香蕉枯萎病菌分子檢測研究進(jìn)展

楊迪 杜嬋娟 葉云峰 彭軍 張欣 付崗

摘? 要：香蕉枯萎病是全世界香蕉產(chǎn)業(yè)共同面臨的毀滅性病害，但目前生產(chǎn)上仍缺乏適宜的抗病品種和有效的治療措施。因此，借助快速準(zhǔn)確的枯萎病菌檢測技術(shù)及時明確病原菌以控制該病的傳播和蔓延顯得尤為重要。本文回顧了近年來國內(nèi)外香蕉枯萎病菌分子檢測技術(shù)的發(fā)展歷程，歸納和總結(jié)了DNA指紋圖譜、普通PCR、多重PCR、熒光定量PCR及等溫擴(kuò)增技術(shù)在該病菌檢測中的研究進(jìn)展，分析了不同檢測技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)，并指出可能存在的問題和研究發(fā)展方向，為該病的分子檢測技術(shù)優(yōu)化和防控策略制定提供參考。

關(guān)鍵詞：香蕉枯萎病;尖孢鐮刀菌古巴?；?分子檢測

中圖分類號：S436.68+1? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Abstract： Banana Fusarium wilt is a devastating disease in global banana industry. At present， there is still no available measures can be used for curing this disease， and lack of suitable resistant varieties. So， it is very important that developing the rapid and accurate detection technology in order to slow down the spread speed of banana Fusarium wilt in the field. In this paper， the development of molecular detection techniques on Fusarium oxysporum f. sp. cubense was reviewed. The detection technology based on DNA fingerprinting， general PCR， multiplex PCR， fluorescence quantitative PCR and isothermal amplification were summarized. The advantages and disadvantages of different detection technologies were analyzed. Futhermore， the problems lied in detection of this pathogen and possible research directions in the future were pointed out.

Keywords： banana Fusarium wilt; Fusarium oxysporum f. sp. cubense; molecular detection

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.12.029

香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌古巴專化型（Fusarium oxysporum f. sp. cubense， Foc）侵染引起的檢疫性土傳病害[1]。該病于1874年首次在澳大利亞發(fā)現(xiàn)，1910年在巴拿馬大爆發(fā)，直接導(dǎo)致巴拿馬乃至整個中南美洲香蕉產(chǎn)業(yè)的衰退。隨后，抗病品種‘香芽蕉（Cavendish， AAA）的種植和推廣使世界香蕉產(chǎn)業(yè)重新煥發(fā)生機(jī);但20世紀(jì)后期香蕉枯萎病菌4號生理小種的出現(xiàn)，使香蕉產(chǎn)業(yè)再次面臨巨大威脅[2-4]。

香蕉枯萎病菌依據(jù)寄主致病性分為1號（Race 1， R1）、2號（Race 2， R2）和4號生理小種（Race 4， R4）。根據(jù)不同侵染條件，4號小種又分為熱帶4號（Tropical Race 4， TR4）和亞熱帶4號（Subtropical Race 4， STR4）。其中R1和R2侵染粉蕉，R4可侵染幾乎所有栽培蕉[5-8]。因缺乏有效藥劑和抗病品種，該病在生產(chǎn)上極難控制[9-11];因此，快速準(zhǔn)確地檢測該病的病原菌以便及時采取銷毀、隔離措施阻止該病的傳播和蔓延至關(guān)重要。

依靠傳統(tǒng)方式分離、接種、鑒定病原菌耗時耗力，且需要經(jīng)驗(yàn)豐富的研究人員才能完成[12-17]。隨著PCR技術(shù)與高通量測序技術(shù)的發(fā)展，各種基于基因序列特征的分子快速檢測技術(shù)逐漸應(yīng)用于香蕉枯萎病菌的檢測[18-19]。與傳統(tǒng)檢測方法相比，分子檢測技術(shù)更加高效便捷，在生產(chǎn)上更具實(shí)用價值[20-21]。本文對國內(nèi)外近年來香蕉枯萎病菌分子檢測技術(shù)的研究進(jìn)展進(jìn)行分析和梳理，并提出存在的問題和將來可能的研究方向，以期為香蕉枯萎病菌的快速檢測研究提供借鑒。

1? 基于DNA指紋圖譜的香蕉枯萎病菌檢測

1990年John等[22]首先提出了AP-PCR技術(shù)，利用隨機(jī)引物擴(kuò)增獲得多態(tài)性DNA指紋圖譜，為菌株的分子鑒定提供了一種有效方法。Bentley等[23-24]首次將該技術(shù)應(yīng)用于香蕉枯萎病菌檢測，通過分析11株澳大利亞Foc菌株的DNA多態(tài)性圖譜，發(fā)現(xiàn)根據(jù)基因組特異性帶型對菌株進(jìn)行分組的結(jié)果與之前基于寄主范圍、營養(yǎng)親和群（vegetative compatibility groups， VCGs）、電泳核型分析和揮發(fā)性化合物色譜圖的分組結(jié)果一致。隨后該研究組擴(kuò)大測試菌株的樣本量和來源范圍，進(jìn)一步驗(yàn)證了DNA指紋圖譜與生理小種和VCGs的相關(guān)性，建立了香蕉枯萎病菌的DNA指紋圖譜檢測方法[25-27]。Gerlach等[28]采用DNA指紋圖譜技術(shù)對澳大利亞分屬于4個生理小種和8個VCGs的94株Foc菌株進(jìn)行測試，發(fā)現(xiàn)DNA指紋圖譜具有VCG特異性，并且利用不同電泳帶型可以區(qū)分出與3個生理小種相對應(yīng)的VCG群。劉景梅等[29]使用2個隨機(jī)引物對廣東18個Foc菌株進(jìn)行分析，也證實(shí)了Foc R1和Foc R4的DNA圖譜存在差異，而同一小種內(nèi)菌株的RAPD電泳譜帶差異較小，說明DNA指紋圖譜可用于Foc生理小種的檢測。謝藝賢等[30]對分離自海南、廣東的18個Foc菌株進(jìn)行RAPD圖譜分析，結(jié)果表明RAPD圖譜可區(qū)分Foc R1和Foc R4以及菌株地理來源和致病力。同年該研究組分別篩選到2個生理小種的RAPD圖譜特征條帶，可用于Foc生理小種的檢測[31]。

盡管許多研究表明，DNA指紋圖譜可以區(qū)分Foc R1和Foc R4[29-31]，但該方法仍存在擴(kuò)增條帶多、帶型難以重復(fù)、易受環(huán)境及人為操作影響等問題。因此，該技術(shù)在檢測實(shí)用性上仍有局限性。

2? 基于香蕉枯萎病菌特定DNA區(qū)段的PCR定性檢測

隨著測序技術(shù)和PCR技術(shù)的不斷發(fā)展，利用特異性引物對Foc進(jìn)行定性檢測的技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。該技術(shù)利用不同F(xiàn)oc生理小種的特定DNA區(qū)段設(shè)計特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過是否產(chǎn)生特異性條帶判斷目標(biāo)菌的有無，檢測結(jié)果更易判定。

2.1? 香蕉枯萎病菌的普通PCR檢測

早期的香蕉枯萎病菌PCR檢測通常依據(jù)不同生理小種或VCG群的RAPD特異性條帶的SCAR分子標(biāo)記來設(shè)計引物進(jìn)行鑒定。劉景梅等[32]利用RAPD技術(shù)對廣東的18個Foc菌株進(jìn)行分析，成功將4個RAPD標(biāo)記簡化為SCAR標(biāo)記，準(zhǔn)確鑒定出廣東蕉區(qū)的Foc R1和Foc R4。葉建軍等[33]利用SCAR標(biāo)記與ITS序列分析相結(jié)合的方法對Foc R4菌株進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)一步提高了檢測的準(zhǔn)確性。Lin等[34]通過隨機(jī)引物OP-A02對臺灣地區(qū)的Foc R4菌株進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)生的特異性DNA片段設(shè)計引物Foc-1/Foc-2，檢測下限可達(dá)10 pg基因組DNA。廖林鳳等[35]采用RAPD技術(shù)對廣東、廣西的30個Foc菌株和3個尖孢鐮刀菌不同?；途赀M(jìn)行比較及聚類分析，將1個RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，建立了Foc R4號生理小種快速檢測技術(shù)，檢測靈敏度為2 ng新鮮菌絲，并可對染病植株的不同部位進(jìn)行檢測。

利用SCAR標(biāo)記設(shè)計引物進(jìn)行檢測和DNA指紋圖譜相比，結(jié)果更易于判定，但SCAR標(biāo)記在基因組上的定位不確定，因此許多學(xué)者選擇利用菌株的保守區(qū)段設(shè)計特異性引物，以提高檢測結(jié)果的穩(wěn)定性。王國芬等[36]依據(jù)Foc的ITS序列設(shè)計合成2對引物A（Fus F1/R1）和B（Fus F1/R2），其對目標(biāo)菌株的檢測下限分別達(dá)100 fg和10 pg;其中引物A對Foc菌絲體基因組檢測能力較強(qiáng)，而引物B對感病組織有較好的檢測能力，可應(yīng)用于病原菌的檢測和田間香蕉枯萎病的早期鑒定。Dita等[37-38]基于IGS區(qū)域存在的2個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)開發(fā)了用于檢測Foc TR4（VCG01213）的PCR引物。采用該引物對土壤和染病香蕉組織進(jìn)行檢測，可以檢出所有感染樣品中的Foc TR4。Li等[39]同樣依據(jù)該區(qū)段的差異設(shè)計了可檢測Foc TR4的特異性引物。

基于Foc基因組的保守區(qū)段設(shè)計引物，雖然能對Foc進(jìn)行區(qū)分，但是對不同生理小種的區(qū)分有一定局限，往往還需要借助其他特征標(biāo)記作為輔助。因致病性相關(guān)基因位點(diǎn)只存在于某種特定致病性菌株中，因此，利用與致病性相關(guān)位點(diǎn)設(shè)計引物，理論上可以更精準(zhǔn)地區(qū)分不同致病性的生理小種。2013年Li等[40]通過鑒定Foc TR4突變株W2987的突變位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)1個假定毒力基因位點(diǎn)，并依據(jù)該基因區(qū)段設(shè)計引物用于檢測Foc TR4。該引物在香蕉染病組織和被病原菌污染的土壤樣品中均可檢出Foc TR4，檢出限為0.001 ng/?L基因組DNA和40個孢子/g土壤。這是毒力相關(guān)基因位點(diǎn)首次應(yīng)用于Foc生理小種的檢測。2014年Fraser-Smith研究組[41]對Foc不同生理小種的致病相關(guān)基因SIX8進(jìn)行了鑒定，檢測出2個SIX8基因同系物（Foc-SIX8a和Foc-SIX8b），并依據(jù)此基因位點(diǎn)設(shè)計引物用于檢測Foc R4和Foc STR4。此后，該研究組以SIX效應(yīng)基因?yàn)榘悬c(diǎn)，開發(fā)出一組引物，分別可擴(kuò)增Foc R1中的SIX6基因、Foc TR4中的SIX1基因、Foc STR4中的SIX8基因、Foc VCG 0121中的SIX9/SIX10基因和Foc VCG 0122中的SIX13基因，并通過限制性酶切的方法區(qū)分SIX1和SIX13基因擴(kuò)增產(chǎn)物，從而構(gòu)建了一套可以準(zhǔn)確檢測Foc R1、Foc STR4和Foc TR4以及Foc VCG 0121和Foc VCG 0122的方法[42]。2016年楊臘英等[43]分析了來自不同地區(qū)的Foc菌株的SIX2基因序列，并依據(jù)該區(qū)段設(shè)計檢測Foc R4的特異性引物，檢測靈敏度可達(dá)5 pg/25 ?L，并可用于感病球莖組織的檢測。

2.2? 香蕉枯萎病菌的多重PCR檢測

多重PCR是在同一PCR反應(yīng)中添加多對引物，同時檢測不同靶標(biāo)序列的方法[44]。呂成偉等[45]基于Foc的ITS序列及不同生理小種的SCAR標(biāo)記設(shè)計特異引物PR1/PR2和ST1/ST2，建立了香蕉枯萎病菌生理小種的雙重PCR檢測方法，可同時檢測Foc R1和Foc R4，檢測靈敏度可達(dá)200 pg。Dita等[37]利用引物組EF-1/EF-2、Foc TR4特異性引物組及香蕉肌動蛋白引物組分別構(gòu)建了真菌和植物組織樣品中Foc TR4的多重PCR體系，以TEF-1α引物組和香蕉肌動蛋白引物組作為內(nèi)陽性對照，前者用來排除真菌樣品中的假陰性現(xiàn)象，后者用來排除香蕉組織樣品中的假陰性現(xiàn)象。李敏慧等[46]基于Foc R4疑似致病基因序列分別設(shè)計了可檢測Foc R1和Foc R4的特異性引物以及尖孢鐮刀菌的通用引物，建立了三重PCR方法，可同步檢測Foc R1和Foc R4，并用于香蕉組織及土壤中香蕉枯萎病菌的檢測。

相對于DNA指紋圖譜檢測，基于病菌特定DNA區(qū)段進(jìn)行定性檢測需要的模板量較少，擴(kuò)增出的條帶單一，提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，同時降低了檢測結(jié)果的判定難度，在生產(chǎn)實(shí)踐中得到廣泛應(yīng)用。多重PCR可在同一體系中同時擴(kuò)增多個目標(biāo)基因，擴(kuò)增結(jié)果可作為內(nèi)部對照互相參考驗(yàn)證，一定程度上能避免假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，還可以節(jié)約時間及成本[37， 46]。但同一體系中存在多對引物，易相互干擾而出現(xiàn)多條帶或引物二聚體，影響結(jié)果的判斷;同時由于引物間競爭靶標(biāo)序列，靈敏度降低。這2種PCR方法在擴(kuò)增后均需通過凝膠電泳對產(chǎn)物進(jìn)行檢測，不能實(shí)時查看結(jié)果，也無法對病原菌進(jìn)行定量。

目前已報道的分子檢測方法均為基于病菌DNA序列的檢測，均需從香蕉植株中取一部分組織提取DNA，并且需要操作者具備一定程度的分子生物學(xué)或植物病理學(xué)研究背景。隨著多學(xué)科交叉研究的發(fā)展，基于物理圖譜的無損檢測技術(shù)將會是未來檢測技術(shù)開發(fā)的一個重要方向。2020年初，Lin等[67]將拉曼光譜應(yīng)用于田間感病香蕉的檢測，在無癥狀的Foc感染樣本中檢測到香蕉枯萎病菌的比率為76.2%，與其他分子檢測方法檢出率相當(dāng)。這一研究為田間香蕉枯萎病菌的檢測鑒定提供了新思路。隨著交叉學(xué)科研究的不斷深入，未來香蕉枯萎病的診斷將向更簡便智能的方向發(fā)展。同時，適用于一線農(nóng)技人員的便攜式物理無損檢測儀器和自動化檢測方法的開發(fā)，也將有助于進(jìn)一步擴(kuò)大香蕉枯萎病菌檢測的適用場景和范圍。

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