RRBP1與RABEX-5蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達及與臨床病理特征和預后的關(guān)系

廖代祥 鄭 博 張彥斌 于軍輝

結(jié)直腸癌是臨床中常見的惡性腫瘤，近年來隨著我國生活水平的不斷提高，結(jié)直腸癌發(fā)病率與死亡率不斷增加，嚴重威脅我國居民健康和生活質(zhì)量[1]。相關(guān)研究表示，一些腫瘤分子與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展存在密切的關(guān)系。因此，為了能夠?qū)颊哌M行早期診斷與治療，從而降低死亡率，尋找有效的生物標志物是目前臨床研究的重點。核糖體結(jié)合蛋白1(RRBP1)是一種核糖體結(jié)合以及新生蛋白跨膜移位必不可少的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白[2]，既往研究發(fā)現(xiàn)，RRBP1表達與子宮內(nèi)膜癌、食管癌等腫瘤的發(fā)展有關(guān)[2-3]。RABEX-5是目前新發(fā)現(xiàn)的一種鳥苷酸交換因子，能夠與RABAPTIN-5形成復合物從而激活RAB5[4]，并有研究表明，RABEX-5在胃癌組織中表達水平高于正常組織[5]。但目前關(guān)于RRBP1、RABEX-5在結(jié)直腸癌組織中表達水平的研究結(jié)果較少。因此，本研究主要探討RRBP1與RABEX-5蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達及其與臨床病理特征和預后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

將2015年8月—2016年8月進行外科手術(shù)治療的86例結(jié)直腸癌患者作為本研究對象，在術(shù)后收集患者的癌組織標本以及相對應的86例癌旁組織標本(距癌組織5 cm)。其中男性46例，女性40例；年齡23～80歲，平均年齡(63.69±6.47)歲。腫瘤分期參照美國癌癥聯(lián)合委員會/國際抗癌聯(lián)盟分期系統(tǒng)第7版中的標準[6]。納入標準：(1)所有研究對象均經(jīng)病理檢查確診為結(jié)直腸癌，并符合結(jié)直腸癌診斷標準[7]；(2)獲得患者及家屬的知情同意，并簽署知情同意書；(3)術(shù)前未進行放化療等相關(guān)治療者；(4)臨床資料完整者。排除標準：(1)合并其他惡性腫瘤者；(2)嚴重肝腎功能不全、心腦血管疾病者；(3)代謝異常者；(4)既往精神病史者。本次研究已獲得醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 試劑 兔抗人RRBP1單克隆抗體購自美國Abcam公司；兔抗人RABEX-5多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；免疫組化試劑盒、檸檬酸鹽、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 免疫組化染色法 采用免疫組織化學檢測RRBP1、RABEX-5蛋白表達水平。按照說明書將RRBP1抗體按照1∶500稀釋，RABEX-5抗體按照1∶1 000稀釋。所有標本均進行常規(guī)固定、包埋、切片；并在脫蠟后使用3%過氧化氫處理30 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，隨后進行檸檬酸鹽抗原修復，加入一抗，4℃孵育過夜。再加二抗孵育，使用DAB盒顯色，蘇木素復染，氨水返藍后沖洗，脫水、透明以及封片，最后用PBS代替一抗作為空白組對照，一切操作均嚴格按照SP試劑盒說明書進行。

1.2.3 結(jié)果判定[8]隨機選取5個高倍鏡視野計數(shù)，RRBP1和RABEX-5蛋白均定位于細胞質(zhì)中，其染色陽性表達為棕黃色或棕褐色顆粒。根據(jù)細胞染色強度與陽性細胞百分比進行綜合評分：(1)根據(jù)陽性細胞染色強度：無色為0分，淡黃色為1分，棕色為2分，棕褐色為3分；(2)根據(jù)陽性細胞百分比進行評分：<5%為0分、5%～25%為1分、26%～50%為2分、51%～75%為3分、>75%為4分；(3)將陽性細胞比例與著色強度相乘結(jié)果為：≥6分為陽性表達，<6分為陰性表達。免疫結(jié)果由兩位高年資深的病理醫(yī)師共同完成。

1.3 隨訪

采用電話或者門診進行隨訪，隨訪截止時間為2019年8月30日，隨訪時間為2～48個月，以死亡為終點?？偵嫫跒槌鲈洪_始至出現(xiàn)終點結(jié)局事件或截止時間點的時間范圍。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料以率(%)表示，采用四格表資料χ2檢驗或配對χ2檢驗比較；采用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗比較不同臨床特征結(jié)直腸癌患者的生存情況，通過單因素和多因素Cox比例風險回歸模型分析影響結(jié)直腸癌患者預后的相關(guān)因素，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 癌組織和癌旁組織RRBP1、RABEX-5蛋白表達情況的比較

結(jié)腸癌癌組織RRBP1、RABEX-5蛋白陽性表達率分別為65.12%和62.79%；結(jié)腸癌癌旁組織RRBP1、RABEX-5蛋白陽性表達率分別為38.37%和36.05%，兩組RRBP1、RABEX-5蛋白陽性表達率比較有統(tǒng)計學差異(P<0.001)(表1，圖1，圖2)。

表1 RRBP1、RABEX-5蛋白表達情況的比較Table 1 Comparison of RRBP1 and RABEX-5 protein expression in colorectal cancer and paracancerous tissues

2.2 RRBP1、RABEX-5蛋白表達陽性與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

RRBP1、RABEX-5表達與結(jié)直腸癌患者的年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小無關(guān)(P>0.05)，與結(jié)直腸癌的TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)有關(guān)(P<0.01)，TNM Ⅲ～Ⅳ期、腫瘤低分化、出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移的患者的RRBP1和RABEX-5陽性表達率均升高(P<0.05)(表2)。

表2 RRBP1、RABEX-5蛋白表達陽性與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系Table 2 The relationship between the positive expression of RRBP1 and RABEX-5 proteins and clinicopathological features of colorectal cancer patients

2.3 RRBP1、RABEX-5蛋白與結(jié)直腸癌預后的關(guān)系

86例結(jié)直腸癌患者隨訪時間范圍為2～48個月。結(jié)直腸癌患者中位總生存期27個月(95%CI：25～29個月)，其中RRBP1陽性表達和陰性表達的中位總生存期分別為20個月(95%CI：17～23個月)和30個月(95%CI：28～32個月)，RABEX-5陽性表達和陰性表達中位總生存期分別為19個月(95%CI：16～22個月)和31個月(95%CI：29～23個月)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=15.632，17.869，P<0.001)(圖3，圖4)。

2.4 影響結(jié)直腸癌患者預后的單因素分析

經(jīng)單因素分析得出，TNM Ⅲ～Ⅳ期、腫瘤低分化、出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移、RRBP1、RABEX-5陽性表達的結(jié)直腸癌患者總生存期均顯著縮短(P<0.05)(表3)。

表3 影響結(jié)直腸癌患者預后的單因素分析Table 3 Univariate analysis of prognostic factors in patients with colorectal cancer

圖1 RRBP1蛋白在結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中的表達情況Figure 1 The expression of RRBP1 protein in colorectal cancer and adjacent tissuesNote：A.The positive expression of RRBP1 in colorectal cancer tissues；B.The negative expression of RRBP1 in adjacent tissues.

圖2 RABEX-5蛋白在結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中的表達情況Figure 2 The expression of RABEX-5 protein in colorectal cancer and adjacent tissuesNote：A.The positive expression of RABEX-5 in colorectal cancer tissues；B.negative expression of RABEX-5 in adjacent tissues.

圖3 RRBP1蛋白表達陽性與陰性結(jié)直腸癌患者的生存曲線比較Figure 3 Comparison of survival curve between positive and negative RRBP1 expression in colorectal cancer patients

圖4 RABEX-5蛋白表達陽性與陰性結(jié)直腸癌患者的生存曲線比較Figure 4 Comparison of survival curve between positive and negative RABEX-5 expression in colorectal cancer patients

2.5 影響結(jié)直腸癌預后的多因素Cox回歸分析

經(jīng)多因素Cox比例風險回歸模型分析得出，TNM Ⅲ～Ⅳ期、腫瘤低分化、淋巴轉(zhuǎn)移、RRBP1、RABEX-5陽性表達均為影響結(jié)直腸癌患者預后的獨立因素(P<0.01)(表4)。

表4 影響結(jié)直腸癌預后的多因素Cox回歸分析Table 4 Multivariate Cox regression analysis for prognosis of colorectal cancer patients

3 討論

結(jié)直腸癌發(fā)病率居我國所有癌癥的第四位，男性發(fā)病率高于女性，一般早期癥狀不明顯，僅僅出現(xiàn)消化不良或便血，但當患者出現(xiàn)全身癥狀時已處于中晚期[9]。雖然隨著我國醫(yī)療的不斷發(fā)展，在結(jié)直腸癌治療方面有了重要突破，但后期生存率仍然較低，且有1/5患者在疾病確診時已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移[10]。同時有相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率、死亡率每年增長3.33%、3.05%[11]。而近幾年以來發(fā)現(xiàn)有效生物標志物能夠在腫瘤診斷中發(fā)揮重要效果。因此，本研究主要分析RRBP1與RABEX-5蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達及其與臨床病理特征和預后的關(guān)系。

RRBP1主要由1 410個氨基酸組成，主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，能夠在分泌組織中發(fā)揮重要效果[12]。有研究表明，RRBP1在肺癌組織中表達水平升高，與癌組織的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[13]。RABEX-5與RABAP-5形成可溶復合物，包含492個氨基酸殘基，由5個結(jié)構(gòu)域組成，主要定位于細胞質(zhì)內(nèi)，能夠發(fā)揮激活RAB5的功能，同時能夠參與調(diào)節(jié)細胞吞噬過程中的囊泡融合等效果，并且當RABEX-5表達異常時能夠?qū)е录毎淌晒δ苷系K，從而導致疾病的出現(xiàn)以及惡化[14-15]。同時有研究發(fā)現(xiàn)，RABEX-5與RAB5能夠共同參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[16]。

本研究結(jié)果顯示，癌組織RRBP1、RABEX-5蛋白陽性表達率均明顯高于癌旁組織，且結(jié)直腸癌患者為TNM Ⅲ～Ⅳ期、腫瘤低分化、出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移時，RRBP1、RABEX-5陽性表達率均升高，表示RRBP1、RABEX-5表達水平升高能夠反應結(jié)直腸癌的嚴重程度。有研究顯示[17]，RRBP1在甲狀腺腫瘤組織中表達水平升高，且表達水平與臨床病理特征相關(guān)。同時有研究顯示，RABEX-5在有些癌癥細胞中呈高表達[18]。本研究隨訪結(jié)果顯示，RRBP1陽性表達和陰性表達的患者中位總生存期分別為20個月、30個月，RABEX-5陽性表達和陰性表達的患者中位總生存期分別為19個月、31個月，表示RRBP1、RABEX-5表達水平與患者的預后存在密切關(guān)系。為進一步了解影響患者預后的因素，本研究經(jīng)單因素與多因素分析結(jié)果顯示，TNM Ⅲ～Ⅳ期、腫瘤低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、RRBP1、RABEX-5陽性表達均為影響結(jié)直腸癌患者預后的獨立因素，表示結(jié)直腸癌組織惡性程度升高時，RRBP1、RABEX-5表達水平升高，且表達水平與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及預后均密切相關(guān)，能夠作為預測腫瘤嚴重程度以及預后生存的有效指標。

綜上所述，RRBP1蛋白與RABEX-5蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達水平均升高，且與結(jié)直腸癌患者的臨床病理特征有關(guān)，RRBP1蛋白陽性表達與RABEX-5蛋白陽性表達均是結(jié)直腸癌預后的危險因素，二者可作為結(jié)直腸癌診斷和預后的有效生物標志物。但本研究選取樣本量較少且研究時間過短，仍需進一步深入研究。