雞安卡拉病蜂膠自家苗的制備

王欣宇 穆國冬 張 瑩 賈淇元 任 銳*

1.吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院，長春130062；2.吉林省動物疫病控制中心，長春130062；3.吉林省白城市畜牧總站，吉林白城137000

雞心包積液－肝炎綜合癥是由I 群腺病毒Fav-4 型引起的一種傳染病，肉雞和蛋雞皆可感染，雞感染死亡可出現(xiàn)心包黃色積液，肝臟腫大并出現(xiàn)大量壞死的肝細胞。此病經(jīng)常與禽白血病等疾病混合感染，混合感染死亡率可達30%，嚴重時可達80%～90%，已經(jīng)成為危害我國禽類養(yǎng)殖業(yè)的重要疾病之一。

1 材料與設(shè)備

1.1 儀器設(shè)備

組織攪拌機、滅菌解剖刀、解剖剪刀、剪鉗、鑷子、酒精燈、托盤、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱、漏斗、滅菌3層紗布、燒杯、量筒、攪拌棒、勻漿機、250 mL 和500 mL 滅菌疫苗瓶、移液器。

1.2 材 料

病死雞心臟及包膜、肝臟組織、蒸餾水、生理鹽水、3‰甲醛、雙抗（青霉素、環(huán)丙沙星），蜂膠，Tween-80，75%酒精。

2 自家苗的制作

2.1 組織處理

用滅菌解剖刀將肝臟組織切成小塊，放入滅菌過的組織攪拌機中絞碎成肉糜狀，倒入桶中按1:10的比例加入生理鹽水混勻。密封后放進-20 ℃冰柜冷凍，完全凍結(jié)后再取出融化，重復(fù)上述過程，反復(fù)凍融3 次。

凍融3 次后將解凍后的病料生理鹽水混懸液用3 層滅菌紗布過濾，棄去殘渣，在濾液中加入3‰甲醛，充分攪拌混勻，裝入適當容器內(nèi)最后放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱滅活48 h，每隔2～3 h 用攪拌棒充分攪勻1 次。滅活完成后用3 層滅菌紗布進行二次過濾，棄去濾渣，用移液器抽取1 mL 濾液用于無菌檢查，玻璃棒均勻涂布普通肉湯培養(yǎng)基，放入37 ℃溫箱培養(yǎng)18～24 h,觀察有無菌落生長。剩余濾液中按1 000 UI/mL 加入雙抗（環(huán)丙沙星、青霉素），充分搖勻，放入4 ℃冰箱中冷卻備用。

2.2 蜂膠提純

取蜂膠塊敲打研磨粉碎，稱取重量，按比例加入95%乙醇，根據(jù)室溫靜置24～72 h，低速離心取上清液，得到蜂膠乙醇浸液。取1 平皿，內(nèi)置1 張圓形濾紙，濾紙可折疊成風(fēng)琴狀以加大與空氣流通面積。用移液器取1 mL 蜂膠乙醇浸液滴在濾紙上，濾紙放置入干凈平皿中，電子天平稱量平皿和濾紙總重量，將平皿放入37 ℃烘箱過夜，待濾紙完全烘干恒重后，再次用電子天平稱量平皿加濾紙重量，計算重量差，重量差即為每毫升蜂膠中干物質(zhì)含量，算出蜂膠純度，并計算浸出液中蜂膠干物質(zhì)含量。再用95%乙醇配成含蜂膠干物質(zhì)20 mg/mL 的浸液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 自家苗的配制

取2.1 步驟處理過的滅菌組織濾液500 mL，加入蜂膠浸液110 mL、Tween-80，倒入容積2 L 的勻漿機中，充分攪勻3～5 min，可分檔間隔操作累計時長。室溫靜置，待表面泡沫消失后，根據(jù)實際需要分裝裝入500 mL 或250 mL 滅菌疫苗瓶，密閉封口后存于4 ℃待用，保質(zhì)期一般不超過1 年。

3 無菌檢測及安全檢驗

3.1 無菌檢測

用移液器吸取疫苗成品，將疫苗分別接種于普通肉湯瓊脂和麥康凱營養(yǎng)瓊脂中各1 mL，滅菌玻璃棒均勻涂鋪，培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)18～24 h，均無細菌生長，可證明甲醛滅活完全，無菌檢測合格。

3.2 安全檢驗

選用30 日齡至60 日齡非免疫健康雞10 只，每只皮下注射疫苗1 mL，同時設(shè)立同樣日齡非免健康雞空白對照組10 只，每只注射生理鹽水1 mL。觀察7～10 d ，兩組雞精神均正常，食欲良好，亦未見任何不良反應(yīng)，隨機剖檢免疫組雞注射部位及內(nèi)臟均無任何肉眼可見的異常變化，對照組也健康無異常，表明疫苗安全。

4 結(jié) 果

該批疫苗完成安全試驗后，緊急接種發(fā)病雞場，全群免疫，每只雞按體重肌肉注射1～1.5 mL蜂膠疫苗，疫苗接種后，增加雞群日糧中的蛋白質(zhì)和維生素含量，增加飲水量。5 d 后雞群臨床無新增病例且無新增死亡雞，說明此批自家苗對此病發(fā)揮了顯著作用，產(chǎn)生了較好的免疫防制效果。

5 討 論

制作自家苗所選取的病料都來自于本養(yǎng)殖場的發(fā)病動物分離出的病料組織，病料組織經(jīng)過絞碎滅活后制備的疫苗，其抗原成分全面，基本包含了能夠引起本次疾病的病原，可以對動物進行全方位、多方面的誘導(dǎo)免疫保護。禽腺病毒在擁有多種血清型的情況下，各類商品疫苗均不能達到全面理想的免疫治療效果，自家苗正好可以彌補禽腺病毒商品苗血清型單一覆蓋不全的缺點，更好地提供應(yīng)急免疫。

蜂膠屬于天然來源佐劑，是蜜蜂在樹干或綠植芽孢上采集樹脂，將樹脂處理后形成的具有芳香氣味的固體物，蜂膠免疫佐劑作為一種廣譜生物活性物質(zhì)，具有良好的免疫增強作用，它能增強巨噬細胞的吞噬能力，促進抗體的產(chǎn)生，提高機體的特異性和非特異性免疫力。應(yīng)用蜂膠或配合抗原引入機體，既能引起特異性免疫應(yīng)答，又能啟動非特異性防御機制，能刺激免疫機制和丙種球蛋白活性，增加抗體產(chǎn)量，增強補體活性和吞噬細胞的吞噬能力。蜂膠所含的成分極其復(fù)雜，有研究表明，蜂膠本身無明顯抗原性和過敏性，毒副作用較小[1]。

蜂膠與抗原按比例混合接種于機體后，可以增強補體的功能，產(chǎn)生較多的抗體，提升血清抗體水平，是天然的免疫增效佐劑，并且具有抑菌性和更高的安全性。不同方法制備的蜂膠佐劑所產(chǎn)生的免疫效果也不盡相同，蜂膠佐劑的研究發(fā)展及應(yīng)用也是適應(yīng)疫苗的應(yīng)用發(fā)展的，在獸醫(yī)臨床應(yīng)用的蜂膠疫苗佐劑會隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展、養(yǎng)殖技術(shù)的發(fā)展而更廣泛地應(yīng)用到獸用疫苗當中。翟曉虎等[2]應(yīng)用蜂膠黃酮作為PPV 滅活疫苗佐劑，可以提升豚鼠細胞免疫和早期體液免疫。

自家苗主要是針對個別養(yǎng)殖場的病原血清型而制造成的疫苗，在一定程度上可以起到很好的應(yīng)急免疫作用，但也存在一定的缺點和應(yīng)用范圍制約，因此在自家苗的制作和使用上應(yīng)該做到合理應(yīng)用，規(guī)范應(yīng)用，不隨意擴大應(yīng)用范圍，起到快速治療的輔助作用。