噻吩取代長(zhǎng)鏈查爾酮對(duì)腫瘤侵襲的抑制作用

趙松峰，張　珩，魏　涵，劉芝梅，張曉堅(jiān)，劉子維

(1. 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，河南 鄭州　450052；2. 武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北 武漢　430205；3. 人福醫(yī)藥集團(tuán)光谷生物城園區(qū)科福新藥公司，湖北 武漢　430074)

查爾酮是廣泛存在于自然界中一種黃酮類化合物，具有多種生物活性[1]。相對(duì)于黃酮的A/B環(huán)之間的吡喃酮的連接方式，查爾酮的A/B環(huán)之間以丙烯酮連接，在分子結(jié)構(gòu)上具有較大的柔性，因此，能與不同的受體結(jié)合，具有廣泛靶點(diǎn)效應(yīng)[2]。而多靶點(diǎn)的化合物容易產(chǎn)生過于廣泛的效應(yīng)[3]，查爾酮作為一個(gè)最小能級(jí)構(gòu)型為長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)的化合物，3個(gè)結(jié)構(gòu)單元為2個(gè)苯環(huán)和1個(gè)丙烯酮。增加1個(gè)分子單元，使得藥物分子的分子鏈長(zhǎng)度變?yōu)樵瓉淼?/3，增加了化合物所占有的空間位置，從而增強(qiáng)其特異性。同時(shí)引入官能團(tuán)能夠加強(qiáng)其對(duì)于特定靶點(diǎn)的作用力。

本研究的先導(dǎo)化合物TSAHC(Fig 1)為近羰基端的磺酰胺化的長(zhǎng)鏈查耳酮，被報(bào)道具有抑制腫瘤細(xì)胞侵襲的能力[4]，是通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloprotein, MMP)-2/9蛋白發(fā)揮作用[5]。本文以噻吩基團(tuán)為主要的近羰基端衍生結(jié)構(gòu)，通過Claisen-Schmidt縮合得到6個(gè)新的長(zhǎng)鏈類查耳酮化合物。通過抗腫瘤細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)確定作用濃度，采用Transwell實(shí)驗(yàn)評(píng)估其抗腫瘤遷移的能力，同時(shí)評(píng)估其對(duì)MMP-2蛋白的表達(dá)情況[6]。最后，通過SYBYL-X1.2進(jìn)行基于受體模式的分子對(duì)接預(yù)測(cè)。

細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)是一種維持細(xì)胞正常形態(tài)，保持細(xì)胞間正常接觸的重要物質(zhì)，廣泛分布于細(xì)胞中。相互交錯(cuò)并形成水樣的膠狀物[7]。腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位脫落，侵入ECM，分泌各種降解酶類，破壞ECM并進(jìn)入血管，并滲到其他部位，形成轉(zhuǎn)移灶。一般認(rèn)為，轉(zhuǎn)移度高的腫瘤細(xì)胞與其破壞ECM的能力密切相關(guān)[8]。多種酶被證實(shí)參與了侵襲的行為，而MMPs與ECM的降解被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素，在多種惡性腫瘤均可見MMPs表達(dá)水平的增高[9]。本研究基于先導(dǎo)化合物和抗腫瘤侵襲靶點(diǎn)MMP-2而進(jìn)行，結(jié)合分子藥理學(xué)與計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)，共同探究所得化合物的作用機(jī)制與構(gòu)效關(guān)系。

1　材料與方法

1.1化合物合成

1.1.1儀器與試劑由linux平臺(tái)支撐的SYBYL-X1.2軟件工作站；予華YRE-301型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；予華X-5型顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀；AVANCE III HD 400 MHz超導(dǎo)核磁共振譜儀 (Bruker公司)；LCMS-2010液質(zhì)聯(lián)用(Shimadzu公司)。氘代溶劑為DMSO-D6，CDCl3或MeOD，內(nèi)標(biāo)為TMS。TSAHC由人福醫(yī)藥集團(tuán)-科福新藥公司合成并提供，HPLC-DAD檢測(cè)純度>98%。起始化合物如無特別描述，均購自阿拉丁試劑。有機(jī)溶劑均為國藥試劑分析純或化學(xué)純。

Fig 1　Chemical reaction process and structure of TSAHC

1.1.2合成路線首先采用酰化反應(yīng)和酯化反應(yīng)，得到3個(gè)中間產(chǎn)物，然后將3個(gè)中間產(chǎn)物分別與鄰羥基苯甲醛和對(duì)甲氧基苯甲醛進(jìn)行羥醛縮合反應(yīng)，得到了6個(gè)新的近羰基端延長(zhǎng)的查耳酮類化合物，并進(jìn)行表征。反應(yīng)過程見Fig 1。

1.1.3酰胺和磺酰胺苯乙酮的合成取10 mmol的2-噻吩甲酸/2-噻吩磺酸與50 mmol的二氯亞砜混合置于圓底燒瓶中持續(xù)攪拌，室溫反應(yīng)過夜后，蒸掉多余的二氯亞砜，得到具有反應(yīng)活性的酰氯。向其中加入二氯甲烷溶解。而后將其滴加入含有10 mmol的4-氨基苯乙酮二氯甲烷溶液和5 mmol吡啶的混合溶液的圓底燒瓶中，冰浴反應(yīng)2 h，旋干多余溶劑，飽和NaHCO3溶液洗滌殘留物，最后用乙酸乙酯萃取飽和NaHCO3層3次，回收乙酸乙酯得到目標(biāo)苯乙酮。

1.1.4查爾酮的合成將三氟化硼乙醚溶液滴入含有1 mmol苯乙酮和1 mmol苯甲醛和10 mL二氧六環(huán)的圓底燒瓶中。80℃反應(yīng)14～24 h，旋干二氧六環(huán)，而后用乙酸乙酯萃取殘留物，然后依次用10% HCl溶液、蒸餾水、鹽水洗滌萃取液，再用無水Na2SO4干燥，真空濃縮，殘?jiān)M(jìn)行柱層析(正己烷 ∶乙酸乙酯=3 ∶1～1 ∶1)純化，最后得到產(chǎn)物為黃色固體。

1.2抗腫瘤侵襲活性評(píng)估

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)材料二甲基亞砜 (DMSO)、噻唑藍(lán) (MTT)為Sigma公司產(chǎn)品；人源乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231)由鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供；胰蛋白酶：美國Gibco公司；新生小牛血清：杭州四季青公司；DMEM培養(yǎng)基：奧浦邁公司；Transwell小室：美國Costar公司；Matrigel膠：美國BD公司。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)人源乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231)培養(yǎng)于添加了10%胎牛血清以及100 kU·L-1青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中；培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2，每隔2～3 d傳代1次，使細(xì)胞數(shù)目保持在1×108·L-1～1×109·L-1左右，生長(zhǎng)代數(shù)在30代以前，且臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)存活率大于95%的細(xì)胞方可用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3抗腫瘤細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)待MDA-MB-231細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%融合度時(shí)，將其接種至96孔板內(nèi)，接種密度為5×107·L-1，培養(yǎng)12 h，以不同濃度 (0.05、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、50.0 μmol·L-1) 的6種查耳酮化合物與TSAHC對(duì)照品，分別作用于MDA-MB-231細(xì)胞24 h。采用MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)法測(cè)定供試化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞株的抑制作用。用酶標(biāo)儀檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm。以0.1% DMSO為空白對(duì)照。存活率=(加藥組OD值/對(duì)照組OD值)×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4抗腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)Transwell法評(píng)價(jià)所制備查耳酮化合物對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的影響。當(dāng)MDA-MB-231細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80% 融合度時(shí)，取上述實(shí)驗(yàn)中所得的IC50值為培養(yǎng)濃度，共培養(yǎng)24 h。取200 μL不同劑量組細(xì)胞移至裝有8 μm孔徑的聚碳酸酯膜，直徑為13 mm的Transwell小室上室 (含2% FBS，1×105/室)，上室預(yù)鋪制20 μL Matrigel膠，下室加入含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，作用12 h后結(jié)晶紫染色，并對(duì)每組取3個(gè)不同的視野拍照。

1.2.5MMP-2蛋白表達(dá)的檢測(cè)將化合物1～6與陽性對(duì)照TSAHC，同0.1 % DMSO的空白對(duì)照組與細(xì)胞共培養(yǎng)后，胰酶消化，用預(yù)冷至4℃的裂解緩沖液加入到經(jīng)PBS漂洗的培養(yǎng)細(xì)胞中，冰上一段時(shí)間后離心，上清液保存于-20℃。采用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，SDS-PAGE 凝膠電泳分離。通過電轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)從SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，后者在含5%脫脂奶粉的TTBS中37℃封閉，加入MMP-2一抗 (Santa Cruz, CA) 4℃孵育過夜，TTBS充分漂洗，加入二抗37℃作用，TTBS充分漂洗，ECL顯色分析結(jié)果。

1.3分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)首先采用分子力學(xué)程序，對(duì)待測(cè)目標(biāo)化合物1～6進(jìn)行能量?jī)?yōu)化，加載Gasteiger-MMFF94 電荷，以Powell能量梯度法優(yōu)化得各個(gè)分子的低能穩(wěn)定構(gòu)象，保存入數(shù)據(jù)庫。而后根據(jù)文獻(xiàn)，從 Protein Data Bank 中選取MMP-2蛋白模型，加氫去水，修復(fù)殘基等操作確立適合對(duì)接的蛋白凹陷或殘基。采用SYBYL-X1.2軟件的DOCKING模塊，以Surflex-Dock GeomX 模式進(jìn)行對(duì)接，并同時(shí)計(jì)算出LogP值。

2　結(jié)果

2.1NMR譜圖分析(以活性最高的化合物2.3為例)從Fig 2A,2B共有的信號(hào)中，可以看出查耳酮化合物所特有高耦合常數(shù)的雙鍵dd峰，和噻吩環(huán)上的氫數(shù)目為1的兩個(gè)d峰和一個(gè)t峰。Fig 2A采用MeDO作為氘代溶劑，可以從圖中分辨出兩個(gè)苯環(huán)上的氫原子，其中一個(gè)苯環(huán)上具有典型的氫數(shù)目為4的dd峰，原子個(gè)數(shù)符合結(jié)構(gòu)式。但是由于MeDO的離子交換作用，在譜上找不到酰胺和間位羥基的氫信號(hào)。Fig 2B采用DMSO作為氘代溶劑，也可以從圖中分辨出兩個(gè)苯環(huán)上的氫原子，原子個(gè)數(shù)符合結(jié)構(gòu)式，其中在8.2左右可以明顯看出苯環(huán)上的dd峰，并可在低場(chǎng)找到兩個(gè)數(shù)目為1的氫信號(hào)，分別為磺酰胺和間位羥基的氫信號(hào)，化合物結(jié)構(gòu)的詳細(xì)信息如下：

化合物1淡黃色固體，產(chǎn)率31%，熔點(diǎn): (209～212)℃ 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.63 (s, 1H), 8.26 (d, J=8.7 Hz, 2H), 8.10 (dd, J=23.1, 4.4 Hz, 3H), 7.88 (d, J=15.6 Hz, 1H), 7.67 (d, J=15.6 Hz, 1H), 7.50 (d, J=8.7 Hz, 2H), 7.32 (d, J=20.1 Hz, 2H), 7.30～7.19 (m, 2H), 6.88 (d, J=7.9 Hz, 1H)。MS(ES, m/z): 348.8 (ES-)。

化合物2淡黃色固體，產(chǎn)率36%，熔點(diǎn): 209～162℃ 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 8.01 (d, J=8.8 Hz, 2H), 7.74 (d, J=5.0 Hz, 1H), 7.65 (t, J=5.9 Hz, 3H), 7.34 (d, J=8.8 Hz, 2H), 7.28～7.17 (m, 2H), 7.13 (s, 1H), 7.10～7.05 (m, 1H), 6.87 (d, J=9.0 Hz, 1H). MS(ES, m/z): 347.8 (ES-)。

化合物3淡黃色固體，產(chǎn)率32%，熔點(diǎn): (159～162)℃ 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 10.55 (s, 1H), 9.63 (s, 1H), 8.20 (d, J=8.6 Hz, 2H), 8.10 (d, J=3.5 Hz, 2H), 8.02～7.79 (m, 4H), 7.64 (d, J=15.7 Hz, 1H), 7.29 (dd, J=20.5, 6.2 Hz, 3H), 6.88 (d, J=7.7 Hz, 1H). MS(ES, m/z): 383.8 (ES-)。

化合物4淡黃色固體，產(chǎn)率28%，熔點(diǎn): (159～162) ℃ 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.99 (d, J=

Fig 2　NMR of compound 2(A) and 3(B)

8.5 Hz, 2H), 7.81 (d, J=15.6 Hz, 1H), 7.61(dd, J=11.2, 4.4 Hz, 4H), 7.39 (d, J=15.6 Hz, 1H), 7.29 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.07～7.01 (m, 1H), 6.96 (d, J=8.6 Hz, 2H), 3.88 (s, 3H)。MS(ES, m/z): 362.1 (ES-)。

化合物5淡黃色固體，產(chǎn)率29%，熔點(diǎn): (159～162) ℃ 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.08 (d, J=8.7 Hz, 2H), 7.97 (s, 1H), 7.86～7.78 (m, 3H), 7.71 (d, J=3.5 Hz, 1H), 7.62 (t, J=6.3 Hz, 3H), 7.46 (d, J=15.6 Hz, 1H), 7.20～7.14 (m, 1H), 6.96 (d, J=8.7 Hz, 2H), 3.88 (s, 3H)。MS(ES, m/z): 361.9 (ES-)。

化合物6淡黃色固體，產(chǎn)率35%，熔點(diǎn): (159～162) ℃ 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.08 (d, J=15.8 Hz, 2H), 8.01 (d, J=3.7 Hz, 1H), 7.81 (d, J=15.6 Hz, 1H), 7.70 (d, J=4.9 Hz, 1H), 7.62 (d, J=8.7 Hz, 2H), 7.39 (t, J=11.8 Hz, 3H), 7.23～7.15 (m, 1H), 6.95 (d, J=8.7 Hz, 2H), 3.86 (s,3H)。MS(ES, m/z): 397.8 (ES-)。

2.2抗腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲結(jié)果

2.2.1抗腫瘤細(xì)胞增殖采用MTT比色法評(píng)估所得化合物對(duì)于MDA-MB-231存活率的影響?；衔?～6與陽性對(duì)照TSAHC對(duì)于MDA-MB-231的IC50依次為18.53、6.32、4.72>20>20、5.89、1.98 μmol·L-1。其中化合物2、3、6與陽性對(duì)照表現(xiàn)較好，該結(jié)果為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了給藥濃度。

2.2.2抗腫瘤細(xì)胞侵襲如Fig 3所示，相較于空白對(duì)照組 (0.1% DMSO)，以IC50為作用濃度，化合物2、3與TSAHC表現(xiàn)出了良好的抑制腫瘤侵襲的能力，這與抗增殖實(shí)驗(yàn)中的趨勢(shì)十分吻合。其他化合物則沒有顯示出太多區(qū)別，尤其是化合物6，雖然可以有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，但對(duì)腫瘤細(xì)胞的侵襲行為并沒有影響。鑒于Matrigel被用作ECM的模擬物，因此，可以推斷化合物2、3可以抑制腫瘤細(xì)胞MDA-MB-231對(duì)ECM的降解，而化合物6卻沒有這種能力。該結(jié)論為下一步的實(shí)驗(yàn)指明了方向。

2.2.3MMP-2蛋白表達(dá)水平分析如Fig 4所示，化合物2、3可以有效抑制MMP-2蛋白的表達(dá)，MMP-2的表達(dá)水平與表觀學(xué)實(shí)驗(yàn)中所得結(jié)論基本一致。

2.3分子對(duì)接結(jié)果分析以MMP-2為靶蛋白，對(duì)化合物1～6進(jìn)行分子對(duì)接。結(jié)果顯示，化合物2、3與MMP-2蛋白模型有著良好的作用，對(duì)接得分見Tab 1，化合物2、3的3D-QSAR見Fig 5。

Tab 1　Molecular docking scores and Log P of six compounds

Fig 3　Inhibition of tumor invasion by Transwell assay in MDA-MB-231(n=3)

A～F: Groups treated by compounds 1～6; G,7: TSAHC; H,8: Blank group; I: Bar graph for the group A～H.*P<0.05vsblank group

3　討論

腫瘤細(xì)胞隨血液流動(dòng)離開原發(fā)灶，分泌蛋白酶，侵蝕基底膜，并發(fā)生隨血流的遷徙行為是腫瘤發(fā)生重要環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)中我們采用的是膜孔徑為8 μm的Transwell小室來評(píng)價(jià)所得查耳酮對(duì)于對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的影響。腫瘤細(xì)胞在上層的饑餓條件以及下層的血清誘導(dǎo)的情況下，穿過碳酸酯膜并發(fā)生遷移，同時(shí)通過在Transwell的上室鋪上Matrigel膠來模擬ECM，從而達(dá)到模擬侵襲的目的。Matrigel是從EHS小鼠肉瘤得到的可溶性的基底膜類似物，此種肉瘤富含ECM蛋白，有利于在體外研究細(xì)胞侵染的過程[10]。

Fig 4　Expression of MMP-2 in each group(n=3)

A: The expression of MMP-2; B: The expression bar graph of MMP-2. 1-6: Groups treated by compounds 1～6; 7: Blank control; 8:TSAHC.*P<0.05vsblank group

Fig 5　Molecular docking graph of compound 2(A), 3 (B) and TSAHC(C)

隨后我們?cè)诘鞍姿缴?，針?duì)降解ECM的核心MMPs進(jìn)行了評(píng)價(jià)。MMPs是一類金屬離子Zn依賴的蛋白水解酶超家族，主要功能為降解多種ECM成分[11]。MMP-2和MMP-9是MMPs家族中研究較為透徹的兩個(gè)因子，其表達(dá)量的多少與ECM的數(shù)量息息相關(guān)[12]。MMP-2廣泛存在于細(xì)胞和組織之中。研究顯示，MMP-2的含量長(zhǎng)期處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，主要受到ERK/MAPK和JAK-STAT信號(hào)通路的調(diào)控[13]。其在酶解ECM Ⅳ型膠原中有“鉆頭”的作用[14]，且通過Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，所得到的化合物2、3可以有效抑制MMP-2蛋白的表達(dá)，而其他化合物對(duì)于MMP-2蛋白的抑制作用較有限，提示化合物2、3的抗腫瘤侵襲作用應(yīng)該是通過干擾MMP-2表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的，且可以達(dá)到陽性對(duì)照TSAHC的效果。但化合物是直接作用于MMP-2靶蛋白，還是作用于上下游信號(hào)通路則需進(jìn)一步研究。分子對(duì)接結(jié)果顯示，化合物2與MMP-2形成了2根氫鍵，而化合物3與目標(biāo)蛋白則形成了4根氫鍵，多出的兩根氫鍵為磺酰基的貢獻(xiàn)。結(jié)果顯示，查耳酮結(jié)構(gòu)右側(cè)的間位酚羥基對(duì)于MMP-2靶點(diǎn)而言是必需的?；酋０锋I和酰胺鍵對(duì)于整個(gè)化合物的得分具有正效應(yīng)。先導(dǎo)化合物TSAHC的羰基端為一甲苯結(jié)構(gòu)，在本項(xiàng)目中被置換為噻吩結(jié)構(gòu)，在噻吩中雜原子的電負(fù)性和分散正電荷的能力較苯要強(qiáng)許多，且雜五元環(huán)的芳香性較苯而言要小。因此，被認(rèn)為更可能與氨基酸殘基形成氫鍵，或者引發(fā)拉電子效應(yīng)，強(qiáng)化旁邊磺酰胺的氫鍵強(qiáng)度，形成更好的靶點(diǎn)效應(yīng)，得分也更高。

綜上所述，本研究基于天然產(chǎn)物衍生的大方向而展開，基于先導(dǎo)化合物TSAHC，豐富了該化合物構(gòu)效關(guān)系研究。以噻吩為衍生基團(tuán)，得到了6個(gè)新的近羰基端延長(zhǎng)的新的查耳酮類化合物，通過MTT實(shí)驗(yàn)得出了初步的抗增殖結(jié)果。通過體外腫瘤侵襲實(shí)驗(yàn)，篩選得到了具有抑制腫瘤侵襲的兩個(gè)化合物2、3，并采用Western blot法對(duì)腫瘤侵襲中的核心蛋白MMP-2做了表達(dá)評(píng)估，結(jié)合分子對(duì)接，初步結(jié)果闡明了目的化合物與MMP-2蛋白之間的構(gòu)效關(guān)系，豐富了TSAHC系列化合物的研究。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)化學(xué)合成部分完成于武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，活性評(píng)價(jià)部分完成于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部。感謝武漢工程大學(xué)碩士研究生王國祥，鄭大一附院藥學(xué)部研究生吳煒、陳琪等同學(xué)的工作。)

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Tumorinvasioninhibitionofthiophenesubstitutedlongchainchalcones

ZHAO Song-feng1, ZHANG Heng2, WEI Han1, LIU Zhi-mei3, ZHANG Xiao-jian1, LIU Zi-wei2