增強(qiáng)紫杉醇對結(jié)直腸癌化療療效的研究進(jìn)展

陳炳辰，于恩達(dá) （海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院肛腸外科，上海 200433）

結(jié)直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，在中國，其發(fā)病率和病死率均逐年增加[1]。對具有高危因素、病理分期II 期及分期更嚴(yán)重的患者，推薦使用術(shù)后化療藥物，對于已轉(zhuǎn)移的和無法I 期切除的結(jié)直腸癌患者則推薦行新輔助化療[2]。所以，化療是治療結(jié)直腸癌的主要方法之一，但無論是以氟尿嘧啶、奧沙利鉑或伊立替康為基礎(chǔ)的術(shù)后化療方案，還是增加貝伐單抗或抗表皮生長因子的對轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的新輔助化療方案[3]，它們均有明顯的藥物不良反應(yīng)及易出現(xiàn)耐藥性的缺點(diǎn)[4]。通過拓展結(jié)直腸癌化療藥物的種類，可以為患者提供更多的化療方案以優(yōu)化治療效果，降低腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥性。

紫杉醇(PTX)是一種常見的天然抗腫瘤藥物，是紫杉烷類藥物中的一員。已有研究證明促使細(xì)胞有絲分裂停滯是PTX 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主要作用機(jī)制，可與β-微管蛋白結(jié)合并穩(wěn)定微管絲[5],干擾細(xì)胞分裂中的微管分解過程，使細(xì)胞周期停留至G2/M 期，從而導(dǎo)致所作用的細(xì)胞凋亡、有絲分裂功能障礙，因此具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性[6]。但由于PTX 水溶性較低，導(dǎo)致其成藥性差，限制了其在臨床中的應(yīng)用。此外，PTX 還會(huì)引起超敏反應(yīng)、骨髓抑制、外周神經(jīng)病變等毒副作用[7]。2008 年我國批準(zhǔn)上市由美國生物科學(xué)公司研制的紫杉醇白蛋白納米粒，部分解決了PTX 成藥性差、具有多種毒副作用的問題，使PTX 成為治療卵巢癌、乳腺癌、小細(xì)胞肺癌和胰腺癌等惡性腫瘤的一線化療藥物。但對于結(jié)直腸癌，部分患者仍然存在的過敏反應(yīng)以及結(jié)直腸癌細(xì)胞對PTX 的耐藥性，令其無法廣泛應(yīng)用于結(jié)直腸癌的治療中。據(jù)報(bào)道，有幾種可能的機(jī)制解釋了這種耐藥性，例如，P-糖蛋白的過表達(dá)、微管蛋白的突變、異常信號(hào)通路的激活[8]和細(xì)胞總抗氧化能力的增加[9]等。近年來，許多研究嘗試研制PTX 新型藥物遞送系統(tǒng)或針對其耐藥機(jī)制與其他藥物聯(lián)用等，給PTX 治療結(jié)直腸癌提供了依據(jù)和可行性方案。筆者對如何增強(qiáng)紫杉醇對結(jié)直腸癌化療療效的研究進(jìn)行綜述，以期為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。

1 紫杉醇納米藥物遞送方案

由于PTX 水溶性較低，成藥性差，易產(chǎn)生過敏反應(yīng)、骨髓抑制等不良反應(yīng)，限制了其在臨床上的應(yīng)用[7]。納米藥物遞送系統(tǒng)不僅能增加難溶性藥物的成藥性，還能增加藥物的效能以及降低其不良反應(yīng)，作為納米載體已廣泛用于藥物的制備過程。

1.1 脂質(zhì)納米囊泡

脂質(zhì)納米囊泡在藥物遞送中應(yīng)用廣泛，是一種可作為PTX 載體的脂質(zhì)顆粒。有研究表明，以磷脂酰絲氨酸（PS）為基質(zhì)的脂質(zhì)納米囊泡對紫杉醇的包封率達(dá)82%，通過Chou-Talalay 聯(lián)合指數(shù)法測得載有PTX 的脂質(zhì)納米囊泡的聯(lián)合指數(shù)（CI）為0.08，說明脂質(zhì)納米囊泡不僅增加了PTX 的抗腫瘤效應(yīng)，自身還與PTX 有抗腫瘤的協(xié)同作用[10]。脂質(zhì)納米囊泡是通過靜脈途徑完成藥物靶向遞送的，由于它具有增強(qiáng)滲透和滯留藥物（EPR）效應(yīng)，使抗腫瘤藥物在局部腫瘤區(qū)域累積時(shí)間延長[11]，提高了治療效果。印度幾位科學(xué)家經(jīng)實(shí)驗(yàn)[12]證明了以PS 為基礎(chǔ)的脂質(zhì)納米囊泡攜載PTX 能夠?qū)Y(jié)直腸癌細(xì)胞產(chǎn)生有效的促凋亡作用。當(dāng)以空載脂質(zhì)納米囊泡（PCS-B）、載有紫杉醇的脂質(zhì)納米囊泡（PCS-PTX）、游離紫杉醇與空白對照組分組進(jìn)行細(xì)胞周期分析實(shí)驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)前三者均有促細(xì)胞周期凋亡的作用。PCS-B 可使得HCT-15 細(xì)胞停留在G2/M 期的母細(xì)胞數(shù)量較對照組顯著增高（P＜0.05）；且PCS-PTX 組中停留在G2/M 期的母細(xì)胞數(shù)量較 PCS-B 組與游離 PTX 組均更多（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)證明PCS 不僅是PTX 的載體，兩者還可以協(xié)同促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡作用。進(jìn)一步的研究表明，PCS-PTX 的IC50較游離PTX 約降低99%，PCS-PTX 對于耐藥性人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-15 的IC50僅為（9.4±2.0）nmol/L，與游離 PTX 相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該研究同時(shí)做了體外溶血實(shí)驗(yàn)等，證明了PCS-PTX 對于紅細(xì)胞的安全性，使用Rh-123外排測定驗(yàn)證了脂質(zhì)納米囊泡幫助PTX 躲避pgp 泵的外排，減少結(jié)直腸癌細(xì)胞對于PTX 的耐藥性。在增加療效、降低副作用的同時(shí)，減少了耐藥性的發(fā)生，具有良好的應(yīng)用前景。

1.2 基于天然聚合物的納米顆粒

基于聚合物的納米顆粒是一種具有生物可降解性、長循環(huán)性等優(yōu)勢的納米載藥顆粒，常被用作化療藥物的載體[13]，天然高分子聚合物（如絲素蛋白）更是具有對人體毒副作用小、易降解、對環(huán)境影響小等特點(diǎn)，所以引起越來越多學(xué)者的關(guān)注[14]。絲素蛋白因結(jié)構(gòu)中的重復(fù)疏水域和次要親水域，而具有良好的韌性、彈性和生物相容性。實(shí)驗(yàn)表明[15]，使用1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺（1-ehyl-3-（3-dimethylaminopropyl carbodiimide），EDC）交聯(lián)的纖維蛋白納米顆粒（EDC-FNP）的理化性質(zhì)可以很好地被控制，包括顆粒大小、zeta 電位、藥物包封率、結(jié)晶率以及藥物溶解度等。由于納米顆粒表面積與體積比的增高，經(jīng)EDC-FNP 運(yùn)載的PTX溶解度較游離狀態(tài)提高了10 倍以上；并且EDCFNP 較FNP 具有更高的藥物包封率。EDC-FNP運(yùn)載的PTX 可直接經(jīng)細(xì)胞的內(nèi)吞作用被攝取，解決了PTX 水溶性低的難題，還避免了結(jié)直腸癌細(xì)胞膜上p-gp 泵外排功能，降低了結(jié)直腸癌細(xì)胞對PTX 的耐藥性。在體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)中[16]，若將游離PTX 與PTX-EDC-FNP 分別作用于結(jié)直腸癌細(xì)胞系 CaCo-2，則兩者的 IC50分別為 105、10 μg/ml，可見，經(jīng)EDC-FNP 攜帶的PTX 較游離PTX 的IC50降低了90%，證明經(jīng)EDC-FNP 負(fù)載后的PTX 比游離PTX 具有更高的細(xì)胞毒性。同時(shí)，該試驗(yàn)也測試了EDC-FNP-PTX 的理化性質(zhì)的穩(wěn)定性與其對紅細(xì)胞的安全性：在4 ℃的條件下，EDC-FNPPTX 至少在6 個(gè)月內(nèi)可以維持其理化性質(zhì)的穩(wěn)定；經(jīng)EDC-FNP-PTX 作用的紅細(xì)胞，其溶血百分率不足4%，保證其對人體紅細(xì)胞的安全性。

1.3 納米乳劑

納米乳劑（NE）也是一種有效的藥物傳送方式。有研究表明，載有PTX 的納米乳劑（NE-PTX）能夠通過抑制P-糖蛋白活性、增加腫瘤細(xì)胞中的藥物濃度等方式降低不同類型腫瘤細(xì)胞的耐藥性[17]、提高藥物熱力學(xué)穩(wěn)定性和增加腫瘤細(xì)胞膜對PTX 的通透性來增加細(xì)胞藥物的攝取[18]，以及增加PTX 對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性和凋亡作用[19]。由于納米乳劑的包裹使PTX 增加了溶解性，通過內(nèi)吞作用，NE-PTX 很容易被結(jié)直腸癌細(xì)胞吞噬，從而增加PTX 的效能，減少了用藥劑量，間接降低了PTX 對人體可能產(chǎn)生的毒副作用。經(jīng)實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)，NE-PTX 能夠顯著增加PTX 對結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-116 和HT-29 的細(xì)胞毒作用，使IC50值降低75%～80%[20]；而且，在 200 μg/ml 的濃度下，NEPTX 對正常細(xì)胞沒有毒性，也證實(shí)了納米乳液作為PTX 載體的安全性。

2 與其他抗腫瘤藥物的協(xié)同作用

由于紫杉醇可與許多抗腫瘤藥物有協(xié)同作用，預(yù)示著可使用小劑量紫杉醇來獲得比既往更大的抗腫瘤效果，既提高了PTX 對于結(jié)直腸癌的抗腫瘤作用，又降低了PTX 的用量，減輕其對患者的不良反應(yīng)。

2.1 γ-分泌酶抑制劑

γ-分泌酶是一種多亞基天冬氨酰蛋白酶復(fù)合物，與各種I 型跨膜蛋白的膜內(nèi)蛋白水解有關(guān)，至少由4 種蛋白質(zhì)組成，即早老蛋白（presenilin）、呆蛋白（nicastrin）、前咽缺陷蛋白-1（anterior pharynx defective-1，aph-1）和早老素增強(qiáng)子-2（presenilin enhancer-2，pen-2）等，其中，早老蛋白是 γ-分泌酶混合物中主要的催化劑[21]。γ-分泌酶是包括Notch,E-cadherin, N-cadherin 和CD44[22]在內(nèi)的多種蛋白在膜內(nèi)切割所必需的酶。

有研究表明，在有APC 抑癌基因突變的小鼠體內(nèi)，γ-分泌酶抑制劑對Notch 蛋白信號(hào)的抑制可將小鼠的腺瘤轉(zhuǎn)化為杯狀細(xì)胞，提示γ-分泌酶抑制劑可能具有抗腸道腫瘤的作用[23]。

日本學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)γ-分泌酶抑制劑增強(qiáng)了結(jié)直腸癌SW480 和DLD-1 細(xì)胞系中PTX 誘導(dǎo)的有絲分裂阻滯[24]。有實(shí)驗(yàn)指出，當(dāng)單獨(dú)使用γ-分泌酶抑制劑DAPT 時(shí)，不能誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡；而當(dāng)DAPT 與PTX 聯(lián)合用于結(jié)直腸癌細(xì)胞時(shí)，則開始表現(xiàn)出DAPT 劑量依賴性地增加PTX 誘導(dǎo)這兩種細(xì)胞系凋亡的能力。后期使用除DAPT 外的其他γ-分泌酶抑制劑與PTX 聯(lián)合作用于結(jié)直腸癌細(xì)胞，也觀察到了上述結(jié)果。雖然γ-分泌酶抑制劑具體的作用機(jī)制仍未明確，但是仍提示我們：γ-分泌酶抑制劑與PTX 的聯(lián)合應(yīng)用可能是克服結(jié)直腸癌對PTX 耐藥的一種新的治療方法。

2.2 康萊特注射液

近年來，越來越多的中成藥也逐漸被用于腫瘤的化療?？等R特（KLT）注射液是從中藥薏苡仁中提取的有效成分，為雙相廣譜抗癌藥[25]。我國學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)[26]，在PTX 之前使用KLT 注射液可以增強(qiáng)PTX 對結(jié)直腸癌的細(xì)胞毒性及PTX 誘導(dǎo)微管蛋白聚合的能力。該研究在4 種不同結(jié)直腸癌細(xì)胞系中分別進(jìn)行了MTT 比色法，測得經(jīng)KLT 注射液預(yù)處理后再使用PTX 比單獨(dú)使用PTX 抑制的4 種腫瘤細(xì)胞活性比例均顯著增加，且經(jīng)混合藥物分析軟件得到在不同KLT 注射液與PTX 濃度下的CI 值均小于1，表明兩種藥物具有協(xié)同效應(yīng)。在之后的免疫印跡實(shí)驗(yàn)及免疫化學(xué)分析實(shí)驗(yàn)中，也證明了4 種結(jié)直腸癌細(xì)胞系經(jīng)KLT 注射液預(yù)處理后再使用PTX 能夠增強(qiáng)PTX 促微管蛋白聚合的能力，如在HCT-106 結(jié)直腸癌細(xì)胞系中，經(jīng)KLT注射液預(yù)處理后再使用PTX 的細(xì)胞系中的微管蛋白合成率較單獨(dú)使用PTX 的組別明顯增加了約20%，其余3 個(gè)細(xì)胞系也均顯著提高了PTX 促微管蛋白聚合的能力?？梢姡琄LT 注射液與PTX 聯(lián)合應(yīng)用具有較好的臨床應(yīng)用前景。

3 阻滯細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以增強(qiáng) PTX 誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡

在PTX 耐藥性的相關(guān)機(jī)制研究中，改變細(xì)胞信號(hào)通路這一研究方向越來越引起人們的興趣，這些對于轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)可能是一種新穎的抗腫瘤策略。

3.1 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路

MAPK 信號(hào)通路是信號(hào)從細(xì)胞表面轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者，它與細(xì)胞生長和存活的調(diào)節(jié)息息相關(guān)。MAPK 信號(hào)通路往往在人類惡性腫瘤中，尤其是結(jié)直腸癌中被異常激活[27]。MAPK 信號(hào)通路可以通過激活RAS 基因突變、過表達(dá)或激活表皮生長因子受體（EGFR）和激活RAF 基因突變等機(jī)制在人腫瘤細(xì)胞的發(fā)生中產(chǎn)生作用[28]。

PD98059 是MAPK 下游調(diào)節(jié)蛋白細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）的抑制劑，它可以抑制MAPK 信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)表明[29]，與PD98059 協(xié)同治療可顯著增強(qiáng)PTX 對結(jié)直腸癌SW480 與DLD-1 細(xì)胞系的凋亡作用，使用Hoechst 33342 進(jìn)行核染色可證明增加的凋亡細(xì)胞與PD98059 有關(guān)。通過siRNA 轉(zhuǎn)染來敲除SW480 與DLD-1 細(xì)胞系的ERK 表達(dá)，以直接阻斷MAPK 信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，更加證實(shí)了MAPK 信號(hào)通路的阻斷可以增強(qiáng)PTX對于結(jié)直腸癌細(xì)胞的促凋亡作用，而非PD98059自身其他未知的作用。研究同時(shí)指出，MAPK 信號(hào)通路的阻斷會(huì)引起P-蛋白下調(diào)，以此來降低腫瘤細(xì)胞的耐藥性，這也從另一方面說明了阻斷MAPK信號(hào)通路可以增加PTX 對結(jié)直腸癌細(xì)胞的療效。

3.2 磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）信號(hào)通路

PI3K 信號(hào)通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、增殖和分化的過程中均起到重要作用，并且也參與了腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥機(jī)制[30]。PI3K 是由p110a-p85,p110b-p85, p110d-p85 和衍生物異二聚體組成，可將磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)化為磷酸化的形式。胰島素、細(xì)胞因子、生長因子的各種刺激[31]可使p110亞基產(chǎn)生陽離子，進(jìn)而將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至下游效應(yīng)子，例如絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶（AKT）、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和 p70 核糖體蛋白 S6 激酶（S6K）。有研究指出[31]，低劑量的PTX 可上調(diào)PI3K 信號(hào)，尤其增加了結(jié)直腸癌細(xì)胞中的S6K 水平，從而造成了腫瘤細(xì)胞對PTX 的耐藥性。單獨(dú)使用PTX 可誘導(dǎo) 10%～20% 的結(jié)直腸癌 SW480 和DLD-1 細(xì)胞系停留在sub-G1階段，在使用PI3K 信號(hào)通路抑制劑LY294002 后，該比例增加至32%～33%。且隨著LY294002 的濃度增高，凋亡細(xì)胞的比例增加。通過siRNA 來敲除AKT 和使用mTOR 抑制劑雷帕霉素來抑制PI3K 的下游信號(hào)以確認(rèn)PI3K 阻滯可以增加PTX 對于結(jié)直腸癌細(xì)胞的促凋亡作用，而不是LY294002 的其他未知作用。

BEZ235 是PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路的新型抑制劑，可抑制PI3K 和mTOR 的活性，并同時(shí)抑制mTOR 阻止PI3K 活性的反饋激活[32-33]。先前的研究[34]表明，BEZ235 可有效抑制PIK3CA 突變和非突變的結(jié)直腸癌細(xì)胞系的生長。有文獻(xiàn)[20]指出，BEZ235 可以增加結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-116 和HT-29 對PTX 的敏感性，并且兩者的聯(lián)合治療可以通過細(xì)胞周期變化和凋亡途徑協(xié)同作用，增加結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-116 和HT-29 的死亡。通過細(xì)胞活性測定，單獨(dú)使用PTX 對于HCT-116 與HT-29 細(xì)胞系的 IC50分別為 9.72、9.51 nmol/L，當(dāng)與濃度為 25 nmol/L 的BEZ235 聯(lián)合使用時(shí)，PTX 對于這兩個(gè)結(jié)直腸癌細(xì)胞系的IC50均下降66%。并且，兩者聯(lián)合使用可使結(jié)直腸癌細(xì)胞于sub-G1期的細(xì)胞量增加了40.5%，即有效促進(jìn)了細(xì)胞系的凋亡。通過阻滯PI3K 信號(hào)通路，為PTX 用于結(jié)直腸癌的治療提供了新思路。

4 總結(jié)

現(xiàn)有治療結(jié)直腸癌的化療藥物毒副作用多、易產(chǎn)生耐藥性，許多研究力圖尋求新的化療方案來改變這一現(xiàn)狀。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)PTX 這一天然的抗腫瘤藥物因其獨(dú)特的作用機(jī)制及可修飾性已成為乳腺癌、小細(xì)胞肺癌和胰腺癌等惡性腫瘤的一線化療藥物。近年來，許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，PTX 可通過納米載藥系統(tǒng)的裝載、與其他藥物的結(jié)合、阻斷相關(guān)信號(hào)通路等途徑，有效、安全地應(yīng)用到結(jié)直腸癌的化療中，為開發(fā)結(jié)直腸癌的有效治療提供新的理論依據(jù)和治療策略。