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    藥食兩用模式植物苦蘵基因功能研究方法的建立

    2020-02-19 07:00:20康利花蒙琪琪俞彤苑蔡佳玲陳茹意黃靖汶阮文茹蔡曉萱
    關(guān)鍵詞:侵染表型質(zhì)粒

    康利花,蒙琪琪,俞彤苑,蔡佳玲,陳茹意,黃靖汶,阮文茹,蔡曉萱,張 弦

    (杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州 311121)

    苦蘵(PhysalisangulataL.),別名燈籠果、黃姑娘、天泡子等,為茄科酸漿屬草本藥食兩用植物,在我國(guó)廣泛分布.苦蘵的果、根或全草皆可入藥,具有清熱利尿、解毒之功.

    國(guó)內(nèi)外目前對(duì)苦蘵提取物中分離得到的甾體類化合物的藥理活性研究發(fā)現(xiàn),酸漿苦素類(physagulin)化合物以及睡茄內(nèi)酯類(withanolide)具有較高的抗腫瘤活性[1-2],結(jié)構(gòu)研究亦表明酸漿苦素R(physagulin R)可能具有抗生素及抗炎藥物活性,因而成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)[3-5].目前對(duì)苦蘵physagulin R的藥性利用要求解決physagulin R合成途徑基因的篩選和鑒定這一難題.

    據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,到目前為止已從苦蘵中總共分離得到17個(gè)酸漿苦味素類化合物.通過對(duì)其研究,可知這些化合物在生源合成中都來源于幾種共同的前體,這說明其次生代謝途徑具有一定的保守性,不同藥用活性成分的生源合成規(guī)律和機(jī)制存在一定的共性[6-8].近期,苦蘵基因組即將測(cè)序完成,將為酸漿苦味素類化合物代謝合成途徑研究提供了遺傳基礎(chǔ).

    狗尾草花葉病毒(Foxtailmosaicvirus, FoMV)屬于馬鈴薯X病毒屬,是一種單組分、單鏈、正義RNA病毒,基因組大小約6.2 kb,種傳病毒,可廣泛地侵染單雙子葉植物[9].FoMV侵染單子葉植物后,僅產(chǎn)生較輕的癥狀或基本無癥狀,但保持了持續(xù)穩(wěn)定的復(fù)制表達(dá)能力.以上特點(diǎn)使得FoMV成為一種優(yōu)秀的病毒表達(dá)載體,可應(yīng)用于單雙子葉植物基因功能的研究,已有研究表明FoMV可成為一種優(yōu)秀的生物反應(yīng)器[10].

    病毒誘導(dǎo)的基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)是通過病毒攜帶靶基因的片段在侵染植物后,能夠誘導(dǎo)植物內(nèi)源(靶)基因的表達(dá)沉默,可在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平抑制靶基因的表達(dá),進(jìn)而形成植物表型或生理指標(biāo)上的差異,無需植物組織培養(yǎng);能夠在不同遺傳背景下的受侵染植物上起作用,通過差異化的表型和基因型分析,能對(duì)基因功能進(jìn)行更透徹的分析[11-14].煙草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus,TRV)為雙組分+ssRNA病毒(TRV1和TRV2),TRV2上有克隆外源基因的位點(diǎn),侵染植物后可引起相應(yīng)基因的表達(dá)沉默,是廣泛運(yùn)用的VIGS病毒載體[15].近年來應(yīng)用 VIGS 技術(shù)進(jìn)行藥用植物次生代謝產(chǎn)物調(diào)控的研究取得諸多重要成果,如那可汀和甜菜紅素的生物合成等[16].

    本實(shí)驗(yàn)成功地在苦蘵上通過FoMV實(shí)現(xiàn)了外源基因綠色熒光蛋白(eGFP)的表達(dá),以TRV病毒為載體,對(duì)苦蘵的八氫番茄紅素脫氫酶(phytoenedesaturase,PDS)實(shí)現(xiàn)了基因沉默,驗(yàn)證了苦蘵上通過植物病毒系統(tǒng)開展基因功能研究的有效性.可以通過該方法對(duì)Physagulin R基因合成途徑上候選基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控,再結(jié)合對(duì)合成產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果明確相關(guān)基因.

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    苦蘵及本氏煙(Nicotianabenthamiana)植物種子均為本實(shí)驗(yàn)室保存,均生長(zhǎng)在無蟲恒溫(25 ℃)溫室中,光照強(qiáng)度8 000 Lx,并給予16 h光照/8 h黑暗日照條件.苦蘵種子儲(chǔ)存于4 ℃保存箱進(jìn)行去春化處理,經(jīng)表面消毒后,用0.01 mol/L PBS浸泡3 d,待發(fā)芽出苗后移植于營(yíng)養(yǎng)土中.至3周后于6葉期即可用于農(nóng)桿菌浸潤(rùn)侵染實(shí)驗(yàn).

    1.2 克隆載體及試劑

    狗尾草花葉病毒侵染性克隆(pCambia2300:FOMV,EF630359)由清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院劉玉樂教授惠贈(zèng),煙草脆裂病毒(TRV)侵染性克隆(pBin19:pTRV1,AF406990;pCAMBIA1309:TRV2, AF406991)由杭州師范大學(xué)洪益國(guó)教授惠贈(zèng).peGFP質(zhì)粒、農(nóng)桿菌LBA4404由本實(shí)驗(yàn)室保存.pEASY-Blunt3克隆載體、Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)公司;質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒、植物基因組提取試劑盒、植物RNA提取試劑盒購自QIAGEN;2×TaqMIX試劑盒購自康為世紀(jì);常用化學(xué)試劑及細(xì)菌培養(yǎng)基均購自上海生工;限制性內(nèi)切酶SpeI、HpaI及逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自New English Biolabs;引物合成和測(cè)序均由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司完成,DNA Marker購自TaKaRa,KOD-PlusPCR擴(kuò)增酶購自TOYOBO公司.

    1.3 苦蘵中外源基因病毒表達(dá)載體的構(gòu)建

    通過生物軟件DNAMAN設(shè)計(jì)eGFP ORF的擴(kuò)增引物,設(shè)計(jì)含HpaI酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基的上游引物為eGFP_Hpa-F及含AscI酶切的下游引物為eGFP_ASC-R (表1).以peGFP質(zhì)粒為模板,通過KOD-Plus擴(kuò)增eGFP ORF片段,反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性18 s, 退火溫度為58 ℃,退火時(shí)間為20 s,72 ℃延伸40 s,33個(gè)循環(huán)后延伸10 min,產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),擴(kuò)增片段大小無誤,PCR產(chǎn)物使用羅氏(ROCHE)PCR回收試劑盒按說明進(jìn)行純化,再利用HpaI和AscI酶切,與同樣經(jīng)過酶切處理的質(zhì)粒pCambia2300:FOMV連接,轉(zhuǎn)化Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞后通過引物:進(jìn)行菌落PCR檢測(cè),條件與前述擴(kuò)增條件相同.篩選到的陽性克隆經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證,引物為pFoMV-seq-F/R (表1),正確的pCambia2300:FOMV/eGFP表達(dá)質(zhì)粒通過電擊法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404.

    表1 合成相關(guān)基因引物Tab.1 Related primers in this study

    續(xù)表1

    1.4 苦蘵八氫番茄紅素脫氫酶基因(PDS)片段的RT-PCR擴(kuò)增

    采集3周生長(zhǎng)期的苦蘵葉片1 g,用液氮冷凍,加入5 mm直徑鋼珠3顆,用組織振蕩破碎儀破碎,處理?xiàng)l件為35 Hz/s 持續(xù)2 min破碎.利用QIAGEN的RNA試劑盒按說明進(jìn)行苦蘵總RNA的提取.提取后的RNA樣品溶解于50 μL RNase Free Water,用Thermo Scientific NanoDrop進(jìn)行濃度測(cè)定及電泳檢查.

    取2 μg總RNA樣品,采用全式金生物(TransGen Biotech)的TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒,按說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,引物為Anchored Oligo(dT)18,獲得的cDNA通過核酸微量紫外分光光度計(jì)NanodropND-2000(美國(guó)ThermoScientific公司)測(cè)量反應(yīng)總體系濃度后稀釋至100 ng/μL,分裝為10 μL/小管備用.

    以苦蘵cDNA為模板,PCR擴(kuò)增目的基因PDS的部分401 bp片段,使用引物為含HpaI酶切位點(diǎn)KZ_PDS 401 Seq-F/含SpeI酶切位點(diǎn)的KZ_PDS 401 Seq-R (表1),反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性18 s,退火溫度為52 ℃,退火時(shí)間為20 s,72 ℃延伸30 s,33個(gè)循環(huán)后延伸10 min,產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后,擴(kuò)增片段大小無誤,PCR產(chǎn)物使用羅氏(ROCHE)PCR回收試劑盒按說明進(jìn)行純化留用.

    1.5 PDS基因片段的酶切及連接至pCAMBIA1309:TRV2載體

    PDS基因的PCR片段及VIGS載體pCAMBIA1309:TRV2分別用HpaI和SpeI雙酶切后,分別回收目的片段和載體進(jìn)行連接,重組質(zhì)粒通過化學(xué)法轉(zhuǎn)化至全式金生物的Trans1-T1 抗噬菌體感受態(tài)細(xì)胞中,pTRV2-F/-R為引物(表1),用菌落PCR篩選重組質(zhì)粒.重組質(zhì)粒取3個(gè)送賽默飛生物(蘇州)公司測(cè)序驗(yàn)證,正確的重組質(zhì)粒pCAMBIA1309:TRV2/PDSi通過電擊法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404,并通過pTRV2克隆構(gòu)建引物pTRV1-F/R進(jìn)行PCR驗(yàn)證.

    1.6 含目的靶基因的農(nóng)桿菌培養(yǎng)及浸潤(rùn)接種

    將含有目的靶基因的VIGS載體的農(nóng)桿菌接種到含卡那霉素及鏈霉素抗性的YEP培養(yǎng)基中,28 ℃,200 r/min過夜培養(yǎng).用4 000 r/min,離心15 min收集菌體,用無菌的0.01 MPBS重懸,調(diào)菌液至OD600為1.0左右,加入終濃度為0.01 mmol/L乙酰丁香酮以增強(qiáng)農(nóng)桿菌侵染效率.用1 mL無菌注射器將菌液注射到6葉期的苦蘵葉片中,注射后在第7、10、14、21天進(jìn)行癥狀的觀察,并使用Sony照相機(jī)進(jìn)行拍照及樣品的采集.

    1.7 苦蘵種子萌發(fā)階段的農(nóng)桿菌侵染實(shí)驗(yàn)

    將30顆苦蘵種子涂布在預(yù)先浸濕的無菌9 cm Waterman濾紙上,置于直徑10 cm培養(yǎng)皿內(nèi).保持在25 ℃的生長(zhǎng)室中,同時(shí)保持光照.在這樣的條件下2 d后,種子開始破壞它們的外衣并發(fā)芽.在此階段,收集種子于50 mL離心管中,與5 mL OD600為0.5的農(nóng)桿菌懸浮混合.使用真空泵保持0.085 MPa的負(fù)壓,來實(shí)現(xiàn)農(nóng)桿菌滲濾種子10 min.然后將農(nóng)桿菌滲入的種子轉(zhuǎn)移到營(yíng)養(yǎng)土中,保持黑暗24 h,然后置于25 ℃下16 h光照/ 8 h黑暗的無昆蟲生長(zhǎng)室中培養(yǎng),定期檢查局部和全身感染的發(fā)展,并進(jìn)行照相記錄.

    1.8 外源基因表達(dá)的觀察及檢測(cè)

    為了檢測(cè)來自FoMV/eGFP的綠色熒光蛋白的表達(dá),在苦蘵葉子接種農(nóng)桿菌浸潤(rùn)接種10 d后收集系統(tǒng)新長(zhǎng)出的幼葉,并在Nikon A1共聚焦顯微鏡下檢查綠色熒光.根據(jù)制造商的使用說明,設(shè)定450~490 nm激發(fā)和520 nm發(fā)射的條件以激發(fā)GFP并監(jiān)測(cè)綠色熒光的發(fā)射,同時(shí)在明視野下拍攝苦蘵的表皮葉肉細(xì)胞,使用Nikon A1軟件處理共聚焦圖像,拼合不同信號(hào)通道的圖片.

    1.9 樣品的分子生物學(xué)分析及RT-PCR定量檢測(cè)

    收集的苦蘵及本氏煙葉片,根據(jù)制造商的說明書,使用RNAprep Pure Plant Kit(TIANGEN)從苦蘵葉組織中提取總RNA,使用FastQuant RT試劑盒(TIANGEN),通過M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶從經(jīng)DNase I處理的總RNA(2 μg)合成第一鏈cDNA,通過RT-PCR用特異引物檢測(cè)過表達(dá)系統(tǒng)中FoMV的侵染及eGFP的轉(zhuǎn)錄;引物pTRV1-F/R來檢測(cè)VIGS系統(tǒng)中TRV的侵染.利用CFX96熒光定量PCR儀(Bio-Rad,USA)對(duì)相關(guān)靶基因進(jìn)行表達(dá)量的檢測(cè),使用引物為:以KZ.GAPDH和18S作為內(nèi)參,PDS基因的定量引物qRT_PDS-F/R(表1),10 μL反應(yīng)體系包含2×UltraSYBRMIXER 5 μL,cDNA 1 μL(100 ng),以及相應(yīng)基因的上下游引物各0.5 μL,每個(gè)反應(yīng)包含4個(gè)平行重復(fù),以溶解曲線檢查產(chǎn)物擴(kuò)增的特異性,使用相對(duì)定量法計(jì)算VIGS靶基因的相對(duì)表達(dá)量.

    2 結(jié)果與分析

    本實(shí)驗(yàn)通過FoMV構(gòu)建外源基因表達(dá)的病毒載體,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如圖1a所示,增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)的ORF為720 bp,目前作為一種報(bào)告基因來研究基因表達(dá)、調(diào)控,我們使用eGFP表達(dá)作為技術(shù)體系的陽性對(duì)照.通過PCR獲得了eGFP的編碼序列,對(duì)純化的PCR樣品和表達(dá)載體我們進(jìn)行了酶切和連接,通過PCR的方法篩選了陽性的克隆,其電泳結(jié)果(圖1b)顯示插入片段條帶大小約為900 bp(CP啟動(dòng)子170 bp+eGFP720 bp,使用引物為pFoMV-seq-F/eGFP_Asc-R)和線性化的載體大小均符合預(yù)期.將兩者連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌,經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證我們的陽性克隆含有目的插入片段.通過農(nóng)桿菌浸潤(rùn)接種6葉齡的苦蘵,7 d后通過尼康共聚焦顯微鏡對(duì)新生的苦蘵系統(tǒng)葉片進(jìn)行了觀察,顯示在其中均勻存在綠色熒光信號(hào)(圖1c),這一結(jié)果說明FoMV/GFP已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了整株植物的侵染,其攜帶的GFP蛋白實(shí)現(xiàn)了表達(dá).作為一種潛病毒可以持續(xù)穩(wěn)定地表達(dá)外源或內(nèi)源基因,體現(xiàn)出相應(yīng)的基因功能,這是本技術(shù)平臺(tái)的優(yōu)勢(shì).

    a.FoMV病毒表達(dá)載體的示意圖,通過農(nóng)桿菌將含有病毒全長(zhǎng)序列的片段插入植物基因組,然后通過花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄為全長(zhǎng)的RNA病毒,外源片段通過病毒的外殼蛋白(CP)的啟動(dòng)子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄翻譯.b.eGFP片段的PCR電泳結(jié)果(CP啟動(dòng)子170 bp+eGFP720 bp)及FoMV/eGFP質(zhì)粒的線性化片段電泳結(jié)果.c.FoMV/eGFP接種苦蘵7 d后在系統(tǒng)新葉上觀察到的GFP熒光.

    圖1 基于FoMV在苦蘵中的GFP表達(dá)
    Fig.1 FoMV-based eGFP expression inPhysalisperuviana

    a.基于煙草脆裂病毒的基因沉默載體構(gòu)建示意圖,TRV為雙組分+ssRNA病毒(TRV1和TRV2),TRV2上有克隆外源沉默基因的位點(diǎn).b.PDS基因部分片段401 bp和線性化的pTRV2的電泳結(jié)果.c.PDS的沉默載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后接種 6 葉齡的苦蘵,2 周后可以觀察到新生的系統(tǒng)葉上出現(xiàn)褪綠變白的表型.

    圖2 基于煙草脆裂病毒VIGS技術(shù)的苦蘵功能研究技術(shù)
    Fig.2 TRV-based VIGS system and the syptom ofPDSionPhysalisL.

    基于煙草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus, TRV)的VIGS載體體系可以克服寄主分生組織障礙的局限性,可以有力地蔓延整個(gè)植物組織,包括分生組織,而且侵染的癥狀與其他病毒相比更加輕微.在藥食兩用植物的基因功能研究中尚未見報(bào)道.因此,我們建立了基于TRV的苦蘵基因表達(dá)抑制載體.其載體設(shè)計(jì)如圖2a所示,TRV2攜帶有目的片段.

    提取的苦蘵總RNA,經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后,通過PCR擴(kuò)增出PDS基因的401 bp部分片段,經(jīng)酶切連接插入pTRV2(圖2b),經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證我們的沉默載體構(gòu)建正確,同樣轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后接種6葉齡的苦蘵,2周后可以觀察到新生的系統(tǒng)葉上出現(xiàn)褪綠變白的表型,這顯示了PDS的合成受到了破壞,我們成功構(gòu)建了基于TRV的苦蘵VIGS技術(shù)平臺(tái).

    由于接種6葉齡的苦蘵出現(xiàn)VIGS表型的時(shí)間在兩周后,周期較長(zhǎng),因此,我們對(duì)該體系的適用性進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化,即對(duì)種子萌發(fā)階段的苦蘵進(jìn)行了農(nóng)桿菌的浸潤(rùn)接種.結(jié)果顯示經(jīng)處理后,萌發(fā)2 d(圖3a)苦蘵子葉上即出現(xiàn)了PDS基因沉默的表型,TRV病毒的持續(xù)侵染,使得PDS的沉默表型在4、6、8、10、14、21 d(圖3b-f)均能持續(xù)實(shí)現(xiàn)和保持其基因沉默的表型.在接種2月后,苦蘵進(jìn)入花期(圖3g)及坐果期(圖3h),其成熟果實(shí)的外萼上同樣出現(xiàn)PDS沉默的表型,對(duì)于有褪綠表型的樣品,我們進(jìn)行了采樣和定量分析.PDS基因在萼片、葉片、果肉中的表達(dá)僅為野生型中的4.36%、5.97%和4.98%(圖4).這說明基于TRV2的VIGS的基因表達(dá)沉默效率很高,且各花器官中的沉默水平穩(wěn)定,以上結(jié)果顯示我們的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合理,能夠?qū)崿F(xiàn)靶基因的表達(dá)干擾.

    a.萌發(fā)后2 d;b.萌發(fā)后4 d; c.萌發(fā)后6 d; d.萌發(fā)后8 d; e.萌發(fā)后14 d; f.萌發(fā)后21 d; g.花期;h.坐果期.

    圖4 通過VIGS技術(shù)使不同器官的PDS表達(dá)受到抑制Fig.4 The inhibited expression of PDS of different organs

    基因功能的闡釋,離不開“一正一反”的Gain/Loss of function的過程分析.本研究中利用潛病毒狗尾草花葉病毒構(gòu)建了基因過表達(dá)系統(tǒng),成功地在苦蘵上實(shí)現(xiàn)了外源基因GFP的表達(dá),綠色熒光蛋白的表達(dá)穩(wěn)定,在系統(tǒng)新葉中穩(wěn)定而明亮,進(jìn)而可以利用實(shí)現(xiàn)苦蘵內(nèi)源基因的表達(dá),可以實(shí)現(xiàn)某未知功能基因的超表達(dá),從而獲得某一次生代謝物合成上的變化或外觀性狀的變化.而與此對(duì)應(yīng)的是基于TRV的基因沉默技術(shù),可以通過針對(duì)未知的基因設(shè)計(jì)特定的序列結(jié)構(gòu),通過病毒的接種后,在苦蘵的萌發(fā)期、幼苗期、成苗期、坐果期不同生長(zhǎng)階段均能實(shí)現(xiàn)靶基因的轉(zhuǎn)錄mRNA的特異性降解,抑制效果顯著且持久,通過病毒介導(dǎo)的基因超表達(dá)及基因表達(dá)抑制技術(shù)可實(shí)現(xiàn)苦蘵功能基因的差異表達(dá),表型可以通過性狀觀察或次生代謝物含量的檢測(cè)分析得以明確,通過本方法可對(duì)藥食兩用植物苦蘵的重要基因進(jìn)行功能研究.

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