糖尿病高糖高脂對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化的作用研究

左龍泉，王　歡，汪應(yīng)紅，黃　艷

(安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院基礎(chǔ)與臨床藥理學(xué)教研室，安徽 合肥　230032)

糖尿病是繼腫瘤、心血管疾病后醫(yī)學(xué)界的三大疑難病之一，嚴(yán)重危害人類的生命安全與健康。有報(bào)道指出，在世界范圍內(nèi)，大約有3.4億人患有糖尿病[1]，而我國(guó)是糖尿病第一大國(guó)。肝臟是糖代謝的主要場(chǎng)所，有報(bào)道稱糖尿病可增加肝硬化[2]、肝損傷[3]、肝癌[4]等一系列肝臟疾病的發(fā)生。肝纖維化是機(jī)體對(duì)慢性損傷的修復(fù)反應(yīng)，是多種慢性肝病發(fā)展至肝硬化的必經(jīng)階段。有研究表明，高血糖能加劇肝臟相關(guān)疾病的進(jìn)展。在慢性丙型肝炎患者中，高血糖是纖維化進(jìn)展的一項(xiàng)獨(dú)立的協(xié)同因素，伴隨著更高的促纖維化效應(yīng)[5]。在酒精誘導(dǎo)的肝臟疾病中，高血糖也作為一項(xiàng)很重要的促纖維化因子[6]。深入研究糖尿病相關(guān)肝纖維化的發(fā)病特點(diǎn)和發(fā)病機(jī)制，將有助于對(duì)糖尿病促發(fā)的肝纖維化的預(yù)防與治療，具有重要臨床意義。但目前能較好模擬人體高血糖并發(fā)/高發(fā)肝纖維化相關(guān)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型尚缺，嚴(yán)重阻礙了機(jī)制等相關(guān)研究進(jìn)展。為進(jìn)一步探討糖尿病對(duì)肝纖維化發(fā)生發(fā)展的影響，實(shí)驗(yàn)采用高脂喂養(yǎng)結(jié)合鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型[7]，四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)誘導(dǎo)肝纖維化大鼠模型，觀察糖尿病對(duì)CCl4誘導(dǎo)的大鼠化學(xué)性肝損傷/肝纖維化的作用。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼料♂ Spague-Dawlay(SD)大鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量(100～140) g，購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。基礎(chǔ)飼料及高脂飼料，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，高脂飼料配方為：59%基礎(chǔ)飼料、20%蔗糖、10%豬油、10%蛋黃粉、1%膽固醇。蛋黃粉購(gòu)自亳州市紅日實(shí)業(yè)有限責(zé)任公司。

1.1.2試劑CCl4(燦頭西隴化工廠有限公司)；安穩(wěn)血糖試紙條(長(zhǎng)沙三諾生物傳感技術(shù)有限公司)；STZ(美國(guó)Sigma公司)；天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aminotransferase,ALT)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase, AST)、甘油三酯(triglyceride, TG)、總膽固醇(total cholesterol, TCH)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所)；細(xì)胞組織裂解液RIPA、蛋白酶抑制劑PMSF(上海碧云天公司)；抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)、I型膠原(Collagen I)、β-actin抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.1.3儀器安穩(wěn)型血糖儀(長(zhǎng)沙三諾生物傳感技術(shù)有限公司)；Western blot設(shè)備(美國(guó)Bio-Rad公司)；ABI9700型PCR儀(美國(guó)ABI公司)；3-16K高速離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；FA2004 型電子天平(上海精天天平廠)。

1.1　方法

1.2.1藥物的配制檸檬酸緩沖液(pH 4.2～4.4)：稱取一定量檸檬酸和檸檬酸三鈉，分別配制100 mL的0.1 mol·L-1的溶液；取檸檬酸溶液50 mL，加入檸檬酸三鈉溶液(約60 mL)，測(cè)定pH，混合均勻后4℃保存?zhèn)溆谩TZ溶液的配制：避光稱取一定量的STZ，加入檸檬酸緩沖液(pH 4.2～4.4)，配制成1%的STZ檸檬酸鹽緩沖液。CCl4油溶液的制備，四氯化碳 ∶橄欖油溶液=2 ∶3。

1.2.2動(dòng)物分組與模型建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為糖尿病組(n=45)、肝纖維化組(n=15)、對(duì)照組(n=15)。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，糖尿病大鼠用高脂飼料喂養(yǎng)6周，對(duì)照組和肝纖維化組用基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)。6周后，糖尿病大鼠隔夜禁食12 h，腹腔注射0.1 mmol·L-1的STZ(45 mg·kg-1)檸檬酸鹽緩沖液，肝纖維化組和對(duì)照組注射等體積檸檬酸鹽緩沖液。72 h后尾尖采血測(cè)定空腹血糖，若空腹血糖≥7 mmol·L-1入糖尿病組[8]。繼續(xù)喂養(yǎng)4周監(jiān)測(cè)血糖，待血糖穩(wěn)定后(模型確定成功)，隨機(jī)抽取糖尿病大鼠20只和肝纖維化組大鼠皮下注射40% CCl4植物油溶液，首劑4 mL·kg-1，以后2 mL·kg-1，2次/周，共8周。對(duì)照組皮下注射等體積植物油溶液，在最后一次注射CCl4植物油溶液72 h后，隔夜禁食處死。實(shí)驗(yàn)期間糖尿病大鼠維持高脂飼料喂養(yǎng)，對(duì)照組和肝纖維化組用基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)。每2周定期稱量大鼠體重及尾尖采血測(cè)定大鼠血糖，記錄大鼠體重及血糖變化。

1.2.3葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(OGTT)注射STZ 72 h后，對(duì)糖尿病大鼠進(jìn)行OGTT檢測(cè)(實(shí)驗(yàn)前禁食8 h)，灌胃給予大鼠葡萄糖(2 g·kg-1)，在0、0.5、1、2 h分別采尾靜脈血，測(cè)定血糖水平。

1.2.4HE染色在大鼠肝臟右葉相同位置取組織，用10%甲醛溶液固定48 h后，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察染色結(jié)果并拍照，分析和評(píng)價(jià)大鼠肝損傷和纖維化程度。

1.2.5血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)大鼠麻醉后剖腹，腹主動(dòng)脈取血，4℃、3 500×g，離心15 min，取上層血清按測(cè)試盒說(shuō)明書測(cè)定TG、TCH、AST、ALT。

1.2.6Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)取大鼠肝組織50 mg于勻漿器中剪碎，加入1 mL RIPA蛋白裂解液(含PMSF)，冰上充分研磨至均勻混懸液后，轉(zhuǎn)移至1.5 mL的EP管中，4℃、12 000 r·min-1離心30 min，收集上清。用定量?jī)x對(duì)蛋白樣品定量，調(diào)整濃度后，加入5×蛋白上樣緩沖液，100℃煮10 min使蛋白變性。每孔加15 μL總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，膜用5%脫脂奶粉(TBST配制)在室溫下封閉3 h，用TBST清洗后，一抗4℃孵育過(guò)夜。次日，取出PVDF膜用TBST清洗后，與相應(yīng)二抗室溫孵育1 h，ECL發(fā)光試劑盒顯影，以β-actin為內(nèi)參，Image J 軟件分析條帶的灰度值。

1.2.7q-PCR檢測(cè)基因表達(dá)取大鼠肝組織30 mg于勻漿器中剪碎，加入1 mL TRIzol裂解液，冰上充分研磨至均勻混懸液后，轉(zhuǎn)移至1.5 mL的EP管中，加入0.2 mL的氯仿，顛倒混勻，4℃、12 000 r·min-1離心15 min；轉(zhuǎn)上層水相至另一EP管中，加等體積異丙醇，顛倒混勻后于-20℃助沉1 h；取出，4℃、12 000 r·min-1離心15 min，棄上清，加入預(yù)冷的75%乙醇；4℃、7 500 r·min-1離心5 min后，棄去上清，干燥5 min，加入適量的無(wú)酶水；逆轉(zhuǎn)錄前，RNA用定量?jī)x測(cè)定濃度，采用10 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書操作。q-PCR反應(yīng)，將cDNA用無(wú)酶水稀釋10倍，上、下游引物各稀釋10倍后，按10 μL體系將反應(yīng)物加至q-PCR 96孔反應(yīng)板中，每組至少3個(gè)復(fù)孔，冰上操作，引物序列見(jiàn)Tab 1。

2　結(jié)果

2.1大鼠的一般情況對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)良好、活動(dòng)自如、皮毛正常無(wú)明顯脫落；肝纖維化組大鼠精神狀態(tài)一般，不喜運(yùn)動(dòng)，伴有毛發(fā)脫落；糖尿病組大鼠精神狀態(tài)較差，行動(dòng)遲緩，皮毛粗糙；糖尿病合并肝纖維化雙模型組大鼠精神差，反應(yīng)遲鈍，皮毛凌亂無(wú)色澤，易脫落。高脂加STZ建立糖尿病模型成模率很高，45只大鼠共有42只成功，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，糖尿病及雙模型組共有5只大鼠死亡，正常組和肝纖維化組無(wú)死亡，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)取每組10只進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.2注射STZ后大鼠的血糖變化注射STZ 72 h后,對(duì)大鼠進(jìn)行OGTT檢測(cè)。Tab 2 OGTT結(jié)果顯示，糖尿病大鼠空腹血糖(0 h)和2 h血糖均升高。

2.3各組大鼠空腹血糖動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)在初步確定糖尿病模型成功后，監(jiān)測(cè)4周空腹血糖，觀察模型的穩(wěn)定性。Tab 3結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，糖尿病組大鼠血糖明顯升高。4～12周纖維化和雙模型組CCl4造模，動(dòng)態(tài)觀察各組大鼠血糖，結(jié)果顯示，與對(duì)照組各時(shí)間段相比，糖尿病組空腹血糖穩(wěn)定升高(P<0.01)，肝纖維化組無(wú)明顯變化，糖尿病合并肝纖維化組空腹血糖明顯升高(P<0.01)；與單純糖尿病組相比，糖尿病合并肝纖維化組空腹血糖無(wú)明顯變化。

2.4各組大鼠體重動(dòng)態(tài)變化在適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，糖尿病組高脂喂養(yǎng)6周，其它組普通飼料喂養(yǎng)6周后，各組大鼠體重增加明顯，但各組之間無(wú)差異。隨后，每2周定期測(cè)定大鼠體重，Tab 4結(jié)果顯示，正常組大鼠體重逐漸升高，糖尿病組與雙模型組大鼠體重降低，肝纖維組在未造模前，體重逐漸升高，造模后緩慢降低；與對(duì)照組各時(shí)間段相比，糖尿病大鼠從STZ注射后4周開始，大鼠體重明顯降低(P<0.05或P<0.01)，肝纖維化組0～12周體重均無(wú)明顯變化，糖尿病合并肝纖維化組大鼠體重明顯降低(P<0.01)；與糖尿病組各時(shí)間段相比，糖尿病合并肝纖維化組體重?zé)o明顯變化；與肝纖維化組各時(shí)間段相比，糖尿病合并肝纖維化組體重明顯降低(P<0.01)。

Tab 1　Primer sequences

Tab 2　OGTT levels of STZ-induced rats(±s,n=10)

**P<0.01vscontrol group

Tab 3　The dynamic changes of blood glucose(±s, n=10)

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsliver fibrosis group

Tab 4　The body weight of each group rats(±s, n=10)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsliver fibrosis group

2.5各組大鼠肝組織病理學(xué)檢查如Fig 1 HE染色所示，對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞排列整齊，肝組織結(jié)構(gòu)完整；糖尿病組肝臟結(jié)構(gòu)輕度破壞，有炎性壞死、脂肪變性；肝纖維化組肝組織結(jié)構(gòu)破壞較嚴(yán)重，細(xì)胞出現(xiàn)廣泛脂肪變性、炎性壞死，以匯管區(qū)及中央靜脈周圍較重，且有膠原纖維沉積；糖尿病合并肝纖維化雙模型組肝組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，肝細(xì)胞嚴(yán)重脂肪變性、炎性壞死，纖維結(jié)締組織增生形成纖維條索，伸入肝實(shí)質(zhì)內(nèi)。

Fig 1　HE staining of rat liver tissues(×200)

A: Control group; B: Diabetes group; C: Liver fibrosis group; D: Double models group.

2.6血清TG和TCH的變化如Fig 2所示，與對(duì)照組相比，糖尿病組大鼠TCH及TG值升高(P<0.01)，肝纖維化組無(wú)明顯差異；與糖尿病和肝纖維化組相比，雙模型組大鼠TCH及TG值均明顯升高，差異具有顯著性(P<0.01)。

Fig 2　TG and TCH levels of each group

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsdiabetes group;△△P<0.01vsliver fibrosis group

2.7血清AST和ALT的變化如Fig 3所示，與對(duì)照組相比，糖尿病大鼠和肝纖維化組大鼠AST和ALT值均升高(P<0.01)；與糖尿病組和肝纖維化組相比，雙模型組大鼠AST和ALT值升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。

Fig 3　The AST and ALT levels of each groups

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsdiabetes group;△P<0.05,△△P<0.01vsliver fibrosis group

2.8α-SMA和CollagenI的蛋白表達(dá)如Fig 4所示，與對(duì)照組相比，3組大鼠α-SMA和Collagen I的蛋白表達(dá)均增加(P<0.05,P<0.01)，糖尿病合并肝纖維化雙模型組與單純糖尿病和肝纖維化組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

Fig 4　Expression of α-SMA and collagen I

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsdiabetes group;△△P<0.01vsliver fibrosis group

2.9α-SMA和CollagenI的基因表達(dá)如Fig 5所示，與對(duì)照組相比，3組大鼠α-SMA、Collagen I mRNA表達(dá)均增加(P<0.01)，增加最明顯的是糖尿病合并肝纖維化雙模型組，與單純糖尿病和肝纖維化組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

Fig 5　Expression of α-SMA and collagen I

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsdiabetes group;△△P<0.01vsliver fibrosis group

3　討論

肝纖維化是肝臟對(duì)自身多次創(chuàng)傷修復(fù)的結(jié)果，可由多種因子引起的慢性疾病，其本質(zhì)是以α-SMA、Collagen I等為主要成分的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的過(guò)度沉積[9]。糖尿病是一類慢性的、具有破壞性和與年齡相關(guān)的代謝性疾病[10]，其對(duì)肝臟的正常功能有著一定的影響，可增加一系列肝臟疾病的發(fā)生，如肝癌、肝硬化等[2-4]。研究表明，高血糖對(duì)腎臟、神經(jīng)、血管的纖維化形成均有明顯的促進(jìn)作用[8]。近期有報(bào)道指出，體外高糖培養(yǎng)可以刺激肝星狀細(xì)胞的增殖和膠原的生成[8,11]，誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞炎癥因子釋放[12]。

STZ是一種廣譜抗生素，其對(duì)動(dòng)物的胰島β細(xì)胞有著高度選擇性毒性作用，因此可作為糖尿病模型的工具藥使用來(lái)誘導(dǎo)糖尿病[13-15]。本實(shí)驗(yàn)采用高脂喂養(yǎng)后腹腔注射STZ的方法，制備類似于人體的2型糖尿病大鼠模型。OGTT檢測(cè)確定糖尿病模型成功。定期檢測(cè)血糖和體重。結(jié)果顯示，大鼠在注射STZ造模后，空腹血糖穩(wěn)定升高，體重明顯降低，表明模型穩(wěn)定，造模成功。臨床上糖尿病患者多伴有血清學(xué)指標(biāo)TG和TCH的升高，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，糖尿病組大鼠TG和TCH值均升高，亦提示糖尿病大鼠模型構(gòu)建成功。HE結(jié)果顯示，糖尿病組大鼠肝組織出現(xiàn)一定的損傷并有炎癥和脂肪變性，提示糖尿病與肝臟疾病的發(fā)生有著密切聯(lián)系，而糖尿病合并肝纖維化模型大鼠與單純肝纖維化組相比，大鼠肝組織損壞更嚴(yán)重，肝纖維化程度明顯加深，提示糖尿病本身可加重CCl4化學(xué)性肝損傷致肝纖維化的進(jìn)程。

AST和ALT是常用檢測(cè)肝功能的血清轉(zhuǎn)氨酶指標(biāo)，血液中AST和ALT水平升高，提示肝臟受損或損壞。本實(shí)驗(yàn)中AST和ALT檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，糖尿病大鼠和肝纖維化組大鼠AST和ALT值均升高，與糖尿病組和肝纖維化組相比，雙模型組大鼠AST和ALT值升高更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示糖尿病組和肝纖維化組大鼠均有不同程度的肝損傷，且糖尿病本身可加重CCl4誘導(dǎo)的肝損傷程度。α-SMA和Collagen I 是肝纖維化中ECM的主要成分，肝組織中ECM的生成和降解直接影響肝纖維化的生成。各組大鼠α-SMA和Collagen I的表達(dá)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，糖尿病組大鼠α-SMA、Collagen I mRNA及蛋白表達(dá)均增加，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，糖尿病合并肝纖維化雙模型組升高的更明顯，與單純糖尿病和肝纖維化組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示糖尿病高糖高脂狀態(tài)可能通過(guò)影響ECM的生成和(或)降解，參與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展，但具體機(jī)制如何，有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，糖尿病本身可誘發(fā)肝損傷，尚可加劇CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化的病變，其機(jī)制可能與影響ECM的生成和(或)降解有關(guān)，為臨床上防治糖尿病相關(guān)性肝纖維化提供了新的思路。

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