血清MASP2、MASP3在IgA腎病中的作用①

鄭林花 張 穎 宋莎莎 邢國蘭 (鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院,鄭州 450052)

IgA腎病(IgAN)是我國最常見的原發(fā)性腎小球疾病[1]，也是導(dǎo)致我國終末期腎衰的主要病因之一，IgAN的臨床表現(xiàn)和組織學(xué)改變多樣,預(yù)后不一[2,3],其中超過30%的患者在20年后會進展為終末期腎臟病[4]，給社會帶來了沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān),因此闡明IgAN的發(fā)病機制，防止IgAN的進展尤為重要。

以往研究證實補體激活參與IgAN的發(fā)病及進展,且IgAN不僅有腎臟原位補體激活，而且存在循環(huán)補體活化[5]。補體由經(jīng)典途徑、旁路途徑及甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)途徑三條途徑激活,IgAN的補體激活主要通過旁路途徑和MBL途徑。很多資料顯示補體活化的旁路途徑參與了IgAN發(fā)病，但補體活化的MBL途徑在IgAN發(fā)病中的作用及機制尚不清楚。MBL由四個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成,分別為N末端區(qū)、O-糖基化膠原樣區(qū)(CLR)、螺旋鉸鏈區(qū)和C端識別區(qū)(CRD)。其中CRD為識別病原體的功能性結(jié)構(gòu)，CRD識別后，CLR與MBL相關(guān)絲氨酸蛋白酶(MASP)結(jié)合形成MBL-MASPs，激活MBL途徑[6]。在IgAN患者中，沉積在腎小球系膜細(xì)胞的MBL通過CRD與IgA1結(jié)構(gòu)中的Fc段結(jié)合[7]，其MBL中的CLR與MASP結(jié)合形成復(fù)合物，活化MASPs酶原，從而激活MBL途徑?；罨腗ASP存在MASP1、MASP2、MASP3 三個亞型，MASP2是MBL途徑的主要酶，它通過裂解C4、C2，形成C3轉(zhuǎn)化酶，C3轉(zhuǎn)化酶裂解C3為C3a和C3b，進一步形成C5轉(zhuǎn)化酶，最終形成膜攻擊復(fù)合物，導(dǎo)致細(xì)胞溶解死亡。MASP3是近年來新被發(fā)現(xiàn)的甘露糖結(jié)合絲氨酸蛋白酶家族成員，有研究顯示它參與D因子的活化[8,9]，而D因子是補體旁路途徑過程中活化的關(guān)鍵酶。MASP3通過活化D因子，進而起到促進旁路途徑活化的作用,進一步損傷腎臟。有研究發(fā)現(xiàn)IgAN中30%多的患者在腎小球系膜區(qū)有MBL的沉積，且具有腎小球MBL沉積的患者具有更嚴(yán)重的蛋白尿和腎功能損害，并且血清白蛋白水平降低和腎活檢時高血壓的可能性更大,根據(jù)牛津分類，他們的組織學(xué)變化更嚴(yán)重[10,11]。這些研究都提示了MBL途徑可能是IgAN的重要發(fā)病機制，而血清MASP2、MASP3在IgAN發(fā)病中的作用未見報道,本研究旨在研究血清中的MASP2、MASP3與IgAN臨床表現(xiàn)、病理改變的關(guān)系，進一步探討MBL途徑在IgAN發(fā)病中的作用，為IgAN的診斷、治療提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1一般資料 2016年9月至2017年3月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科住院行腎穿刺活檢術(shù)，經(jīng)病理確診為IgAN的患者共143例，其中男性78例,女性65例，年齡(33.1±12.9)歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)腎活檢光鏡下腎小球數(shù)<8個。(2)病理伴有急性(亞急性)腎小管損傷、急性(亞急性)間質(zhì)性腎炎、缺血性腎損傷及合并其他腎小球疾病等。(3)繼發(fā)性IgAN：如過敏性紫癜等。(4)臨床確診感染性疾病、糖尿病、自身免疫病、腫瘤患者等。(5)既往應(yīng)用激素及免疫抑制劑治療患者。同時收集我院體檢科健康體檢者血清標(biāo)本60例作為對照組，其中男性39例，女性21例；年齡(33.6±11.5)歲。各組間年齡、性別比例差異均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。本研究所有患者在研究前均簽訂知情同意書。

1.1.2臨床資料采集及隨訪 包括年齡、性別、24 h 尿蛋白定量、血肌酐、有無肉眼血尿病史、腎穿刺病理報告。肉眼血尿定義為患者病例中記載存在肉眼可以直接發(fā)現(xiàn)的血樣、濃茶樣或洗肉水樣真性血尿，且排除急性泌尿系感染、泌尿系腫瘤或泌尿系結(jié)石等引起的非腎小球源性血尿。采取門診隨訪、住院隨訪及電話隨訪的方式，隨訪至2018年11月30日結(jié)束，隨訪時間中位數(shù)為23個月，終點事件定義為患者eGFR下降50%(排除急性腎功能損傷)或進入透析。

1.1.3實驗試劑 ELISA試劑盒購于Hycult Biotech,Uden,the Netherlands。

1.2方法

1.2.1血清中MASP2、MASP3濃度檢測 IgAN患者在腎活檢當(dāng)日采靜脈血3 ml，健康對照組來源于我院體檢科，均由無菌干燥管收集，離心取血清1 ml置于EP管-80℃冰箱分裝保存待測。4℃冰箱解凍，用ELISA方法測定血清中MASP2、MASP3 濃度，操作步驟嚴(yán)格按試劑說明書進行。

1.2.2腎組織病理檢查評分 所有病例均在局部麻醉下行超聲引導(dǎo)下或CT引導(dǎo)下經(jīng)皮腎穿刺活檢術(shù)取腎組織，專用固定瓶保存送我院腎臟病理科進行染色制片及病理診斷，兩名病理醫(yī)師獨立閱片且最終意見統(tǒng)一。(1)免疫熒光檢查：免疫熒光法檢測腎組織上IgA、C3沉積強度,熒光顯微鏡下半定量統(tǒng)計，按照IgA沉積強度不同分為2組：(+～2+)為弱陽性組，(3+～4+)為強陽性組;按照C3沉積強度不同分為3組：(-～±)為陰性組，(+～2+)為弱陽性組，(3+～4+)為強陽性組。(2)光鏡檢查：分別行HE、Masson、PAS、PASM染色，并按新版牛津分類評分(MEST-C)進行評分[12]。M0：系膜評分<0.5 ，M1：系膜評分>0.5;E0：無毛細(xì)血管內(nèi)增生， E1：毛細(xì)血管內(nèi)增生;S0：無節(jié)段性腎小球硬化，S1：節(jié)段性腎小球硬化；T0：腎小管萎縮/間質(zhì)纖維化≤25%，T1：腎小管萎縮/間質(zhì)纖維化26%-50%，T2：腎小管萎縮/間質(zhì)纖維化> 50%;C0：無細(xì)胞/纖維細(xì)胞性新月體，C1：細(xì)胞/纖維細(xì)胞性新月體≥1個腎小球，C2：細(xì)胞/纖維細(xì)胞性新月體>25%。

2 結(jié)果

2.1病例組與對照組血清MASP2、MASP3水平比較 IgAN組與對照組血清MASP2水平無統(tǒng)計學(xué)差異(Z=-0.347，P=0.729)，IgAN組血清MASP3水平高于對照組(Z=-3.8，P<0.001)。見表1。

2.2血清MASP2濃度與臨床指標(biāo)及牛津病理評分的關(guān)系 為了進一步研究血清MASP2在IgAN的作用，本研究以對照組血清MASP2濃度(P<0.05，非正態(tài)分布)的P5值(224.22 ng/ml)和P95值(2 540.50 ng/ml)為界，將病例組分為低濃度組(<224.22 ng/ml)、中等濃度組(224.22,2 540.50 ng/ml)以及高濃度組(>2 540.50 ng/ml)進行組內(nèi)比較。研究發(fā)現(xiàn)與中等濃度組相比,低濃度組肉眼血尿發(fā)生率更高(χ2=9.892，P=0.002)，而高濃度組的24小時尿蛋白量更多(Z=-2.64，P=0.008),見表2,新月體評分更高(χ2=5.165，P=0.023),見表3。其他臨床指標(biāo)(見表2)和牛津評分M,E,S,T,C(表3)在三組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3血清MASP3濃度與臨床指標(biāo)關(guān)系及牛津病理評分的關(guān)系 繪制散點圖發(fā)現(xiàn)血清MASP3濃度與各臨床指標(biāo)無明顯線性趨勢。對照組MASP3濃度為非正態(tài)分布,且本研究發(fā)現(xiàn)病例組濃度較對照組高，所以以對照組P95值(2 512.83 ng/ml)為界,將病例組分為高濃度組(>2 512.83 ng/ml)和低中量濃度組(≤2 512.83 ng/ml)進行亞組分析，發(fā)現(xiàn)與低中量濃度組相比，高濃度組有更嚴(yán)重的蛋白尿(Z=-4.526，P<0.001)，且系膜增生比例、毛細(xì)血管內(nèi)增生比例、腎小管萎縮/間質(zhì)纖維化比例、細(xì)胞/纖維細(xì)胞性新月體比例較高(χ2=8.955，P=0.003；χ2=4.484，P=0.034；χ2=9.853，P=0.002；χ2=9.516，P=0.002)，其他臨床指標(biāo)以及牛津評分E在兩組間沒有統(tǒng)計學(xué)差異。見表4、5。

2.4血清MASP2、MASP3濃度與腎組織上IgA、C3熒光強度的關(guān)系 IgA熒光強度弱陽性組血清MASP2濃度高于強陽性組(Z=-2.546，P=0.011)，而兩組間血清MASP3濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表6。其中有7例標(biāo)本熒光組織無球,未行C3染色,其余136例患者中不同C3熒光強度血清MASP2、MASP3濃度間均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，見表7。

表1 兩組血清MASP2、MASP3水平比較
Tab.1 Comparison of serum MASP2 and MASP3 levels between two groups

GroupsnSerumMASP2(ng/ml)SerumMASP3(ng/ml)IgANgroup1431274.8(662.55,2312.75)885.5(251.26,2189.48)Controlgroup601299.7(726.98,1997.31)317.09(46.43,798.58)Z-0.347-3.8P0.7290.000

表2 血清MASP2不同濃度組間IgAN患者臨床指標(biāo)的比較
Tab.2 Comparison of clinical indicators of IgAN patients with different concentrations of serum MASP2

ClinicalindicatorsLowgroup(n=16)Moderategroup(n=99)Highgroup(n=28)P(a)P(b)Grosshematuria[n(%)]9(56.25)17(17.18)8(28.57)0.0020.18Proteinuria(g)1.3±0.71.7(0.8,3.3)2.4(1.8,4.9)0.0770.008Serumcreatinine(μmol/L)67(57,125)79(60,113)93(60,166)0.8080.426

Note：P(a)indicates the difference between the low concentration group and the moderate concentration group;P(b)indicates the difference between the high concentration group and the moderate concentration group.

表3 血清MASP2不同濃度組間IgAN患者牛津病理評分比較[n(%)]
Tab.3 Comparison of Oxford pathological scores in IgAN patients with different concentrations of serum MASP2[n(%)]

pathologicalscoresLowgroup(n=16)Moderategroup(n=99)Highgroup(n=28)χ2(a)χ2(b)P(a)P(b)MM012(75.0)62(62.6)20(71.4)0.9190.7390.3380.390M14(25.0)37(37.4)8(28.6)EE012(75.0)61(61.6)16(57.1)1.0640.1830.3020.669E14(25.0)38(38.4)12(42.9)SS09(56.3)60(60.6)12(42.9)S17(43.7)39(39.4)16(57.1)0.1092.8010.7410.094TT011(68.8)69(69.7)19(67.9)T1+T25(31.2)30(30.3)9(32.1)0.0000.0351.0000.852CC012(75.0)69(69.7)13(46.4)0.0195.1650.8920.023C1+C24(25.0)30(30.3)15(53.6)

Note：χ2(a)，P(a)indicates the difference between the low concentration group and the moderate concentration group;χ2(b)，P(b)indicates the difference between the high concentration group and the medium concentration group.

表4 血清MASP3不同濃度組間IgAN患者臨床指標(biāo)的比較
Tab.4 Comparison of clinical indicators of IgAN patients with different concentration of serum MASP3

ClinicalindicatorsHighgroup(n=27)Lowandmoderategroup(n=116)StatisticsPGrosshematuria[n(%)]9(33.34)25(21.55)χ2=1.6770.195Proteinuria(g)3.27(2.27,5.4)1.56(0.76,2.54)Z=-4.5260.000Serumcreatinine(μmol/L)86.0(73.0,103.0)74.5(58.3,118.0)Z=-1.1870.235

表5 血清MASP3不同濃度組間IgAN患者牛津病理評分比較[n(%)]
Tab.5 Comparison of Oxford pathological scores in IgAN patients with different concentrations of serum MASP3[n(%)]

PathologicalscoresHighgroup(n=27)Lowandmoderategroup(n=116)χ2PM M012(44.4)86(74.1)8.9550.003 M115(55.6)30(25.9)E E012(44.4)77(66.4)4.4840.034 E115(55.6)39(33.6)S S08(29.6)46(39.7)0.9370.333 S119(70.4)70(60.3)T T011(40.7)84(72.4)9.8530.002 T1+T216(59.3)32(27.6)C C06(22.2)64(55.2)9.5160.002 C1+C221(77.8)52(44.8)

表6 不同IgA熒光強度血清MASP2、MASP3濃度比較
Tab.6 Comparison of serum MASP2 and MASP3 concentrations between different IgA fluorescence intensity groups

IgAfluorescenceintensitygroupsnSerumMASP2(ng/ml)SerumMASP3(ng/ml)Weaklypositivegroup1011483.5(772.2,2421.5)1018.5(338.0,2336.0)Stronglypositivegroup42943.3(229.2,1900.7)700.1(215.9,1760.7)Z-2.546-1.427P0.0110.154

表7 不同C3熒光強度血清MASP2、MASP3濃度比較
Tab.7 Comparison of serum MASP2 and MASP3 concentrations in different C3 fluorescence intensity groups

C3fluorescenceintensitygroupsnSerumMASP2(ng/ml)SerumMASP3(ng/ml)Negativegroup301371.7(740.9,2400.2)484.6(124.0,2015.9)Weaklypositivegroup941197.8(656.2,2233.9)1119.7(338.0,2384.1)Stronglypositivegroup121135.3(863.8,2287.8)978.2(316.6,1497.1)χ20.5022.920P0.7780.232

圖1 IgAN患者不同MASP2濃度組Kaplan-Meier生存曲線圖Fig.1 Kaplan-Meier survival curve of different MASP2 concentration groups in IgAN patients

圖2 IgAN患者不同MASP3濃度組Kaplan-Meier生存曲線圖Fig.2 Kaplan-Meier survival curve of different MASP3 concentration groups in IgAN patients

2.5預(yù)后分析 隨訪過程中共失訪26例。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，血清低濃度MASP2(<224.22 ng/ml)和高濃度MASP2(>2 540.50 ng/ml)組患者腎臟生存率明顯低于中等濃度MASP2(224.22,2 540.50 ng/ml)組(P<0.05)，見圖1。血清高濃度MASP3(>2 512.83 ng/ml)患者腎臟生存率明顯低于低中量濃度組(P<0.05)，見圖2。

3 討論

IgAN是導(dǎo)致我國終末期腎臟病常見的原發(fā)性腎小球腎炎，發(fā)病機制目前尚不完全明確,既往很多研究證實旁路途徑參與IgAN的進展[13,14]。但近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)甘露糖結(jié)合凝集素途徑也參與IgAN的進展[15,16]，北京大學(xué)第一醫(yī)院的朱厲等發(fā)現(xiàn)在IgAN患者人群中，MBL缺乏的個體前驅(qū)感染和肉眼血尿發(fā)生率顯著增高，且長期預(yù)后更差[17]。除此之外，他們還發(fā)現(xiàn)MBL水平與IgAN預(yù)后并非線性關(guān)聯(lián)，而呈類似于U型的曲線關(guān)系，除MBL缺乏患者預(yù)后差外，高MBL水平的患者預(yù)后也較差，推測可能由于病情較重的IgAN患者體內(nèi)存在炎癥活化狀態(tài)，誘導(dǎo)急性時相蛋白MBL高表達，疾病進展更迅速。這提示MBL途徑可能在IgAN中具有多重作用機制。

MBL是在病原微生物感染早期，肝臟分泌的一種急性炎癥蛋白。MASP2作為MBL途徑活化的主要酶，它是否同MBL一樣在IgAN的發(fā)展中發(fā)揮雙重作用，在本研究中我們發(fā)現(xiàn)血清低濃度MASP2的IgAN患者肉眼血尿發(fā)生率更高，而血清高濃度MASP2的IgAN患者有更嚴(yán)重的蛋白尿和更高的新月體評分，并且預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)低濃度以及高濃度MASP2組有更低的腎臟生存率，這與朱厲等的發(fā)現(xiàn)有相似之處。過高或過低的MASP2水平都不利于免疫系統(tǒng)的正常運行:一方面，MASP2缺乏常伴隨慢性感染和炎癥以及免疫力低下;另一方面，MASP2水平過高易發(fā)生炎癥疾病。MASP2對不同疾病及同一疾病不同階段影響不盡相同，與疾病發(fā)生發(fā)展互為因果，互相影響[18]。發(fā)作性肉眼血尿是IgAN中典型的臨床表現(xiàn)，常發(fā)生在上呼吸道感染后數(shù)小時或1～2日后出現(xiàn)。文獻報道,MASP2 血清中蛋白含量高低的變化受到基因突變的影響,從而可以引發(fā)多種疾病[19]。由此我們推測在部分IgAN患者中可能存在由于遺傳因素引起的MASP2缺乏，導(dǎo)致患者免疫力低下，反復(fù)感染，故而反復(fù)發(fā)生肉眼血尿，引起腎臟病反復(fù)活動，進而導(dǎo)致腎臟不良預(yù)后。通過測定患者中MASP2的基因型可能能進一步被證實，由于條件所限，我們暫未測定患者的基因型。南方醫(yī)科大學(xué)的陳政良等研究發(fā)現(xiàn)上呼吸道感染組MASP2水平顯著高于對照組， 且血清MASP2濃度與血CRP值呈正相關(guān)，推測MASP2蛋白可能也是一種急性期蛋白[20]。多項研究顯示IgAN患者有腎臟炎癥反應(yīng)參與，因此活動性腎小球腎炎可能是這些患者MASP2作為一種急性期蛋白過量產(chǎn)生的原因之一，其作為MBL途徑活化的關(guān)鍵酶，過量的MASP2又促進了MBL途徑的過度活化，從而引發(fā)了嚴(yán)重的蛋白尿，進一步導(dǎo)致了腎臟不良預(yù)后。然而IgAN激活的MBL途徑是否直接影響血清中MASP2濃度尚不清楚，具體機制尚需更多的研究證實。我們在本研究中也發(fā)現(xiàn)了高濃度MASP2的IgAN有較高的新月體比例，至于過量的MASP2如何引起腎臟的病理損害既往未見相關(guān)報道，其機制尚需進一步研究。

IgAN免疫病理顯示IgA為主的免疫復(fù)合物在腎小球系膜區(qū)沉積，并常伴有C3沉積。已有研究發(fā)現(xiàn)在IgAN患者中，沉積在腎小球系膜細(xì)胞的MBL通過CRD與IgA1結(jié)構(gòu)中的Fc段結(jié)合，再與MASP結(jié)合形成MBL-MASPs，激活MBL途徑[7]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)IgA熒光強度強陽性組血清MASP2濃度低于弱陽性組，推測可能是MASP2與IgA共沉積消耗所造成，這可能為MASP2在IgAN作用機制的研究中提供一條新的思路，其具體機制需要更深入的研究。近年來研究顯示MASP3參與D因子的活化[8,9],且為生理狀態(tài)下血液中D因子活化的關(guān)鍵酶[21]，而D因子作為補體旁路途徑的關(guān)鍵酶，可以裂解B因子，形成旁路途徑中的C3轉(zhuǎn)化酶，裂解C3為C3a和C3b，C3bBb再反過來促進C3分解，由此形成正反饋，最終造成對腎臟的損傷。因此我們可以推斷，IgAN患者血清中高濃度的MASP3通過活化D因子，促進補體旁路途徑的過度激活，進而損傷腎臟。然而IgAN激活的旁路途徑是否直接影響MASP3水平尚不清楚,具體機制尚需更多的研究證實。本研究中發(fā)現(xiàn)血清高濃度MASP3的IgAN患者有更嚴(yán)重的蛋白尿和更低的腎臟生存率，且患者系膜增生比例、毛細(xì)血管內(nèi)增生比例、腎小管萎縮/間質(zhì)纖維化比例、細(xì)胞/纖維細(xì)胞性新月體比例較高均提示血清MASP3濃度有可能作為一種新型的生物標(biāo)志物預(yù)測IgAN的嚴(yán)重程度，而這需要大樣本資料以及長期隨訪來證實。本研究是單中心研究，且樣本量較少可能使研究結(jié)果有一定的局限性，未來可以通過多中心、擴大樣本量進一步研究MASP2、MASP3在IgAN發(fā)病中的作用，為IgAN的診斷、治療提供更可靠的依據(jù)。

總之，本研究通過對MASP2、MASP3在IgAN中作用的研究，為未來IgAN的靶向治療與無創(chuàng)性診斷開辟了新的思路。目前已有研究人員通過動物實驗探索以MASP3為靶點在治療旁路途徑異常相關(guān)疾病中的作用[22],這也將為此類疾病提供新的治療途徑。IgAN患者預(yù)后差異較大，30%可在確診后20年內(nèi)發(fā)展為終末期腎臟病，或由持續(xù)性無癥狀血尿迅速進展為終末期腎臟病[23]。腎活檢組織病理為IgAN診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但其為有創(chuàng)檢查，不宜反復(fù)進行。目前IgAN預(yù)后評估的方法主要包括臨床指標(biāo)(基線蛋白尿、腎小球濾過率等)、病理分型(牛津病理評分)以及生物標(biāo)志物(尿液IL-6等)[24],未來MASP2、MASP3可能作為新型的生物標(biāo)志物，為IgAN的診斷、治療以及預(yù)后提供可靠依據(jù)。