大米α-球蛋白肽YGEGSSEEG對TNF-α誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響

鞠志遠(yuǎn)，王麗麗，劉麗婭，周閑容，周素梅，佟立濤

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京　100193)

血管內(nèi)皮分泌腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等前炎癥介質(zhì)[1]，能夠誘發(fā)自身和循環(huán)中的單核細(xì)胞產(chǎn)生多種促炎因子，加重細(xì)胞損傷，從而促進(jìn)動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的發(fā)展[2]。近年來，通過食物功能活性成分改善心血管疾病已成為食品和營養(yǎng)學(xué)家研究的熱點(diǎn)。前期研究證實(shí)，攝入大米α-球蛋白(100 mg·kg-1體質(zhì)量)可明顯降低ApoE-/-小鼠的AS病變[3]。相關(guān)研究也證實(shí)，雞蛋肽IRW可通過下調(diào)血管細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)和活性氧水平，發(fā)揮血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用，從而具有抗AS功效[4]?；诖耍覀兺茰y大米α-球蛋白中含有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而降低AS風(fēng)險的功能肽。腸囊外翻法是一種在體外模擬腸道環(huán)境檢測藥物吸收的技術(shù)，操作簡單，貼近實(shí)際吸收水平，配合體外消化方法可快速評價消化產(chǎn)物的吸收狀況。而液相質(zhì)譜串聯(lián)(LC-ESI/MS)可準(zhǔn)確測定肽的氨基酸序列。

1　材料

1.1細(xì)胞與培養(yǎng)基原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)、血管細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子-BBE均購自美國ATCC公司[2]。

1.2實(shí)驗(yàn)動物4周齡♂倉鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物公司。

1.3試劑合成肽YGEGSSEEG(純度97%)，購自中國強(qiáng)耀生物公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、TNF-α，購自北京索萊寶公司；Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒，購自美國Genview公司；VCAM-1、ICAM-1、p-p38、Bax、IKKα兔多抗、IκBα抗體，均購自美國CST公司；p65、β-actin、β-tubulin抗體，購自美國Immunoway公司；Bcl-2抗體購自英國Abcam公司；谷胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、總抗氧化能力(total anti oxidation capacity，TAOC)酶聯(lián)免疫試劑盒，購自北京易科拜德公司。

1.4儀器Agilent 1200高效液相色譜儀、Prostar 218 LC半制備液相色譜儀(美國Agilent公司)；LCQ Decaxp電噴霧質(zhì)譜(美國Thermo公司)；Novocyte流式細(xì)胞儀(美國艾森公司)；JY-SCZ2型SDS電泳裝置(北京君意東方設(shè)備公司)；Chameleon V酶標(biāo)儀(芬蘭Hidex公司)；2000MM型Kodak Image Station成像系統(tǒng)(美國Kodak公司)；MCO-18AC二氧化碳培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)。

2　方法

2.1肽段的篩選采用胃蛋白酶和胰蛋白酶兩步消化的體外消化模型：蒸餾水配制3%的大米α-球蛋白溶液，用HCl調(diào)溶液pH至2.0，加入胃蛋白酶，37℃消化酶解2 h；NaHCO3調(diào)pH至5.3，加入胰蛋白酶，再用NaOH調(diào)pH至7.8，37℃消化酶解2 h；100°C加熱10 min終止反應(yīng)，2 000×g離心20 min，收集上清液冷凍儲存。采用外翻腸囊法對消化產(chǎn)物進(jìn)行吸收實(shí)驗(yàn)：♂ SD大鼠禁食12 h后麻醉，取十二指腸10 cm，用Krebs-Ringer溶液清洗，用玻璃棒小心將小腸外翻，一端扎口，另一端插入取樣管，腸囊內(nèi)加入2 mL Krebs-Ringer溶液，通入95% O2和5% CO2混合氣體(2 mL·min-1)；將腸囊放入含有15 g·L-1消化產(chǎn)物的Krebs-Ringer溶液中，37℃吸收90 min，腸囊內(nèi)取樣。樣品經(jīng)過凝膠層析初步分離純化(Sephadex G-15凝膠柱，上樣濃度30 g·L-1，上樣量3 mL，超純水1 mL·min-1洗脫，紫外檢測280 nm)，真空濃縮，凍干。半制備高效液相色譜(RP-HPLC)進(jìn)一步純化(Innoval C18色譜柱，上樣量1 mL，上樣濃度20 g·L-1，流速5 mL·min-1梯度洗脫，檢測波長280 nm)，收集各組分峰，凍干。利用LC-ESI/MS技術(shù)分析肽的氨基酸序列。HPLC色譜條件：色譜柱：Zorbax SB-C18(2.1 mm×150 mm)；流動相：A：水(0.1%TFA)；B：乙腈(0.1%TFA)；梯度：0～40 min，5%～95% B；40～50 min，95%～5% B；進(jìn)樣量：20 μL；流速：0.2 mL·min-1。MS質(zhì)譜條件：ESI噴霧電壓4.5 kV；毛細(xì)管溫度300℃；正離子檢測，MS/MS掃描為Data Dependent Scan；動態(tài)排除次數(shù)1，時間0.5 min；MS2碰撞能量35%，掃描范圍：m/z 900～1400。

2.2細(xì)胞分組培養(yǎng)HUVECs細(xì)胞復(fù)蘇后，用含10% FBS、Kit-BBE和青-鏈霉素(1 ∶1 000)的血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，置于5% CO2和37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，使用無血清培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液待測。實(shí)驗(yàn)分為空白對照組，加肽對照組(50 mg·L-1肽處理18 h)，模型組(10 μg·L-1TNF-α刺激24 h)和肽干預(yù)組(肽處理后TNF-α刺激)。

2.3CCK-8法篩選肽干預(yù)濃度細(xì)胞以5×107·L-1接種到96孔板(每孔100 μL)，給藥前同步化過夜。本實(shí)驗(yàn)設(shè)對照組(無處理)、模型組(TNF-α刺激)和4個肽干預(yù)組(分別用25、50、100、200 mg·L-1的肽預(yù)處理細(xì)胞18 h，后TNF-α刺激細(xì)胞)，每組設(shè)6復(fù)孔。每孔加入10 μL的CCK-8溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，酶標(biāo)儀測定在450 nm處OD值。

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡細(xì)胞以5×107·L-1接種于6孔板(每孔2.5 mL)，給藥前換無血清培養(yǎng)基同步化過夜，每組設(shè)3復(fù)孔。給藥后消化收集細(xì)胞，并用預(yù)冷的PBS清洗2次，2 000 r·min-1離心5 min；用300 μL 1×Binding buffer重懸細(xì)胞，加5 μL Annexin V-FITC混勻，避光孵育15 min；上機(jī)前5 min加入5 μL PI，補(bǔ)加200 μL 1×Binding buffer，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

2.5蛋白質(zhì)印跡檢測相關(guān)蛋白表達(dá)取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以1×108·L-1的密度接種于培養(yǎng)皿。提取細(xì)胞總蛋白(p65檢測核蛋白)，BCA法蛋白定量，煮沸5 min變性后，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)印，5%脫脂牛奶封閉2 h，一抗(1 ∶1 000)4℃孵育過夜，TBS洗膜，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗(1 ∶2 000)，室溫孵育1 h，TBS清洗3次，ECL顯色。Image J對條帶進(jìn)行灰度定量分析，分別用β-tubulin(1 ∶5 000)、β-actin(1 ∶5 000)和Histone H3(1 ∶10 000)做內(nèi)參蛋白。

2.6酶聯(lián)免疫檢測GSH-Px、SOD、TAOC及MDA含量取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以1×108·L-1的密度接種于培養(yǎng)皿。分別收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清，通過反復(fù)凍融(-80℃和37℃間隔5 min，重復(fù)3次)裂解細(xì)胞，BCA法進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)蛋白定量(實(shí)際結(jié)果=測定結(jié)果×胞內(nèi)蛋白濃度)。使用SOD、GSH-Px、TAOC等酶聯(lián)免疫試劑盒，測定細(xì)胞裂解液的抗氧化水平，使用MDA酶聯(lián)免疫試劑盒測定培養(yǎng)上清中MDA的水平。

3　結(jié)果

3.1肽序列的測定大米α-球蛋白模擬消化產(chǎn)物，通過外翻腸囊法模擬吸收并收集起來，分離純化，選擇其中一個組分利用液相串聯(lián)質(zhì)譜法測定肽的氨基酸序列，并與Uniprot數(shù)據(jù)庫中大米α-球蛋白的序列比對，最終得到一個目標(biāo)肽的氨基酸序列為YGEGSSEEG(Fig 1)。此外，還通過分別給老鼠灌胃大米α-球蛋白，并檢測其血清中的肽含量，驗(yàn)證了大米α-球蛋白經(jīng)老鼠消化后，可以分解產(chǎn)生肽YGEGSSEEG，并被吸收進(jìn)入血液中。

3.2肽對TNF-α誘導(dǎo)HUVECs凋亡的影響測定肽YGEGSSEEG對TNF-α誘導(dǎo)HUVECs凋亡的影響(Fig 2)。TNF-α使細(xì)胞存活率顯著性下降至(80±3)%(P<0.01)；用50、100、200 mg·L-1濃度的肽預(yù)處理后，再給予TNF-α刺激時，細(xì)胞存活率分別上升至(102±4)%、(100±4)%、(101±3)%(P<0.05)，達(dá)到與空白對照組的水平。進(jìn)一步利用流式細(xì)胞術(shù)深入分析肽(50 mg·L-1)對HUVECs凋亡的影響(Fig 3)。圖中4個象限分別表示壞死、晚期凋亡、早期凋亡和活細(xì)胞，早期和晚期凋亡細(xì)胞之和占總數(shù)的比例即為細(xì)胞凋亡率?？瞻讓φ盏牡蛲雎蕿?14.00±0.54)%，加肽后下降至(11.03±0.79)%(P<0.05)。TNF-α刺激后細(xì)胞凋亡率上升至(25.30±0.56)%(P<0.01)；肽可明顯降低晚期凋亡細(xì)胞比例，凋亡率降低至(20.94±1.02)%(P<0.01)。

3.3肽對HUVECs中Bcl-2/Bax表達(dá)及p38MAPK磷酸化的影響Fig 4結(jié)果顯示，與空白對照相比，加肽對照組的Bcl-2表達(dá)明顯增加、Bax則明顯下降(P<0.05)。TNF-α刺激明顯性抑制Bcl-2表達(dá)，提升Bax的表達(dá)(P<0.05)。肽處理后，TNF-α刺激可以有效改善Bcl-2/Bax蛋白的表達(dá)(P<0.05)。肽可明顯降低TNF-α刺激引起的p-p38表達(dá)的增加(P<0.01)。

3.4肽對HUVECs中氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響肽對細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的測定結(jié)果如Tab 1所示。TNF-α刺激可以引起細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低GSH-Px、SOD和TAOC，提高M(jìn)DA水平(P<0.05)，而肽對TNF-α引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)無明顯的改善作用。

Tab 1　Effects of peptide on levels of GSH-Px, SOD, TAOC, MDA in HUVECs stimulated with TNF-α(±s, n=6)

*P<0.05vscontrol

3.5肽對HUVECs中VCAM-1和ICAM-1蛋白表達(dá)的影響如Fig 5所示，TNF-α刺激明顯增加ICAM-1 和VCAM-1的表達(dá)，加肽后可以明顯抑制其增加，但是沒有恢復(fù)到空白對照組的水平(P<0.05)。

3.6肽對HUVECs中NF-κB通路的影響如Fig 6A所示，加肽對照組IKKα的水平明顯降低(P<0.05)；TNF-α可使IKKα表達(dá)明顯升高，IκB-α表達(dá)明顯降低(P<0.05)；肽干預(yù)可以有效抑制這一變化趨勢(P<0.05)。細(xì)胞核內(nèi)p65的表達(dá)水平見Fig 6B，單加肽可明顯降低核內(nèi)p65水平，TNF-α刺激明顯升高其水平(P<0.01)；且肽可以明顯抑制TNF-α引起的核內(nèi)p65上調(diào)，但未恢復(fù)至空白對照水平。

4　討論

炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷在AS形成過程中發(fā)揮著十分重要作用。一些防治AS的措施亦通過保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)[2]。TNF-α作為炎癥反應(yīng)中產(chǎn)生的細(xì)胞因子之一，可以誘發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生多種促炎因子，引起炎癥、氧化應(yīng)激連鎖反應(yīng)，參與AS的病理生理過程[5]。本研究通過測定肽對HUVECs細(xì)胞存活率和凋亡的影響，明確了肽YGEGSSEEG在50 mg·L-1濃度下對TNF-α誘導(dǎo)損傷的HUVECs具有明顯的改善作用，證實(shí)了YGEGSSEEG是大米α-球蛋白中的核心肽段之一。

研究證實(shí)，Bcl-2家族蛋白對細(xì)胞凋亡的調(diào)控具有重要作用，其成員包括促凋亡蛋白Bax及抑凋亡蛋白Bcl-2等亞家族[6]。單海燕等[7]研究發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀通過調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)，延緩血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，也有大量外源性肽類物質(zhì)被報(bào)道有此功效。p38 MAPK是MAPKs超家族成員之一。p38通路的激活與血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡關(guān)系密切，而p38磷酸化又會引起B(yǎng)cl-2蛋白表達(dá)下調(diào)[8]。本研究結(jié)果顯示，肽YGEGSSEEG具有上調(diào)Bcl-2以及下調(diào)Bax的作用，且肽的干預(yù)可明顯抑制細(xì)胞內(nèi)p38的磷酸化。因此，肽YGEGSSEEG可通過調(diào)節(jié)p38-Bcl-2/Bax通路來抑制HUVECs的凋亡。

Fig 1　The mass spectra of peptide　　A: Total particle flow diagram; B: Extract ion flow diagram; C: Secondary mass spectrogram

Fig 2　Effects of peptide on viability of HUVECs stimulated with TNF-α (±s, n=6)

#P<0.05vscontrol;*P<0.05vsmodel

Fig 3　Effects of peptide on apoptosis of HUVECs stimulated with TNF-α

Fig 4　Effects of peptide on expressions of Bcl-2, Bax, p-p38 in HUVECs stimulated with TNF-α

C: Control; M: TNF-α model; PC: Peptide control (without TNF-α); PI: Peptide intervention+TNF-α (n=3).*P<0.05,*P<0.01vscontrol;##P<0.01vsmodel.

Fig 5　Effects of peptide on levels of ICAM-1 and VCAM-1 in HUVECs stimulated with TNF-α

C: Control; M: TNF-α model; PC: Peptide control (without TNF-α); PI: Peptide intervention+TNF-α (n=3).*P<0.05,*P<0.01vscontrol;##P<0.05vsmodel.

Fig 6　Effects of peptide on levels of IKKα, IκB-α (A) and nuclear p65 (B) in HUVECs stimulated with TNF-α (n=3)

C: Control; M: TNF-α model; PC: Peptide control (without TNF-α); PI: Peptide intervention+TNF-α.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel.

NF-κB信號通路作為細(xì)胞內(nèi)重要的炎癥調(diào)節(jié)信號通路，參與大量細(xì)胞內(nèi)重要的生理調(diào)節(jié)。正常情況下，NF-κB與抑制因子IκB-α和IκB-β以結(jié)合形式位于胞質(zhì)內(nèi)，無生物活性；當(dāng)炎癥因子與細(xì)胞特異性結(jié)合后，釋放IKK激酶，IκB-α磷酸化和降解，NF-κB轉(zhuǎn)運(yùn)入核，使NF-κB信號通路激活[11]。炎癥反應(yīng)過程中，TNF-α可通過NF-κB信號通路刺激人血管內(nèi)皮細(xì)胞生成黏附因子[12]。Zhou等[13]研究報(bào)道，原兒茶醛通過調(diào)控NF-κB信號來抑制內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生黏附分子。Huang等[14]研究證明了雞蛋肽IRW可通過阻斷NF-κB通路來減緩TNF-α引起的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)。本研究表明，大米肽YGEGSSEEG具有與雞蛋肽IRW同樣的阻斷細(xì)胞中NF-κB信號通路的功能，是其下調(diào)黏附分子表達(dá)水平的重要途徑。

除炎癥反應(yīng)外，氧化應(yīng)激也是內(nèi)皮細(xì)胞損傷的重要因素。在健康情況下，機(jī)體存在多種抗氧化酶。而病理?xiàng)l件下，內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增大，大量ox-LDL透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞產(chǎn)生大量氧自由基，同時自由基清除能力降低。本研究測定的肽干預(yù)組中，GSH-Px、SOD、TAOC以及MDA均沒有明顯性改善，表明其沒有干預(yù)HUVECs內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

綜上所述，大米α-球蛋白肽YGEGSSEEG通過調(diào)控p38-Bcl-2/Bax和NF-κB信號通路，抑制TNF-α誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞凋亡以及降低細(xì)胞內(nèi)黏附分子表達(dá)，從而發(fā)揮血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)涉及動物實(shí)驗(yàn)完成于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所藥理實(shí)驗(yàn)室，其他分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)完成于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工所周素梅課題組實(shí)驗(yàn)室。在此對藥植所曹麗研究員的大力協(xié)助表示感謝！)

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(2)這種低K(K≤80 mg/kg)MoO3原料生產(chǎn)出的鉬粉粒度大，一次過篩率則大，當(dāng)鉬粉粒度達(dá)到3.0 μm以上時成品率高達(dá)90%以上，粒度2.5 μm以下時，成品率只有50%左右。

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