L-型鈣通道參與大鼠動脈收縮反應的異質(zhì)性

劉　林，鄺素娟，楊　慧，饒　芳，張夢珍，麥麗萍，林秋雄，單志新，楊　敏，鄧春玉

[1. 南方醫(yī)科大學藥學院，廣東 廣州　510515；2. 廣東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學科學院)醫(yī)學研究部，廣東省心血管病研究所，廣東 廣州　510080]

血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)具有維持和調(diào)節(jié)血管張力以及血管損傷修復等功能[1]。盡管整個血管系統(tǒng)具有相似的結(jié)構(gòu)特征，但基于所供給的器官不同，其平滑肌細胞可能具有不同的特征。不同器官的VSMCs特征具有異質(zhì)性，可表現(xiàn)在結(jié)構(gòu)、代謝、功能、抗原表達等方面，它與組織、器官的功能有著密切的關系，在一些病理、生理過程中具有重要的作用[2]。以前的研究主要關注對VSMCs生物學特性以及病理變化方面[1,3]，而從收縮反應異質(zhì)性的角度研究相對較少。

血管張力受到機體內(nèi)源性的活性物質(zhì)調(diào)節(jié)，如5-羥色胺(5-hydroxy tryptamine，5-HT)、前列腺素(prostaglandin，PG)、去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)等，通過平滑肌細胞上其相應的受體，偶聯(lián)G蛋白信號通路，介導血管收縮。Ca2+內(nèi)流是VSMCs收縮的必要條件，L-型鈣通道是平滑肌細胞Ca2+內(nèi)流的重要通道[4]。本研究主要探討胸主動脈、腎內(nèi)動脈和冠狀動脈對不同的收縮劑，如苯腎上腺素(phenylephrine，Phe)、5-HT、血栓素A2類似物(9，11-dideoxy-11α，9α-epoxymethanoprostaglandin，U46619)的反應性差異，并且進一步通過使用L-型鈣通道阻斷劑硝苯地平，探討L-型鈣通道在血管收縮反應的調(diào)控差異?？傊?，通過此實驗旨在探究大鼠不同部位動脈血管對同一血管收縮劑的反應性，以及L-型鈣通道參與收縮部分的差異性。

1　材料

1.1實驗藥物苯腎上腺素、5-HT、血栓素A2類似物、乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)、硝苯地平(nifedipine)均購于Sigma 公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2實驗動物瘦型Zucker(fa/+)大鼠，♂，體質(zhì)量300～350 g，共18只，購于維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號: SCXK(京)2016-0011。

1.3儀器610 M型多通道血管張力測定儀(丹麥DMT公司)；PowerLab 8/30生物信號采集處理系統(tǒng)(澳大利亞AD公司)；DK-8D型電熱恒溫水槽(上海醫(yī)用恒溫設備廠)；Stemi DV4型體視顯微鏡(德國ZEISS 公司)。

2　方法

2.1動脈血管環(huán)的制備正常瘦型Zucker(fa/+)大鼠，采用頸椎脫臼法處死，迅速打開腹腔，取下胸主動脈、腎臟或心臟，放入4℃預冷、混合氣(含95% O2+5% CO2)飽和過的K-H液中，K-H液成分為(mmol·L-1) ：NaCl 119、NaHCO325、MgCl2·6H2O 1、KCl 4.7、KH2PO41.2、CaCl22.5、D-glucose 11.1。洗凈胸主動脈、腎臟或心臟的殘余血液及血塊，在冰浴條件下，借助體視顯微操作分離出胸主動脈、腎內(nèi)動脈或冠狀動脈，去除血管外周的脂肪或結(jié)締組織，把血管剪成1.8～2.0 mm的血管條。將胸主動脈血管條直接固定于610M血管張力測定儀浴槽內(nèi)的針式固定架上，腎內(nèi)動脈或冠狀動脈用兩根直徑為40 μm的不銹鋼絲穿過管腔，分別固定于620M血管張力測定儀浴槽內(nèi)的兩個鉗夾上，其中一個鉗夾連接調(diào)整脈管周長的螺旋測微器，另一個鉗夾連接內(nèi)置的高靈敏度張力傳感器。血管平衡30 min后，分別給予胸主動脈、腎內(nèi)動脈和冠狀動脈基礎張力15、2、2 mN，每隔15 min換液1次，并使張力分別維持在15、2、2 mN，平衡60 min后，在浴槽中加入藥物進行實驗。血管對藥物反應的張力變化信號會通過張力傳感器再經(jīng)過數(shù)模轉(zhuǎn)換器輸入計算機，并在計算機程序控制下完成記錄。實驗全程持續(xù)通以混合氣到浴槽內(nèi)的溶液中，保持溫度在(37±0.5)℃[5-6]。

2.2藥物對血管張力作用檢測首先用高鉀(KCl 60 mmol·L-1) 刺激血管，以檢測血管的反應性。用高鉀的K-H 液(mmol·L-1)(KCl 60、NaCl 63.7、NaHCO325、MgCl2·6H2O 1、KCl 4.7、KH2PO41.2、CaCl22.5、D-glucose 11.1)替換浴槽內(nèi)的K-H液。高鉀使血管條產(chǎn)生收縮反應，待達到最大收縮反應性且穩(wěn)定后，用K-H液置換浴槽內(nèi)溶液，間隔30 min后，重復上述實驗。前后兩次高鉀刺激使得血管收縮的幅度相差不超過10%，可以用于進行下一步實驗。其次檢測血管內(nèi)皮的功能性，重新平衡血管條30 min，用血管收縮劑1 μmol·L-1Phe收縮胸主動脈和腎內(nèi)動脈，用2 μmol·L-15-HT收縮冠狀動脈，待血管產(chǎn)生持續(xù)性收縮并達到最大收縮幅度后，加入血管舒張劑1 μmol·L-1ACh舒張血管，若舒張幅度大于60%視為內(nèi)皮完整，若舒張程度小于10%或不舒張視為內(nèi)皮去除完全。

對血管功能性檢測合格的血管條，采用累積濃度給藥的方法，在浴槽中分別加入各濃度梯度的血管收縮劑Phe(0.001～30 μmol·L-1)、5-HT(0.001～10 μmol·L-1)、U46619(0.001～1 μmol·L-1)，觀察激動劑濃度和收縮效應關系，當收縮效應達到最大后，用K-H液洗脫4次，并給予1 μmol·L-1硝苯地平孵育30 min，再次重復以上Phe、5-HT、U46619累積濃度給藥，觀察硝苯地平對血管收縮的量效曲線影響。

3　結(jié)果

3.1Phe誘導大鼠胸主動脈、腎內(nèi)動脈和冠狀動脈收縮反應性差異Fig 1、Tab 1結(jié)果顯示，Phe對冠狀動脈張力無明顯作用，但可誘導胸主動脈和腎內(nèi)動脈產(chǎn)生明顯的濃度依賴性收縮反應，兩者量效曲線的Emax無明顯差異(P>0.05)，胸主動脈的pEC50明顯大于腎內(nèi)動脈(P<0.05)。給予1 μmol·L-1硝苯地平孵育30 min后，胸主動脈和腎內(nèi)動脈收縮的量效曲線右移，且對胸主動脈收縮反應的抑制幅度(77.89±3.40)%，明顯大于腎內(nèi)動脈(40.87±2.48)%(P<0.05)。以上結(jié)果提示，在這3種動脈中，冠狀動脈對Phe引起的血管收縮反應不敏感；胸主動脈對Phe的收縮反應最敏感；相較于腎內(nèi)動脈，L-型鈣通道在Phe引起的胸主動脈收縮反應中可能發(fā)揮更大的作用。

Tab 1　Sensitivity and maximum response for vasoconstrictor-induced constriction in different arteries (±s)

*P<0.05vsthoracic aorta;#P<0.05vsintrarenal artery

Fig 1　Effect of nifedipine on concentration-dependent vasoconstriction induced by Phe in endothelium-denudedt thoracic aortic rings and intrarenal arterial rings

Left panel: Representative recording of Phe-evoked concentration-dependent contraction in endothelium-denuded thoracic aortas (A), intrarenal arteries (B) of rats. Right panel: Effect of nifedipine (1 μmol·L-1) on concentration-dependent vasoconstriction induced by Phe in endothelium-denuded thoracic aortic rings (A,n=6) and intrarenal arterial rings (B,n=8) in rats.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

3.25-HT誘導大鼠胸主動脈、腎內(nèi)動脈和冠狀動脈收縮反應性差異Fig 2、Tab 1結(jié)果顯示，胸主動脈對5-HT的收縮反應不明顯，只是在較高濃度(3 μmol·L-1)才能誘導收縮反應，但5-HT可濃度依賴性誘導腎內(nèi)動脈和冠狀動脈收縮反應，且Emax和pEC50無差異(P>0.05)。給予1 μmol·L-1硝苯地平孵育后，胸主動脈、腎內(nèi)動脈和冠狀動脈收縮的量效曲線均右移，且對冠狀動脈收縮反應的抑制幅度(84.53±1.17)%明顯大于腎內(nèi)動脈(30.77±0.85)%(P<0.05)。以上結(jié)果提示，在這3種動脈中，胸主動脈對5-HT反應不敏感；相較于腎內(nèi)動脈，L-型鈣通道在5-HT誘導的冠狀動脈收縮反應中可能發(fā)揮更大的作用。

3.3U46619誘導大鼠胸主動脈、腎內(nèi)動脈和冠狀動脈收縮反應性差異Fig 3、Tab 1結(jié)果顯示，胸主動脈、腎內(nèi)動脈和冠狀動脈對U46619均產(chǎn)生明顯的濃度依賴性收縮反應，胸主動脈與冠狀動脈Emax無統(tǒng)計差異(P>0.05)，但均大于腎內(nèi)動脈(P<0.05)；胸主動脈收縮量效曲線pEC50最大(P<0.05)，腎內(nèi)動脈與冠狀動脈之間無差異(P>0.05)。1 μmol·L-1硝苯地平對U46619誘導胸主動脈、腎內(nèi)動脈和冠狀動脈收縮反應均有明顯抑制作用，其抑制幅度分別為(38.88±1.73)%、(46.49±3.00)%、(94.18±3.54)%，對冠狀動脈收縮反應的抑制幅度最大(P<0.05)，對胸主動脈和腎內(nèi)動脈的抑制幅度無顯著性差異(P>0.05)。以上結(jié)果提示，在這3種動脈對U46619誘導的收縮反應性中，胸主動脈反應最敏感，腎內(nèi)動脈收縮強度最弱，L-型鈣通道在冠狀動脈收縮反應中占明顯優(yōu)勢。

Fig 2　Effect of nifedipine on concentration-dependent vasoconstriction induced by5-HT in endothelium-denudedt thoracic aortic rings, intrarenal arterial rings and coronary arterial rings

Left panel: Representative recording of 5-HT-evoked concentration-dependent contraction in endothelium- denuded thoracic aortas (A), intrarenal arteries (B) and coronary arteries (C) of rats. Right panel: Effect of nifedipine (1 μmol·L-1) on concentration-dependent vasoconstriction induced by 5-HT in endothelium-denuded thoracic aortic rings (A,n=12), intrarenal arterial rings (B,n=6) and coronary arterial rings (C,n=6) in rats.

*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

4　討論

L-型鈣通道調(diào)控細胞內(nèi)鈣濃度在VSMCs收縮中至關重要。血管激動劑(Phe、5-HT、U46619)與VSMCs細胞膜上相應受體結(jié)合后，一方面激活磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(PI-PLC)，使磷脂酰肌醇二膦酸(PIP2)水解，產(chǎn)生三磷酸肌醇(IP3)和二酯酰甘油(DAG)，DAG可激活蛋白激酶C(PKC)。另一方面，激活Rho激酶，進而激活PKC。PKC被激活后，會進一步激活L-型鈣通道，使其開放，外鈣內(nèi)流。細胞內(nèi)鈣離子與鈣調(diào)蛋白結(jié)合形成鈣-鈣調(diào)蛋白復合物，進而激活肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)，促進肌球蛋白輕鏈磷酸化，導致肌動蛋白和肌球蛋白相互作用，引起血管收縮[7]。

Fig 3　Effect of nifedipine on concentration-dependent vasoconstriction induced by U46619 in endothelium-denuded thoracic aortic rings, intrarenal arterial rings and coronary arterial rings

Left panel: Representative recording of U46619-evoked concentration-dependent contraction in endothelium- denuded thoracic aortas (A), intrarenal arteries (B) and coronary arteries (C) of rats. Right panel: Effect of nifedipine (1 μmol·L-1) on concentration-dependent vasoconstriction induced by U46619 in endothelium-denuded thoracic aortic rings (A,n=6), intrarenal arterial rings (B,n=8) and coronary arterial rings (C,n=7) in rats.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

本課題組已研究報道，L-型鈣通道在收縮劑誘導冠狀動脈平滑肌收縮中具有種鼠差異性[8]，還有眾多研究探究病理狀態(tài)下或衰老狀態(tài)下動脈血管的功能改變及其機制[9]，以及某藥對不同部位動脈的影響[10]，但是對于不同部位動脈收縮反應異質(zhì)性及其機制探究相對較少。又因為血管平滑肌的收縮主要與激動劑誘導和細胞內(nèi)外刺激引起的細胞內(nèi)鈣濃度增加有關，L-型鈣通道廣泛存在于VSMCs，在血管平滑肌收縮過程中，鈣離子內(nèi)流主要通過L-型鈣通道[4]。所以L-型鈣通道在內(nèi)生性血管收縮劑誘導的動脈血管收縮與舒張中發(fā)揮著重要作用。因此，我們主要探究在有或無L-型鈣通道參與下大鼠不同部位動脈的收縮差異性。血管收縮藥物Phe、5-HT、U46619可分別模擬內(nèi)源性活性物質(zhì)Phe、5-HT和血栓素A2作用于血管平滑肌上α腎上腺素受體、5-HT 受體和血栓素A2受體誘導血管平滑肌收縮，從而有助于在離體狀態(tài)下觀察血管在不同情況下的反應性[11]。

胸主動脈為大血管，主要作用是儲存和運輸血液；腎內(nèi)動脈和冠脈為中型血管，后者用于供給心臟血液，前者一方面營養(yǎng)腎組織，另一方面參與尿液的生成。然而，具有功能性差異的三者之間是否存在異質(zhì)性及其機制如何未知，因此，我們針對以上問題進行了探究。

本實驗采用瘦型Zucker(fa/+)大鼠，它是一種正常大鼠，與常規(guī)動物無明顯區(qū)別，常被用來研究代謝性疾病，如糖尿病、肥胖等，是模型Zucker(fa/fa)大鼠的對照鼠。本實驗發(fā)現(xiàn)：(1)在Phe誘導的動脈血管收縮反應中，1 μmol·L-1硝苯地平對胸主動脈收縮反應的抑制幅度明顯大于腎內(nèi)動脈，提示相較腎內(nèi)動脈L-型鈣通道介導的鈣內(nèi)流在胸主動脈中占優(yōu)勢；胸主動脈對Phe的收縮敏感性大于腎內(nèi)動脈，提示胸主動脈平滑肌上的α-腎上腺素受體的數(shù)量或敏感性較高。同時，發(fā)現(xiàn)大鼠冠狀動脈對Phe無明顯的收縮反應。也有研究報道豬冠狀動脈上存在微量的α受體，以β受體占優(yōu)勢[12]。提示，冠狀動脈對Phe無反應可能是由于大鼠冠狀動脈上微量α受體不足以引起血管收縮，或是冠狀動脈受非內(nèi)皮機制舒張作用抵消了其收縮作用，此機制需要進一步探究。(2)5-HT可濃度依賴性誘導腎內(nèi)動脈和冠狀動脈收縮，兩者Emax和pEC50均無明顯差異，但是相較于腎內(nèi)動脈，L-型鈣通道介導的鈣內(nèi)流在冠狀動脈中占優(yōu)勢，非L-型鈣通道介導的鈣內(nèi)流在腎內(nèi)動脈中占優(yōu)勢。同時發(fā)現(xiàn)胸主動脈在所給藥物劑量范圍內(nèi)對5-HT 量效曲線不明顯，且未達最大收縮強度，此結(jié)果與Ibarra等[13]用5-HT對WKY大鼠實驗的現(xiàn)象相似，但與自發(fā)性高血壓大鼠實驗的結(jié)果有差別。(3)在U46619誘導的動脈血管收縮反應中，胸主動脈、腎內(nèi)動脈和冠狀動脈對U46619均產(chǎn)生明顯的濃度依賴性收縮反應，且胸主動脈反應最敏感，腎內(nèi)動脈收縮強度最弱，L-型鈣通道介導的鈣內(nèi)流在U46619誘導冠狀動脈收縮反應中占明顯優(yōu)勢。

目前臨床所用的L-型鈣通道阻斷劑可用于治療高血壓、心絞痛、肥厚性心肌病、腦血管疾病、心律失常等。由于血管收縮劑誘導不同部位動脈血管收縮差異與L-型鈣通道有關，因此，提示在治療不同部位(如心臟和腎臟)疾病時，可根據(jù)病人情況，酌情給予相應的藥物劑量，以降低藥物帶來的副作用。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)大鼠不同部位動脈血管對血管收縮劑(Phe、5-HT或U46619)的收縮反應性存在明顯差異，即大鼠不同部位動脈存在異質(zhì)性，并且不僅與動脈VSMCs上的L-型鈣通道有著密切的關系，還與其非L-型鈣通道有關，但是具體涉及哪些非L-型鈣通道，如鈣庫操縱性鈣通道、非選擇性陽離子通道等，需要進一步探究。另外，實驗結(jié)果也顯示針對不同的血管收縮劑，硝苯地平即使在同一血管上的收縮抑制效應也不同，這可能由于受體種類不同，也可能涉及其他因素或因子參與大鼠動脈收縮反應的異質(zhì)性，具體是什么原因仍需進一步探究。

(致謝：本實驗在廣東省冠心病重點實驗室完成，感謝各位老師和同學在實驗過程中的幫助。)

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