苦瓜雙色平臍蠕孢葉斑病病原菌的生物學特性及其抑菌藥劑篩選

秦健 黃如葵 黃熊娟 劉杏連 梁家作 琚茜茜 黃玉輝

摘? 要：為了明確苦瓜雙色平臍蠕孢葉斑病菌（Bipolaris bicolor）的生物學特性及其對殺菌劑的敏感性，研究了不同培養(yǎng)條件對該病原菌菌絲生長的影響，并測定了10種殺菌劑對該病原菌的抑制作用。結果表明：該病原菌菌絲生長最適溫度為25～30 ℃，最適pH范圍為6～7，適宜培養(yǎng)基為馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基（PSA）和玉米粉培養(yǎng)基（CMA），持續(xù)黑暗和光暗交替有利于菌絲生長;不同碳源和氮源對菌絲生長的影響差異顯著，其中葡萄糖和蛋白胨分別為最適碳源和氮源，菌絲生長致死溫度為45 ℃。250 g/L苯醚甲環(huán)唑乳油毒力最強，EC50為0.0233 mg/L，其次為250 g/L吡唑醚菌酯懸浮劑、20%抑霉唑水乳劑和50%嘧菌環(huán)胺水分散粒劑。

關鍵詞：苦瓜;葉斑病;雙色平臍蠕孢;生物學特性;毒力

中圖分類號：S436.429? ? ? 文獻標識碼：A

Abstract： To clarify the biological characteristics and sensitivity to different fungicides， the effects of different culture condition on the mycelial growth of Bipolaris bicolor were determined. The inhibitory activity of ten fungicides on B. bicolor were also studied. The optimum temperature and pH for the mycelial growth was 25-30 ℃ and pH 6-7， respectively. PSA and CMA medium were the appropriate medium for hyphal growth. Continuous darkness condition and the alternation of light and darkness were beneficial to mycelial growth. Effects for carbon and nitrogen sources on mycelial growth were significantly different， and the optimal carbon and nitrogen source was dextrose and peptone， respectively. The lethal temperature of mycelia was 45 ℃. The toxicity test showed that 250 g/L difenoconazole EC had the highest inhibitory activity with EC50 of 0.0233 mg/L among all fungicides， followed by 250 g/L pyraclostrobin SC， 20% imazalil EW and 50% cyprodinil WDG.

Keywords： Momordica charantia; leaf spot; Bipolaris bicolor; biological characteristics; toxicity

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.12.019

[]苦瓜（Momordica charantia L.）是重要的藥食兼用作物，苦瓜常見病害有白粉病、枯萎病和炭疽病等[1-3]，近年來，苦瓜蔓枯病時有發(fā)生[4]。近期，筆者在廣西南寧苦瓜基地發(fā)現(xiàn)一種苦瓜新的葉斑病，該病發(fā)生于苦瓜盛瓜期，發(fā)生率為3%～25%，該病害病斑剛開始表現(xiàn)為水漬狀小圓斑，嚴重時病斑擴大，引起葉片萎蔫，死亡，嚴重影響苦瓜植株生長。通過對病原菌的分離、純化、致病性測定，得到苦瓜葉斑病的致病菌株，命名為YB450101，觀察該菌株的菌落形態(tài)、孢子和孢子梗等特征，結合ITS-TEF-GPD基因測定結果將該病原菌鑒定為雙色平臍蠕孢菌（Bipolaris bicolor）[5]。

隨著作物栽培面積的增大，病蟲害發(fā)生為害的概率也相應地增加。雙色平臍蠕孢菌可以為害橡膠樹[6]、桃棕[7]、小麥[8]和牛筋草[9]等作物，但是，侵染苦瓜為首次報道，目前該病菌的生物學特性和藥劑篩選也未見報道。本研究開展雙色平臍蠕孢菌的生物學特性和室內(nèi)殺菌劑毒力研究，建立基礎數(shù)據(jù)庫，為該病害綜合防控提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 供試病原菌? 廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所實驗室保存的雙色平臍蠕孢菌（Bipolaris bicolor），命名為YB450101[5]。

1.1.2? 供試藥劑? 室內(nèi)藥劑毒力測定所用殺菌劑均為市售品種，具體信息見表1。

1.1.3? 供試培養(yǎng)基? 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基（PSA）、察氏培養(yǎng)基（Czapek）、燕麥片培養(yǎng)基（OMA）、玉米粉培養(yǎng)基（CMA）、碳或氮源基礎培養(yǎng)基和水瓊脂培養(yǎng)基（WA）[10]。

1.2? 方法

1.2.1? 病原菌生物學特性的測定? 溫度對菌絲生長的影響：用打孔器打取菌塊（d=7 mm），轉(zhuǎn)接到PDA平板上，分別置于5、10、15、20、25、28、30、35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5 d后用十字交叉法測量菌落直徑，每個處理重復3次，詳情參考鄭麗等[11]的方法。

pH對病原菌菌絲生長的影響：用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH溶液將PDA培養(yǎng)基的pH分別調(diào)配成4、5、6、7、8、9、10、11，采用上述接種方法，每個處理重復3次，28 ℃恒溫培養(yǎng)，5 d后用十字交叉法測量菌落直徑，詳情參考康迅等[10]的方法。

碳（氮）源對菌絲生長的影響：用含有相同碳元素質(zhì)量的蔗糖、可溶性淀粉、果糖、乳糖、麥芽糖、木糖、山梨醇置換基礎培養(yǎng)基中的葡萄糖，配制成不同碳源培養(yǎng)基。用含有相同氮元素質(zhì)量的氯化銨、硫酸銨、硝酸鈉、甘氨酸、半胱氨酸、尿素、蛋白胨、牛肉浸膏置換基礎培養(yǎng)基中的硝酸鉀，配制成不同氮源培養(yǎng)基。采用上述接種方法，每個處理重復3次，28 ℃恒溫培養(yǎng)，5 d后用十字交叉法測量菌落直徑，詳情參考康迅等[10]的方法。

光照對菌絲生長的影響：設24 h全光照、12 h光照+12 h黑暗及24 h全黑暗3種處理，采用上述接種方法，每個處理重復3次，28 ℃恒溫培養(yǎng)，5 d后用十字交叉法測量菌落直徑，詳情參考康迅等[10]的方法。

培養(yǎng)基對菌絲生長的影響：采用上述接種方法，接種于PDA、PSA、Czapek、OMA、CMA的平板中央，以WA平板作對照，每個處理重復3次，28 ℃恒溫培養(yǎng)，5 d后用十字交叉法測量菌落直徑，詳情參考康迅等[10]的方法。

病原菌菌絲致死溫度的測定：在滅菌的5 mL試管中加無菌水2 mL，分別加熱到40、45、50、55、60、65 ℃，將菌塊（d=7 mm）分別放入以上處理后的試管中并搖勻，處理10 min后取出試管冷卻至室溫，再將菌塊接種到PDA平板中央，以28 ℃為對照（CK），每個處理重復3次，28 ℃恒溫培養(yǎng)，5 d后用十字交叉法測量菌落直徑，詳情參考康迅等[10]的方法。

1.2.2? 病原菌室內(nèi)藥劑篩選? 采用菌絲生長速率法測定菌株對不同藥劑不同濃度的敏感性[12]。具體方法如下：稱取一定量的藥劑，加入無菌水，配制成某個濃度的母液，用移液槍取一定量母液加入到一定體積的PDA培養(yǎng)基中，配制5個濃度（有效成分濃度）梯度的含藥培養(yǎng)基平板，然后從純化的菌落邊緣打取菌餅（d=7 mm），接種，并以不含藥劑的處理為對照，28 ℃恒溫培養(yǎng)，菌落直徑為培養(yǎng)皿的2/3時，即測量菌落直徑，并計算抑菌率。每個處理4個重復。將藥劑濃度（mg/L）轉(zhuǎn)換成以10為底的對數(shù)值（x），菌絲生長抑制率換算成幾率值（y），并用DPS軟件求出各供試藥劑的毒力回歸方程、有效抑制中濃度（EC50）及相關系數(shù)r。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel軟件和DPS軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理和統(tǒng)計分析。

2? 結果與分析

2.1? 病原菌的生物學特性分析

2.1.1? 溫度對病原菌菌絲生長的影響? 試驗結果表明，在15～35 ℃范圍內(nèi)，病原菌菌絲均能生長。當溫度低于10 ℃時，菌絲停止生長，25～30 ℃生長最快，28 ℃時菌落直徑達78.50 mm。表明該病原菌最適生長溫度為25～30 ℃（圖1）。

2.1.2? pH對病原菌菌絲生長的影響? 不同pH對菌絲生長有不同程度的影響（圖2）。病原菌在pH為4～11的范圍內(nèi)，其菌絲均能生長。但是，當pH為4時，菌絲生長最緩慢，顯著慢于其他處理，菌落直徑僅為8.00 mm;pH為5或11時，菌絲生長也較為緩慢，菌落直徑為13.80～18.50 mm;pH為6或7時，菌絲生長最適宜，菌落直徑達62.80 mm或60.50 mm。適宜菌絲生長的pH范圍為6～9，最適pH為6～7。

2.1.3? 碳（氮）源對病原菌菌絲生長的影響? 不同碳源對病原菌菌絲生長的影響存在較大差異（圖3）。葡萄糖利用率最高，菌落直徑達79.20 mm，與果糖、麥芽糖、可溶性淀粉、乳糖和蔗糖相比未達差異顯著水平，但均顯著高于山梨醇中的菌落直徑。所以，葡萄糖是最有利于病原菌菌絲生長的碳源。

不同氮源對病原菌菌絲生長的影響也存在較大差異（圖4）。半胱氨酸、甘氨酸和氯化銨均不利于菌絲生長，其菌落直徑顯著低于其他處理。病原菌對蛋白胨利用率最高，菌落直徑為63.17 mm，其次為硫酸銨。由此可見，蛋白胨是最有利于病原菌菌絲生長的氮源。

2.1.4? 光照對病原菌菌絲生長的影響? 光照處理后，不同光照條件對病原菌菌絲生長略有差異（圖5）。在光暗交替或連續(xù)黑暗的條件下，病原菌的菌落直徑相當，在64.25～64.30 mm之間，并顯著高于連續(xù)光照的處理。因此，光暗交替或者連續(xù)黑暗更有利于病原菌的生長。

2.1.5? 培養(yǎng)基對病原菌菌絲生長的影響? 不同培養(yǎng)基對病原菌菌絲生長存在一定影響（圖6）。病原菌在PSA培養(yǎng)基上生長最好，菌落直徑達80.00 mm，但與CMA培養(yǎng)基上的菌落直徑相比未達差異顯著水平，OMA、Czapek和PDA培養(yǎng)基在生物統(tǒng)計學上處于同一水平并顯著高于WA培養(yǎng)基的菌落直徑。因此，PSA和CMA培養(yǎng)基最有利于病原菌菌絲生長。

2.1.6? 病原菌菌絲致死溫度的測定? 不同溫度對病原菌菌絲生長的影響見圖7。病原菌在超過45 ℃的水浴中處理10 min后，病原菌基本不能生長。由此說明，病原菌的致死溫度為45 ℃。

2.2? 不同藥劑對病原菌的抑菌效果

10種殺菌劑的毒力測定表明，不同殺菌劑對病原菌的毒力存在差異（表2）。其中，250 g/L苯醚甲環(huán)唑乳油毒力最強，EC50為0.0233 mg/L，其次為250 g/L吡唑醚菌酯懸浮劑、20%抑霉唑水乳劑和50%嘧菌環(huán)胺水分散粒劑，EC50分別為0.0246、0.0400和0.0518 mg/L。而23.4%雙炔酰菌胺懸浮劑毒力最差，EC50為20.4604 mg/L，其余藥劑的EC50為0.2086～1.5296 mg/L。

3? 討論

雙色平臍蠕孢菌可以侵染橡膠樹[6]、桃棕[7]、小麥[8]和牛筋草[9]等植物，然而侵染苦瓜，國內(nèi)外尚屬首次報道，該病菌的生物學特性和藥劑篩選也未見報道。該病害為害苦瓜，發(fā)生率為3%～25%，隨著苦瓜栽培面積的擴大，病菌的快速繁殖，該病害將會有大面積發(fā)生的趨勢。因此，開展該病害的生物學特性和藥劑篩選研究，了解病菌生長的環(huán)境條件，明確對病原菌具有較好防治效果的藥劑，從而制定相應的防治措施，對于防控該病害具有重要的意義。

本文對苦瓜葉斑病病原（Bipolaris bicolor）進行生物學特性測定。結果表明，該病原菌菌絲生長最適溫度為25～30 ℃，與狗牙根平臍蠕孢（B. cynodontis）[13]和稻平臍蠕孢（B. oryzae）[14]的結果相似，這與南寧地區(qū)5—9月病害發(fā)生為害直接相關;在pH為4～11的范圍內(nèi)，其菌絲均能生長，其中最適pH范圍為6～7，說明，弱酸堿至中性的環(huán)境條件下利于菌絲生長，與小麥根腐病菌（B. sorokiniana）[15]的結果相似;在馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基和玉米粉培養(yǎng)基中菌絲生長最快，碳源和氮源利用率最高為葡萄糖和蛋白胨，這與狗尾草平臍蠕孢（B. setariae）[16]的結果相似。持續(xù)黑暗和光暗交替有利于B. bicolor菌絲生長，說明菌絲生長對光照的要求不高;B. bicolor菌絲生長致死溫度為45 ℃，低于B. sorokiniana和B. setariae的致死溫度，說明B. bicolor對高溫比較敏感。

通過對苦瓜葉斑病病原菌的室內(nèi)藥劑篩選試驗，發(fā)現(xiàn)250 g/L苯醚甲環(huán)唑乳油毒力最強，EC50為0.0233 mg/L，其次為250 g/L吡唑醚菌酯懸浮劑、50%嘧菌環(huán)胺水分散粒劑和20%抑霉唑水乳劑。EC50數(shù)值越小，毒力回歸方程的斜率越大，表明隨著濃度的增大，該藥劑的抑制效果越明顯[17]。23.4%雙炔酰菌胺懸浮劑斜率較小，EC50數(shù)值較大，說明該藥劑抑菌效果較差。馮思琪[18]、房寬峰[19]、郭煒[20]研究發(fā)現(xiàn)苯醚甲環(huán)唑?qū). oryzae、B. australiensis、B. sorokinianum具有很好的抑制效果，說明三唑類（苯醚甲環(huán)唑）殺菌劑可能對平臍蠕孢屬普遍具有較強的抑制作用。另外，甲氧基丙烯酸酯類（吡唑醚菌酯）和嘧啶胺類（嘧菌環(huán)胺）殺菌劑對病原菌B. bicolor也具有很好的抑制作用。

此次藥劑篩選試驗，獲得了抑菌效果較好的3種不同類型藥劑，這對于防控該病害具有一定意義。但是，本研究僅為室內(nèi)平板試驗，由于田間生產(chǎn)中，藥劑的防治效果容易受到施藥時期、氣候、藥械和其他不可預計的因素的影響，因此，需要再進行田間防效試驗，以確定哪些藥劑為田間防治該病害的首選藥劑。

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