虎雪蘭與朱砂蘭、蕙蘭正反交育種及種子無菌萌發(fā)與增殖研究

李慧敏等

摘要 [目的]研究虎雪蘭與朱砂蘭、蕙蘭正反交育種及種子無菌萌發(fā)與增殖。[方法]以虎雪蘭、朱砂蘭、蕙蘭‘綠春蘭為親本，采用正反交雜交法進(jìn)行育種試驗(yàn)得到果實(shí)，對(duì)成熟的種子進(jìn)行無菌萌發(fā)試驗(yàn)，并對(duì)種子萌發(fā)獲得的小苗進(jìn)行增殖研究。[結(jié)果]朱砂蘭為母本獲得雜交種子無菌萌發(fā)最適培養(yǎng)基為：1/2MS+0.5 mg/L BA+0.2 mg/L NAA+3%花寶1號(hào)+0.05%碳粉；最佳增殖及生長(zhǎng)培養(yǎng)基為：1/2MS+1.0 mg/L 6BA+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L KT+3%花寶4號(hào)+0.05%碳粉。蕙蘭‘綠春蘭為母本獲得種子萌發(fā)最適培養(yǎng)基為：1/2MS+1.0 mg/L 6BA+0.5 mg/L NAA+3%花寶1號(hào)+0.05%碳粉；最佳增殖及生長(zhǎng)培養(yǎng)基為1/2MS+1.5 mg/L 6BA+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L KT+3%花寶4號(hào)+0.05%碳粉。[結(jié)論]該方法為虎雪蘭的種質(zhì)資源栽培提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 虎雪蘭；種間雜交；無菌萌發(fā)；增殖；不親和性

中圖分類號(hào) S682.31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）13-03812-03

Abstract [Objective] This paper aims to study the aseptic budding and fast propagation on Cymbidium tracyanum var huanghua×Cymbidium mastersii interspecific hybridization seed. [Method] Cymbidium tracyanum var huanghua， Cymbidium mastersii and Cymbidium faberi Rolfe ‘Lv Chun Lan were employed as parents. The hybrid seeds were tested using direct crossing and reciprocal crossing， then germinated and compared with different medium in axenic culture. [Result] The results show that the best medium for the seeds of Cymbidium mastersii in axenic culture is 1/2MS+0.5 mg/L BA+0.2 mg/L NAA+3% Hyponex 1+0.05%C， the best medium for multiplication culture and differentiation is 1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+ 0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L KT+3% Hyponex 4+0.05%C. The medium for the seeds of Cymbidium faberi Rolfe ‘Lv Chun Lan in axenic culture is 1/2MS+1.0mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+3% Hyponex 1+0.05%C， the best medium for multiplication culture and differentiation is 1/2MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L KT+3%Hyponex+0.05%C. [Conclusion] This method provides a theoretical basis for the germplasm resource cultivation of Cymbidium tracyanum var huanghua×Cymbidium mastersii.

Key words Cymbidium tracyanum var huanghua×Cymbidium mastersii； Interspecific hybridization； Aseptic germination； Propagation； Incompatibility

廣義的蘭花是指蘭科（Orchidaceae）植物，但中國人傳統(tǒng)上所稱的蘭花常常是指具有較高觀賞價(jià)值的蘭屬植物。隨著我國人民生活水平的不斷提高和消費(fèi)觀念的逐步轉(zhuǎn)變，追求高雅健康的蘭文化已經(jīng)成為一種時(shí)尚和潮流。只有新品種、高質(zhì)量蘭花的推出才能進(jìn)一步促進(jìn)蘭花市場(chǎng)的發(fā)展。然而蘭花遠(yuǎn)緣雜交育種因遺傳差異顯著而難度較高，雜交成功后的F1代變異性也較大。蘭花生長(zhǎng)緩慢，育種周期較長(zhǎng)，技術(shù)難點(diǎn)多，必須長(zhǎng)期堅(jiān)持才能取得成效。不少科技工作者對(duì)蘭花育種、種子萌發(fā)進(jìn)行過研究[1-4]。蘭花種子萌發(fā)是雜交育種的一個(gè)技術(shù)難點(diǎn)，而在組織培養(yǎng)條件下的無菌萌發(fā)是主要的途徑之一。試驗(yàn)利用人工雜交育種方式和組織培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)虎雪蘭與朱砂蘭、蕙蘭雜交種子進(jìn)行無菌萌發(fā)和生長(zhǎng)分化研究，以期為探索蘭花人工雜交育種技術(shù)，培育具有一定特色的新品種，同時(shí)為蘭花種子無菌萌發(fā)及生長(zhǎng)提供一定的理論參考，也為以后利用化學(xué)、物理誘變甚至基因工程創(chuàng)立新種質(zhì)提供一定的技術(shù)方法和物質(zhì)基礎(chǔ)；而且，對(duì)保護(hù)和利用優(yōu)異蘭花種質(zhì)資源，變資源優(yōu)勢(shì)為經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)和促進(jìn)云南省蘭花走向世界都具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象。供試材料均由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)花卉研究所提供，為沉香虎頭蘭黃色素花與大雪蘭雜交的新品種“虎雪蘭”和朱砂蘭、蕙蘭“綠春蘭”。

1.2 方法

1.2.1 虎雪蘭與朱砂蘭、蕙蘭‘綠春蘭正反交。試驗(yàn)地點(diǎn)為云南農(nóng)業(yè)大學(xué)花卉研究所，于2011年11月在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)花卉所溫室內(nèi)展開。挑選生長(zhǎng)健壯、無病蟲害的親本植株，采用正反雜交方法。選擇在晴天，花朵開放2 d后的下午3：00進(jìn)行授粉。授粉前先去除花粉塊頂端的藥帽，去除過程需謹(jǐn)防花粉塊掉落，把花粉塊用鑷子輕輕取下放入干燥的燒杯中備用；然后將父本的花粉塊置于母本的蕊腔中，再把母本上取下的花粉塊置于父本的蕊腔中。授粉完成后，清晰標(biāo)注雜交組合名稱、雜交時(shí)間，授粉花朵數(shù)等。授粉之后對(duì)植株加強(qiáng)水肥管理并觀察果實(shí)發(fā)育情況并記錄結(jié)實(shí)率。

1.2.2 蒴果消毒。果實(shí)由深綠色轉(zhuǎn)變成淡黃綠色時(shí)，挑選尚未開裂的飽滿蒴果進(jìn)行無菌播種試驗(yàn)。首先對(duì)蘭花蒴果進(jìn)行表面消毒，先采用10%～15%的次氯酸鈉水溶液浸泡10～15 min后用無菌水沖洗2～3次，再采用濃度0.1%升汞（HgCl2）浸泡5～10 min后，用無菌水沖洗4～5次。

1.2.3 無菌萌發(fā)誘導(dǎo)。培養(yǎng)基使用MS、1/2MS培養(yǎng)基，加入按實(shí)驗(yàn)所需的不同濃度梯度和不同激素的配方以制作萌發(fā)誘導(dǎo)培養(yǎng)基。之后于無菌操作環(huán)境下，將蒴果橫置于徹底消毒過的培養(yǎng)皿內(nèi)，按“+”方式切開消毒后的蒴果，用鑷子將其移動(dòng)至培養(yǎng)基上方，使切口朝向培養(yǎng)基，并用鑷子輕輕敲打蒴果的外殼，將種子均勻分散并充分接觸于萌發(fā)誘導(dǎo)培養(yǎng)基表面以提高種子的成活率。最后將接種完成的培養(yǎng)基放在無菌培養(yǎng)室中進(jìn)行光培養(yǎng)，環(huán)境溫度保持在24～26 ℃，最適光照2 000 lx。按時(shí)觀察試驗(yàn)，記錄試驗(yàn)數(shù)據(jù)和現(xiàn)象。篩選出最適合雜交種子萌發(fā)的培養(yǎng)基和激素條件。

1.2.4 無菌體系建立。將種子萌發(fā)后形成的原球莖轉(zhuǎn)移到不同激素濃度梯度配方下的繼代培養(yǎng)基上，記錄試驗(yàn)數(shù)據(jù)和現(xiàn)象；篩選出最適合原球莖增殖的激素條件，建立快繁體系。培養(yǎng)條件與種子無菌萌發(fā)誘導(dǎo)相同。

2 結(jié)果與分析

2.1 正反交結(jié)果與分析 對(duì)3種蘭花雜交后生長(zhǎng)和發(fā)育進(jìn)行觀測(cè)，發(fā)現(xiàn)授粉4 d后，蕊柱的頂端開始膨大并開始下卷，分泌透明粘液，7～8 d后子房開始膨大，花瓣開始萎蔫，花朵開始收縮。一個(gè)星期后子房開始膨大。在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，以虎雪蘭為母本的雜交組合，子房膨大14 d后開始變黃，爾后整個(gè)脫落。由表1可知，以朱砂蘭、蕙蘭‘綠春蘭為母本，均獲得雜交果實(shí)，結(jié)實(shí)率為20.0%和37.5%。結(jié)實(shí)率較低，而以虎雪蘭為母本與朱砂蘭、蕙蘭‘春綠蘭進(jìn)行雜交均未獲得雜交果實(shí)。

3 討論

3.1 種間雜交不親和性 遠(yuǎn)緣雜交是種質(zhì)創(chuàng)新的有效途徑之一，但雜交的不親和性及雜種的不育性是遠(yuǎn)緣雜交育種遇到的2大障礙[5]。另外種間雜交成功與否還與花粉管是否能夠順利到達(dá)胚囊，釋放精子，雌雄配子體能否順利結(jié)合以及受精后胚和胚乳是否能夠協(xié)調(diào)一致的生長(zhǎng)等一系列因素有關(guān)。研究表明，雌雄配子體結(jié)合后胚與胚乳生長(zhǎng)不協(xié)調(diào)，胚囊已經(jīng)解體或者胚乳供給營養(yǎng)不足等原因也會(huì)使雌蕊脫落[6]。試驗(yàn)中以虎雪蘭為母本的雜交組合，與果莢膨大至一定大小后出現(xiàn)果柄枯黃脫落現(xiàn)象，與張志勝等對(duì)墨蘭和大花蕙蘭種間雜交表現(xiàn)一致[4]，表現(xiàn)為受精后雜種不育障礙。以朱砂蘭、蕙蘭‘綠春蘭為母本結(jié)實(shí)率相對(duì)低，種子萌發(fā)過程中時(shí)間較長(zhǎng)而且萌發(fā)率低。經(jīng)過分析得出主要原因是由雜交親和力較弱引起：朱砂蘭、蕙蘭‘綠春蘭都屬于國蘭，與虎雪蘭親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3.2 種子無菌萌發(fā)方法可行性較高 蘭花種子非常細(xì)小、呈粉狀，沒有胚乳，胚內(nèi)含有很少的營養(yǎng)物質(zhì)，因此在自然條件下萌發(fā)率都很低。為了滿足藥用及花卉的需要，提高萌發(fā)率，各國學(xué)者在蘭科植物種子無菌萌發(fā)方面進(jìn)行了大量研究。由于無菌播種克服了微生物的干擾，為種子萌發(fā)補(bǔ)充了必要的營養(yǎng)條件，使蘭花種子發(fā)芽率大大提高。試驗(yàn)借鑒前人經(jīng)驗(yàn)以及已有技術(shù)對(duì)虎雪蘭雜交種子的萌發(fā)進(jìn)行了研究，為雜交種子選出最佳組培配方，為今后建立蘭花繁育體系打下良好的基礎(chǔ)[1，4，7]。

3.3 培養(yǎng)基、激素配比需要與不同的蘭花材料以及生長(zhǎng)時(shí)期相對(duì)應(yīng) 基本培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)的重要基質(zhì)，由于每種植物的遺傳特性、生物學(xué)和生態(tài)學(xué)特性不同，所需的營養(yǎng)成分也不盡相同，對(duì)培養(yǎng)基的成分要求也存在差異[8-9]，要實(shí)現(xiàn)蘭花的快速繁殖，首先就必須對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，在不同階段，選擇適當(dāng)激素濃度。一般認(rèn)為中低濃度無機(jī)鹽（1/2MS）比較適合蘭花種子的萌發(fā)[10]。在試驗(yàn)中，雜交種子在培養(yǎng)基MS、1/2MS上培養(yǎng)下均能萌發(fā)，但是萌發(fā)率卻相差較大，在1/2MS培養(yǎng)基下萌發(fā)率較高、萌發(fā)時(shí)間相對(duì)較短，說明低鹽培養(yǎng)基較適合試驗(yàn)雜交種子的萌發(fā)，支持了此結(jié)論。

3.4 添加物和褐化問題的相關(guān)性 在培養(yǎng)基中添加適量的天然提取物有利于蘭花種子的萌發(fā)和生長(zhǎng)，研究在培養(yǎng)基中添加了8%的香蕉泥，但加入香蕉泥之后，由于添加物內(nèi)部激素的影響，促使植株活力降低，吸收能力減弱，導(dǎo)致葉色偏黃，苗體較弱，起不到很好的復(fù)壯作用，因此并不是所有的蘭花都適合此法。試驗(yàn)加入香蕉泥之后出現(xiàn)輕微褐化現(xiàn)象，轉(zhuǎn)而考慮使用一類具有吸附功能的添加劑活性炭。據(jù)報(bào)道，0.1%～0.5%活性炭對(duì)吸附酚類氧化物的效果很明顯[11]。試驗(yàn)中加入了0.05%碳粉，可以有效抑制褐化現(xiàn)象的出現(xiàn)。

試驗(yàn)以朱砂蘭、蕙蘭‘綠春蘭為母本，虎雪蘭為父本，成功得到果實(shí)。對(duì)成熟的種子進(jìn)行無菌萌發(fā)試驗(yàn)，并對(duì)種子萌發(fā)獲得的小苗進(jìn)行增殖研究。結(jié)果表明，低鹽的1/2MS培養(yǎng)基，利用花寶和碳粉，加入適當(dāng)濃度的BA、NAA和KT對(duì)蘭花種子萌發(fā)及種子萌發(fā)后得到的蘭花組培苗增殖有促進(jìn)作用。

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