尿道結(jié)構(gòu)正常，長(zhǎng)期隨訪(fǎng)(6年)未發(fā)現(xiàn)尿道狹窄，表明這種管狀的組織工程化尿道可以用于臨床治療，并且可以在患兒體內(nèi)持續(xù)作用6年以上。由此可見(jiàn)，以尿道下裂及外傷為主的兒童尿道重建是一個(gè)復(fù)雜的難題，而組織工程化尿道為解決這個(gè)難題提供了一個(gè)初步可行但仍需繼續(xù)改進(jìn)的新方法[30]。總的來(lái)說(shuō)，已有臨床研究展示出了組織工程技術(shù)在兒童下尿路重建修復(fù)中的初步可行性和一定的短期成功率，但在遠(yuǎn)期成功率及并發(fā)癥方面仍不理想，整體效果尚未達(dá)到臨床前研究的預(yù)期。

三、臨床轉(zhuǎn)化失敗的主要原因

組織工程技術(shù)重建修復(fù)兒童下尿路從臨床前研究向臨床研究的轉(zhuǎn)化在已有研究中基本是失敗的，當(dāng)前面臨的問(wèn)題大致可總結(jié)如下：首先，臨床前研究常采用健康的動(dòng)物，不能準(zhǔn)確模擬病態(tài)組織的結(jié)構(gòu)和功能。健康動(dòng)物來(lái)源的細(xì)胞各種特性均正常；而有研究顯示，從先天性下尿路疾病患兒體內(nèi)分離培養(yǎng)的成熟細(xì)胞在體外增殖、分化、黏附及收縮能力等諸多方面都會(huì)有別于正常細(xì)胞，甚至還有可能繼承和傳遞某些病理特征，這對(duì)臨床應(yīng)用的效果可能會(huì)產(chǎn)生一定的影響[31-33]。因此，目前在健康動(dòng)物中取得的成功很難復(fù)制到患有先天性疾病的兒童中。其次，移植物的血供沒(méi)有受到足夠重視。移植物用于重建時(shí)需與周?chē)M織通過(guò)緩慢的芽生方式建立血運(yùn)才可存活，而組織內(nèi)氧氣擴(kuò)散的最大距離只有100～200 μm，這勢(shì)必會(huì)影響移植物的存活與重建效果，尤其是對(duì)于面積或體積大的移植物[34,35]。這一點(diǎn)從Atala等[21]研究中也可以看出，大網(wǎng)膜作為目前常用的體內(nèi)血管床，包裹移植物后可以明顯提高膀胱重建修復(fù)的效果。目前，臨床前研究已探索出多種有效改善移植物血供的方法，但由于受各種因素限制尚未應(yīng)用到臨床研究中。此外，目前研究多注重結(jié)構(gòu)重建，而忽略了功能恢復(fù)。功能重建對(duì)于膀胱來(lái)說(shuō)尤為重要，膀胱除了像尿道一樣需要具備一定的結(jié)構(gòu)和容量，還需要有合適的充盈以及收縮能力,重建后膀胱功能缺失會(huì)帶來(lái)很多并發(fā)癥。因此，通過(guò)各種手段(如利用干細(xì)胞或生長(zhǎng)因子在分子水平調(diào)控移植物的生長(zhǎng)環(huán)境)促進(jìn)重建組織功能恢復(fù)也很重要[36]。最后，長(zhǎng)期隨訪(fǎng)對(duì)于兒童尤為重要。兒童是一個(gè)特殊的群體，其生理特點(diǎn)對(duì)重建組織提出了很高的要求，如良好的生長(zhǎng)潛能、穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)與成分以及長(zhǎng)期的使用壽命等[37]。以膀胱重建為例，成年患者重建后的膀胱只需獲得可維持的容量及順應(yīng)性提升即可，而對(duì)于兒童重建后的膀胱還需要具備與年齡增長(zhǎng)相匹配的生長(zhǎng)能力。這也是目前臨床研究面臨的問(wèn)題，雖然目前從短期來(lái)看效果尚可，但長(zhǎng)期效果遠(yuǎn)未能達(dá)到滿(mǎn)意。

四、啟示與策略

臨床轉(zhuǎn)化失敗迫使尿路組織工程研究做出改變。首先，臨床前研究應(yīng)當(dāng)使用患有相應(yīng)疾病的動(dòng)物模型。兒童下尿路重建修復(fù)以各種先天性疾病最為常見(jiàn)，因此在臨床前研究中不能簡(jiǎn)單地選用尿路機(jī)械性損傷或部分切除的動(dòng)物模型，而要選用具有相應(yīng)原發(fā)疾病的動(dòng)物模型。目前，很多小兒泌尿外科疾病都有了成熟的動(dòng)物模型，如神經(jīng)源性膀胱、尿道下裂及膀胱梗阻等[38-40]。此外，大動(dòng)物比小動(dòng)物更適合組織工程研究，因?yàn)槠涓苣M人體狀態(tài)[41]。因此，臨床前研究中動(dòng)物模型的選擇應(yīng)由健康動(dòng)物模型向患病動(dòng)物模型、從小動(dòng)物向大動(dòng)物逐漸轉(zhuǎn)變，這樣才能更好地向臨床研究轉(zhuǎn)化。

其次，需要充分利用干細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)。干細(xì)胞除了能定向分化、促進(jìn)組織血管化、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)等以外，其分化而來(lái)的平滑肌細(xì)胞在組織工程中的應(yīng)用效果似乎也比成熟的平滑肌細(xì)胞更好[42,43]。有研究顯示脊柱裂患兒來(lái)源的干細(xì)胞與健康個(gè)體來(lái)源細(xì)胞的再生潛能相似，這一點(diǎn)對(duì)于兒童有著重要的意義，因?yàn)閮和履蚵啡睋p以先天性疾病為主，其來(lái)源的成熟細(xì)胞相比于正常細(xì)胞，多種能力有明顯差異，且很可能會(huì)繼承和傳遞某些病理特征，進(jìn)而影響工程化組織的使用效果。因此，在兒童下尿路組織工程中使用干細(xì)胞似乎可以避免成熟自體細(xì)胞帶來(lái)的弊端[44]。此外，多種來(lái)源的干細(xì)胞(如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞等)都已被用于臨床前研究，豐富了種子細(xì)胞的來(lái)源，并且一些新興的、可以無(wú)創(chuàng)獲取的干細(xì)胞(如尿源性干細(xì)胞)降低了取材的難度，減輕了創(chuàng)傷[45-47]。

第三，血供不僅關(guān)系著移植物的存活，更決定了其結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)的程度。目前，在臨床前研究中促進(jìn)血管化的手段有很多，除了調(diào)節(jié)支架特性及應(yīng)用生長(zhǎng)因子等傳統(tǒng)方法以外，很多研究將種子細(xì)胞和血管生成相關(guān)的細(xì)胞如內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮祖細(xì)胞等共培養(yǎng)，并取得了很好的效果[48,49]。內(nèi)皮細(xì)胞可與間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞等多種細(xì)胞共培養(yǎng)，還可以包裹在兩層細(xì)胞膜片之間，這樣構(gòu)建的細(xì)胞膜片在移植前就具備了豐富的內(nèi)部微血管網(wǎng)絡(luò)[50-53]。此外，還有研究者嘗試了將預(yù)血管化后的移植物連同其下方軸心血管一同移植的方法，將構(gòu)建的組織先在含軸心血管的體內(nèi)或體外生物反應(yīng)器中預(yù)血管化，離斷軸心血管后隨組織一起移植并與宿主大血管相吻合[52,54]。Sekine等[52]研究結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)的細(xì)胞膜片在體外生物反應(yīng)器預(yù)血管化后會(huì)提高其活性，而移植時(shí)軸心血管吻合會(huì)大幅提升這一效果。由此可見(jiàn)，在組織內(nèi)預(yù)先構(gòu)建微血管網(wǎng)絡(luò)固然重要，但更重要的是能及時(shí)將這些微血管網(wǎng)絡(luò)通過(guò)大血管與宿主的循環(huán)系統(tǒng)連接起來(lái)。

第四，生長(zhǎng)因子能促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化及組織結(jié)構(gòu)和功能的再生，對(duì)組織工程有重要的促進(jìn)作用。但生長(zhǎng)因子在體內(nèi)很不穩(wěn)定，因此實(shí)現(xiàn)可控、緩慢釋放才能使其持續(xù)發(fā)揮作用。目前，多種由天然材料或者合成材料構(gòu)建的支架都可以實(shí)現(xiàn)將生長(zhǎng)因子包裹后在體內(nèi)緩慢釋放[55,56]。此外，針對(duì)無(wú)支架的細(xì)胞膜片，有研究者設(shè)計(jì)了一種能包裹血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的纖維墊，將其加蓋在六層心肌細(xì)胞膜片上可以實(shí)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子緩慢釋放[57]。這些控制生長(zhǎng)因子在體內(nèi)緩慢釋放的方法在組織工程中有很好的應(yīng)用前景。

最后，組織重建修復(fù)過(guò)程中細(xì)胞間相互作用和信號(hào)通路等問(wèn)題應(yīng)當(dāng)被重視并加以利用。以巨噬細(xì)胞為例，它分為有促炎作用的M1型和有抗炎作用的M2型，是組織血管化和功能重建的重要參與者[58]。在移植前期M1型占主導(dǎo)地位可以促進(jìn)血管生成，而在移植后期M2型占主導(dǎo)地位可以促進(jìn)組織功能恢復(fù)及減少瘢痕形成[59]。因此，通過(guò)改變支架性質(zhì)或應(yīng)用生長(zhǎng)因子等方法調(diào)節(jié)不同時(shí)期兩型巨噬細(xì)胞的表達(dá)，可以促進(jìn)移植物結(jié)構(gòu)和功能的重建[60]。此外，有研究者發(fā)現(xiàn)BAM單獨(dú)使用和聯(lián)合ADSCs重建膀胱時(shí)，重建的組織在基因表達(dá)和信號(hào)通路上存在較大的差異，說(shuō)明ADSC能通過(guò)多條信號(hào)通路改變膀胱愈合的分子機(jī)制，這些信號(hào)通路可以作為促進(jìn)尿路重建修復(fù)效果的靶點(diǎn)[61]。

五、小結(jié)與展望

綜上所述，多種支架材料和細(xì)胞已經(jīng)被用于兒童下尿路組織工程研究，并且在臨床前研究中取得了不錯(cuò)的效果，但臨床前研究向臨床研究轉(zhuǎn)化的初步結(jié)果不理想，雖然體現(xiàn)出了初步的可行性，但在遠(yuǎn)期成功率和并發(fā)癥方面的表現(xiàn)遠(yuǎn)不如傳統(tǒng)手術(shù)。轉(zhuǎn)化失敗的原因主要包括：常選擇健康的動(dòng)物模型，缺少?gòu)男?dòng)物向大動(dòng)物的過(guò)渡；未重視移植物的血供；注重結(jié)構(gòu)重建而忽略了功能恢復(fù)；缺少長(zhǎng)期隨訪(fǎng)等。針對(duì)這些問(wèn)題，很多解決策略也應(yīng)運(yùn)而生，如應(yīng)用患有相應(yīng)疾病的動(dòng)物模型，發(fā)揮干細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)，移植物預(yù)血管化或帶血管蒂移植，使用能可控緩慢釋放生長(zhǎng)因子的“智能支架”，深入研究組織再生過(guò)程中的細(xì)胞間相互作用及分子機(jī)制等。但有一點(diǎn)可以肯定的是，單用一種方法很難解決目前的問(wèn)題，只有綜合多種方法才能實(shí)現(xiàn)最終的臨床應(yīng)用。

組織工程技術(shù)在兒童下尿路重建修復(fù)中已經(jīng)顯示出了初步的可行性和一定的短期成功率，它作為一種新興技術(shù)具有良好的發(fā)展前景。隨著研究的逐漸深入以及研究者們對(duì)組織工程技術(shù)和兒童下尿路重建修復(fù)認(rèn)識(shí)的逐漸增加，工程化組織的效果會(huì)越來(lái)越好，并且可能最終完全替代自體組織。