細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)多價(jià)EgA31-EgG1Y162抗原序列優(yōu)化分析①

張 杰 李玉嬌 張峰波 孔慧芳 周曉濤 王紅英 丁劍冰

(新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830011)

包蟲(chóng)病(hydatid disease)又稱(chēng)棘球蚴病，為自然疫源性疾病，是一種嚴(yán)重危害健康的人獸共患寄生蟲(chóng)病，呈世界性分布和流行[1，2]。以細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)(echinococcus granulosus,Eg)的幼蟲(chóng)引起的稱(chēng)囊性包蟲(chóng)病(cystic echinococcosis,CE)或稱(chēng)囊性棘球蚴病，以多房棘球絳蟲(chóng)幼蟲(chóng)(echinococeosis multilo-cularis，Em)感染所引起的稱(chēng)泡型包蟲(chóng)病(alveolar echinococcosis,AE)[2，3]。我國(guó)包蟲(chóng)病的高發(fā)區(qū)主要以青海、新疆、西藏、寧夏、內(nèi)蒙古、四川、甘肅等地，其主要寄生在肝肺等重要器官，嚴(yán)重危害人體健康和畜牧業(yè)發(fā)展[4，5]。目前針對(duì)包蟲(chóng)病的治療以手術(shù)輔以藥物治療為主，但控制的仍不理想，因此采取免疫預(yù)防是較為經(jīng)濟(jì)有效的方法，但我們?nèi)绾握业接行У囊呙缡乾F(xiàn)在科學(xué)界迫在眉睫問(wèn)題。近幾年多價(jià)疫苗的研究已是許多感染性疾病如包蟲(chóng)疫苗的熱點(diǎn)課題[6，7]。傅玉才等[8]研究發(fā)現(xiàn)EgA31抗原在動(dòng)物模型試驗(yàn)中刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，可作為理想的包蟲(chóng)疫苗候選分子。為研究出更加經(jīng)濟(jì)有效的包蟲(chóng)病疫苗，曹春寶等[9]在細(xì)粒棘球蚴中發(fā)現(xiàn)了新基因—EgG1Y162抗原基因，研究發(fā)現(xiàn) EgG1Y162蛋白能刺激宿主體內(nèi)的免疫反應(yīng)，因此EgG1Y162抗原被認(rèn)為是一種理想的疫苗候選分子[10，11]。為了提高疫苗的有效性，將多個(gè)抗原進(jìn)行聯(lián)合構(gòu)成多價(jià)疫苗，較單價(jià)疫苗能更好的誘導(dǎo)宿主的免疫保護(hù)作用[12]。

本研究將EgA31抗原基因與EgG1y162抗原基因通過(guò)linker序列鏈接，將其融合抗原序列進(jìn)行優(yōu)化，構(gòu)建原核表達(dá)系統(tǒng)，提高體外融合蛋白的表達(dá)。通過(guò)生物信息學(xué)方法分析優(yōu)化抗原基因序列、密碼子、抗原表位等，為后期構(gòu)建理想的蛋白疫苗和DNA疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1EgG1Y162蛋白基因序列的獲取 根據(jù)曹春寶等[9]構(gòu)建的 EgG1Y162 重組蛋白，去除信號(hào)肽的基因cds序列為360 bp(GeneBank登錄號(hào)：AB458259)。

1.1.2EgA31蛋白基因序列的獲取 (GeneBank登記號(hào)為：AF067807),其氨基酸序列(GenBank登記號(hào)為:AAC21558.1)全長(zhǎng)序列1 836 bp，編碼氨基酸為601個(gè)。根據(jù)課題組成員前期分析預(yù)測(cè)的該抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果，選擇優(yōu)勢(shì)的易形成抗原表位的氨基酸序列為201～534，全長(zhǎng)1 002 bp，編碼334個(gè)氨基酸。

1.1.3EgA31-EgG1Y162氨基酸獲取 通過(guò)登錄GeneBank得到蛋白氨基酸序列。

1.1.4EaA31-EgG1Y162抗原密碼分析 運(yùn)用E.coli Codon Usage Analyzer 2.1在線軟件分析EgA31-EgG1Y162序列 優(yōu)化前后密碼子使用度。

1.1.5試劑 構(gòu)建成功的Pet30a-EgG1Y162-EgA31 原核表達(dá)質(zhì)粒，IPTG誘導(dǎo)劑，大腸桿菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,卡那霉素，LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨，酵母提取物，氯化鈉 )，SDS-PAGE蛋白凝膠試劑盒，蛋白marker,考馬斯亮藍(lán)染色液，脫色液，凝膠成像儀,37℃恒溫培養(yǎng)箱，搖床。

1.2方法

1.2.1重組抗原基因 抗原基因cds序列EgA31-EgG1Y162進(jìn)行重組構(gòu)建，為后期蛋白的有效的表達(dá)。

1.2.2EgA31-EgG1Y162蛋白的理化性質(zhì)分析 使用Expasy在線軟件ProtParam[13](http://web.expasy.org/protparam/)分析EgA31-EgG1Y162 蛋白的理化性質(zhì)特點(diǎn)。

1.2.3EgA31-EgG1Y162蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu) 使用DNAstar軟件的protean的模塊對(duì)截短序列EGA31蛋白，EgG1Y162蛋白及聯(lián)合蛋白EgA31-EgG1Y162蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，比較單獨(dú)的兩個(gè)序列用link連接后結(jié)構(gòu)有無(wú)發(fā)生改變。

1.2.4EgA31-EgG1Y162蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析 運(yùn)用在線軟件SOMPA[14](https://npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)分析EgA31-EgG1Y162蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)：α-螺旋，β-折疊，β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲進(jìn)行分析。

1.2.5EgA31-EgG1Y162抗原DNA序列對(duì)比 運(yùn)用DNAStar軟件的Blast模塊將優(yōu)化前后的序列進(jìn)行DNA序列比對(duì)，比較兩者序列中堿基的變化情況。

1.2.6EgA31-EgG1Y162蛋白的密碼分析 運(yùn)用在線軟件E.coli Codon Usage Analyzer 2.1[15]分析序列優(yōu)化前后密碼子的適應(yīng)指數(shù)。

1.2.7EgA31-EgG1Y162蛋白T細(xì)胞表位分析運(yùn)用在線軟SYFPEITHI[16](http://www.syfpeithi.de/bin/mhcserver.dll/epitopeprediction.htm)、運(yùn)用在線軟件 IEDB[16](http://tools.iedb.org/mhcii/)參數(shù)選擇HLA-DRB1*0701，分析聯(lián)合抗原EgA31-eGgay162的T細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位。

1.2.8EgA31-EgG1Y162蛋白B細(xì)胞表位分析 運(yùn)用在線軟件ABCpred[17](http://crdd.osdd.net/raghava/abcpred/ABC_submission.html)、BepiPred-1.0[18](http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred-1.0/)分析融合蛋白EgA31-EgG1Y162的B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位。

1.2.9EgA31-EgG1Y162蛋白誘導(dǎo)表達(dá) 原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜，挑陽(yáng)性單菌落搖菌培養(yǎng)過(guò)夜，按1∶100接種種子菌液至液體培養(yǎng)基中，220 r/min 37℃ 搖床培養(yǎng)至OD值為0.6～0.8時(shí)，經(jīng)IPTG體外誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，3 000 r/min離心15 min 4℃收集菌體沉淀，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.10EgA31-EgG1Y162蛋白樣品的制備 蛋白樣品的獲?。?%的SDS溶解菌體沉淀,4℃ 300 W，間隔5 s、超聲5 s、超聲2 min，12 000 r/min離心5 min 4℃，收集上清。按1∶3加入4×蛋白上樣緩沖液,沸水煮10 min,使蛋白質(zhì)變性，備用。

1.2.11SDS-PAGE電泳 配置12%的分離膠，5%的濃縮膠制備蛋白電泳凝膠，蛋白上樣10 μl,80 V 20 min濃縮膠，100 V 90 min分離膠條件下電泳,電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)色液室溫染色4 h，脫色3次，每次60 min,凝膠成像儀拍照看蛋白誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1EgA31-EgG1Y162蛋白誘導(dǎo)表達(dá) 重組pET30a-EgA31-EgG1Y162原核表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)IPTG體外誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，理論蛋白大小58 kD,圖1與預(yù)期理論結(jié)果一致,得出1～4，條件下誘導(dǎo)出的蛋白表達(dá)量均高。在IPTG 0.5 mmol/L 28℃ 2 h 37℃ 3 h的條件下，誘導(dǎo)的蛋白濃度與其他條件相比最高。

2.2EgA31-EgG1Y162蛋白的理化性質(zhì)的分析結(jié)果 使用ProtParam在線軟件分析EgA31- EgG1Y162蛋白有462個(gè)氨基酸組成，蛋白分子質(zhì)量為52 926.58 Daltons；理論pI值為6.51；含有78強(qiáng)堿性(+)氨基酸(K,R)；81 強(qiáng)酸性(-)氨基酸(D,E)；原子組C4072 h6757N1389O1638S335，不穩(wěn)定系數(shù)為40.17，歸類(lèi)為不穩(wěn)定蛋白(大于40時(shí)，預(yù)測(cè)蛋白不穩(wěn)定)；平均親水系數(shù)GRAVY：-0.774(GRAVY值的范圍在-2到2之間，負(fù)值表明為親水性蛋白)歸類(lèi)為親水性蛋白。

圖1 蛋白誘導(dǎo)表達(dá) SDS-PAGE 結(jié)果Fig.1 Protein-induced expression SDS-PAGE resultsNote:M.Protein marker；1.IPTG 0.5mmol/L 28℃ 2 h 37℃ 2 h;2.IPTG 0.5 mmol/L 28℃ 2 h 37℃ 3 h；3.IPTG 0.5 mmol/L 28℃ 2 h 37℃ 4 h；4.IPTG 0.2 mmol/L 28℃ 2 h 37℃ 2 h；5.Uninduced.

2.3EgA31-EgG1Y162抗原的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析 使用在線軟件SOPMA對(duì)EgA31-EgG1Y162抗原的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)卷曲二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。如下圖2藍(lán)色Hh表示α-螺旋，約占69.05%，紅色Ee表示β-折疊，約占10.17%，綠色Tt表示β-轉(zhuǎn)角約占5.63%,紫色Cc表示無(wú)規(guī)卷曲，約占15.15%。

2.4抗原優(yōu)化后蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析和對(duì)比 運(yùn)用DNAstar軟件的protein模塊中的Garnier-Robson法和Chou-Fasman法分析EgA31EgG1Y162蛋白(圖 3)，EgA31蛋白(圖4)的二級(jí)結(jié)構(gòu)EgG1Y162蛋白(圖5)，紅色表示為α-螺旋(alpha)，綠色表示為β-折(beta)，藍(lán)色表示為β-轉(zhuǎn)角(turn)，黃色表示為不規(guī)則卷(coil)。從預(yù)測(cè)的結(jié)果分析，多價(jià)EgA31-EgG1Y162蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)與單獨(dú)的EgA31和EgG1Y162蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)比較，其α-螺旋，β-折疊(beta)區(qū)域基本無(wú)變化。β-轉(zhuǎn)角(turn)，不規(guī)則卷曲(coil)區(qū)域抗原指數(shù)增加，其linker連接部位的兩側(cè)指數(shù)增加指數(shù)較高。蛋白的親水性、蛋白抗原的表面可及性、抗原指數(shù)均在linker連接兩側(cè)有所增加

圖3 DNAstar分析EgA31-EgG1Y162蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.3 DNAstar analysis protein secondary structure

圖4 DNAstar分析EgA31蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.4 DNAstar analysis of EgA31 protein second-ary structure

圖5 DNAstar分析EgG1Y162蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.5 DNAstar analysis of EgG1Y16 protein protein secondary structure

2.5EgA31-EgG1y162 DNA序列優(yōu)化前后對(duì)比結(jié)果 運(yùn)用DNAMAN軟件Blast模板比較EgA31-EgG1Y162 DNA序列在優(yōu)化前后的變化。優(yōu)化前后兩DNA序列的一致性為80.13%(圖6)。

未優(yōu)化序列的結(jié)果：SEQ未優(yōu)化序列:1 389 bp;Composition 553 A;223 C;297 G;316 T;0 OTHERPercentage:39.8% A;16.1% C;21.4% G;22.8% T;0.0%OTHER Molecular Weight(kD):ssDNA:431.31 dsDNA:856.14。

優(yōu)化后序列的結(jié)果：SEQ 優(yōu)化列.txt:1 389 bp;Composition 463 A;335 C;343 G;248 T; 0 OTHERPercentage:33.3% A;24.1% C;24.7% G;17.9% T;0.0%OTHER′Molecular Weight(kD):ssDNA:429.97 dsDNA:856.30。從序列比對(duì)的結(jié)果分析，優(yōu)化之后的DNA序列的ACG三種堿基比例改變，其中堿基A在優(yōu)化后較優(yōu)化前比例減少了6.5%，堿基G減少了4.9%，堿基C的含量增加了3.3%。

圖6 DNA序列的對(duì)比結(jié)果Fig.6 Comparison results of DNA sequenceNote:Dark blue is the same base of two sequences,and the rest are different base parts.

圖7 優(yōu)化序列密碼子分析結(jié)果Fig.7 Optimization sequence codon analysis resultsNote:Codon Adaptation Index(CAI)is 1.

圖8 未優(yōu)化序列的分析結(jié)果Fig.8 Analysis results of unoptimized sequencesNote:Red indicates a low utilization codon CAI<1.

圖9 左SYFPEITHI分析預(yù)測(cè)T表位，前十組右IEDB分析預(yù)測(cè)T表位前十Fig.9 Left SYFPEITHI analysis predicts T epitopes,top ten group Right IEDB analysis predicts top ten groups of T epitopesNote:On the left,the higher the score is the easier to form the epitope map.On the right,the lower the percentage is the easier to form an B epitope

表1 EgA31-EgG1y162抗原T和B細(xì)胞表位
Tab.1 EgA31-EgG1y162 antigen T and B cell epitopes

EpitopeMethodPositionAminoacidsequenceTcellepitopeSYFPEITHI,IEDB86-97KEKLQESETKLL1-15RRALITQESRNLELQ179-191LENLLKTETQELL305-319MRDTINTLTEKIATI359-378LPEHFRWIHVGSRSLELGWN344-358ELMAKLTKELKTTBcellepitopeABCpred、BepiPred102-112THDQTKRIHDV172-204TKEINTKLENLLKTETQELLTTIKDLDSKLTES394-409YVTFKYRNVP415-431LTLEGLKPSTFYEVVV443-458YGFIRTLAPGEDGADR318-334TIKIPEPLPMMKPIEIPK343-353VDPELMAKLTK

2.6序列優(yōu)化前后密碼子的適應(yīng)指數(shù)(CAI )分析結(jié)果 利用大腸桿菌對(duì)密碼子應(yīng)用的偏好性，運(yùn)用在線軟件E.coli Codon Usage Analyzer 2.1分析優(yōu)化序列中密碼子適應(yīng)指數(shù)CAI為1，且優(yōu)化序列的密碼子中不含利用率低的密碼子(圖7)。未優(yōu)化序列密碼子的分析結(jié)果(圖8)，未優(yōu)化的序列中含有利用率低的密碼子，數(shù)量為121個(gè)，密碼子適應(yīng)指數(shù)與優(yōu)化的序列相比小于優(yōu)化序列的CAI。

2.7融合抗原EgA31-EgG1Y162的表位分析結(jié)果 運(yùn)用SYFPEITHI軟件和 IEDB 軟件選取前十組分值較高容易形成表位的氨基酸區(qū)域(圖9)綜合分析預(yù)測(cè)聯(lián)合抗原EgA31-EgG1Y162蛋白T細(xì)胞表位優(yōu)勢(shì)表位(1～15、86～97、179～191、359～388、305～319、344～358)。運(yùn)用ABCpred、BepiPred軟件分析預(yù)測(cè)EgA31-EgG1Y162蛋白的B細(xì)胞表位，選擇分值較高的前十組，綜合分析預(yù)測(cè)易形成B細(xì)胞抗原表位的氨基酸區(qū)域(102～112、172～204、318～334、343～353、394～409、415～431、443～458)。表1預(yù)測(cè)分析出優(yōu)化EgA31-EgG1y162的抗原表位氨基酸序列，與前期課題組單獨(dú)分析預(yù)測(cè)EgA31抗原的T細(xì)胞表位(201～214、286～297、379～391、507～519)，B細(xì)胞抗原表位(302～312、372～404、518～534)，EgG1Y162抗原B細(xì)胞表位(9～17、63～73、77～82、109～117)，T細(xì)胞表位(6～14、17～36、63～83、106～116)相比，兩個(gè)序列用連接后所形成的表位氨基酸區(qū)域包括了單獨(dú)的EgA31及EgG1Y162蛋白分析預(yù)測(cè)的T、B細(xì)胞表位，其抗原表位未受到影響，聯(lián)合的抗原表位的氨基酸區(qū)域稍稍大于單獨(dú)分析的表位區(qū)域。

3 討論

目前人們對(duì)抗原誘導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)的機(jī)制有了更加深入的了解，不斷涌現(xiàn)出新型重組疫苗，如基因重組亞單位疫苗、重組活載體疫苗、重組缺失疫苗、重組蛋白疫苗，基因疫苗等[19,20]。在免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展中，人們克隆表達(dá)和分離純化完整的蛋白抗原，并利用完整的抗原來(lái)獲得相對(duì)應(yīng)的抗體，這種方法比較復(fù)雜，需浪費(fèi)大量的人力、物力和財(cái)力。而表位疫苗的研究則避免了這一問(wèn)題，是當(dāng)前分子疫苗研究的熱點(diǎn)課題[21]，因此我們分析預(yù)測(cè)出免疫原性強(qiáng)的抗原表位，再將其聯(lián)合起來(lái)，從而使疫苗獲得較好免疫保護(hù)作用[22]。

本研究將融合抗原序列進(jìn)行優(yōu)化構(gòu)建，誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定顯示抗原優(yōu)化后的融合蛋白表達(dá)量高，通過(guò)生物信息學(xué)軟件對(duì)優(yōu)化后的融合抗原序列EgA31-EgG1Y162進(jìn)行分析研究，蛋白分子質(zhì)量為52926.58 Daltons；發(fā)現(xiàn)該蛋白的原子組成為C4072 h6757N1389O1638S335，理論P(yáng)I值為6.51，歸為不穩(wěn)定性蛋白且親水性蛋白，蛋白的親水性指數(shù)越大則形成表位的可能性越大。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)主要的化學(xué)鍵是氫鍵，其鍵能較高，從而使蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定不易形成表位，分析該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)α-螺旋，β-折疊比例較高，此結(jié)構(gòu)中含有氫鍵較多且位于蛋白內(nèi)側(cè)，而β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲大部分位于蛋白質(zhì)的外側(cè)與配體容易結(jié)合形成抗原表位[23]，因此具有潛在的抗原表位優(yōu)勢(shì)。

近年來(lái)，蛋白融合技術(shù)已得到廣泛的利用，其前提是進(jìn)行基因融合。本研究linker序列是一段小分子短肽(GGGGSGGG)的柔性氨基酸，其中甘氨酸結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單不易折疊，對(duì)蛋白的空間構(gòu)象影響小，由于它自身良好的柔韌性且伸展性好的特點(diǎn)，可使兩端序列的柔性不受影響，保持2種蛋白的正確折疊[24]。通過(guò)對(duì)融合蛋白和單獨(dú)的蛋白比較分析，融合蛋白的β-轉(zhuǎn)角區(qū)域、無(wú)規(guī)則卷曲區(qū)域指數(shù)增加，且融合蛋白的骨架柔韌性、抗原表面可及性、抗原指數(shù)也有所增加，指數(shù)增加最明顯的區(qū)域是linker序列連接的兩側(cè)的氨基酸殘基區(qū)域。這些指數(shù)的增加更有利于抗原表位的形成，應(yīng)用軟件對(duì)EgA31-EgG1Y162抗原表位預(yù)測(cè)分析出融合蛋白的抗原表位包括6個(gè)T表位和7個(gè)B表位，與單獨(dú)的EgA31和EgG1Y162抗原表位分析比較，抗原表位并未發(fā)生改變。linker序列作為一段柔性短肽，不僅未對(duì)兩端蛋白的正常折疊產(chǎn)生影響，而且增加了linker 序列兩側(cè)抗原表位的形成，其B表位(318-334)TIKIPEPLPMMKPIEIPK，(343-353)VDPELMAKLTK在linker序列兩側(cè)。Linker序列作為融合蛋白形式發(fā)揮作用，從而不僅保證了融合基因所表達(dá)蛋白的完整性并且使功能蛋白較好的穩(wěn)定性和生物活性，可促進(jìn)融合蛋白的可溶性表達(dá)[25]。

研究發(fā)現(xiàn)[26]，不同宿主的蛋白表達(dá)對(duì)編碼氨基酸的遺傳密碼子有偏好性，編碼氨基酸時(shí)密碼子使用頻率并不完全相同的現(xiàn)象被稱(chēng)為密碼子偏好性。由于密碼子具有兼并性的特點(diǎn)，編碼同一種氨基酸的不同密碼子稱(chēng)同義密碼子[25]。經(jīng)研究大腸桿菌表達(dá)菌株偏好C/G結(jié)尾的密碼子，其常用偏愛(ài)的幾種密碼子中，以A堿基開(kāi)頭，以C堿基結(jié)尾的密碼子較多，因此我們通過(guò)分析序列在優(yōu)化前后個(gè)別堿基含量發(fā)生改變。密碼子的偏愛(ài)對(duì)外源性蛋白的表達(dá)有重要的影響，可以提高外源基因在宿主細(xì)胞內(nèi)的蛋白表達(dá)[27]，我們對(duì)誘導(dǎo)出的蛋白進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn)融合蛋白有效表達(dá)。通過(guò)進(jìn)一步運(yùn)用E.coli Codon Usage Analyzer 2.1分析融合抗原序列優(yōu)化前后密碼子的適應(yīng)指數(shù)(CAI)[28]，其程度范圍在0～1，數(shù)值越大說(shuō)明目的基因密碼子使用頻率與宿主中的差異越小，則反應(yīng)外源基因在宿主細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)量越高。通過(guò)密碼子適應(yīng)指數(shù)分析可知優(yōu)化序列中CAI的值為1，不含利用率低的密碼子，使優(yōu)化序列的基因在宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)出表達(dá)量高的蛋白。未優(yōu)化的序列中則含有多個(gè)宿主細(xì)胞利用率低的密碼子，不能被宿主細(xì)胞高效利用，而影響目的基因的表達(dá)。通過(guò)抗原序列優(yōu)化，將目的基因中宿主細(xì)胞利用低的密碼子通過(guò)堿基替換為宿主細(xì)胞所偏愛(ài)的密碼子，以此提高目的蛋白表達(dá)水平[29]。

綜上所述，本研究融合了細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)不同階段的候選疫苗抗原EgA31-EgG1Y162，經(jīng)過(guò)序列優(yōu)化后，能提高其在體外誘導(dǎo)表達(dá)，并且運(yùn)用生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)該優(yōu)化序列的融合蛋白具有許多優(yōu)勢(shì)，這為進(jìn)一步構(gòu)建保護(hù)性融合多價(jià)蛋白疫苗防控包蟲(chóng)感染奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為將來(lái)深入開(kāi)展細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)終末宿主犬的多價(jià)表位疫苗研究提供新思路。