廣東省牛流行熱病毒分離株JM 2020的全基因組測(cè)序及進(jìn)化分析

賈榮榮，汪祥斌，賈坤

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/廣東省寵物工程技術(shù)研究中心,廣東 廣州 510642)

牛流行熱(Bovine ephemeral fever)為蟲(chóng)媒介疾病，主要由庫(kù)蚊屬蚊子傳播，可引起奶牛、水牛突發(fā)高熱、肺炎、產(chǎn)奶產(chǎn)肉量下降、僵硬、跛、癱、母牛流產(chǎn)等[1-2]；最主要的特點(diǎn)是來(lái)勢(shì)迅猛，突發(fā)高熱，一般為雙相熱，可長(zhǎng)達(dá)5 d左右，癥狀較輕者可自行恢復(fù)，重者致殘、引起肺氣腫導(dǎo)致死亡[3]；呈現(xiàn)明顯的季節(jié)性和周期性，在溫暖潮濕的、適合蚊蟲(chóng)生長(zhǎng)繁殖的熱帶和亞熱帶地區(qū)，約3～5年大流行1次，近年有周期縮短的趨勢(shì)，在華南地區(qū)奶牛場(chǎng)幾乎每年都會(huì)流行[4]；發(fā)病率高達(dá)100%，青壯年牛易染病，死亡率1%～10%，最高可達(dá)到20%[5]；對(duì)廣東省畜牧經(jīng)濟(jì)影響重大，同時(shí)嚴(yán)重影響活體貿(mào)易[6]。

牛流行熱病毒(Bovine ephemeral fever virus，BEFV)為彈狀病毒科，暫時(shí)熱病毒屬成員，外形呈子彈狀，病毒體的大小為85 nm×180 nm左右[7]。目前為止，僅鑒定出1種血清型。病毒基因組約為14 900個(gè)核苷酸(nt)，按3'-N-P-M-G-[GNS-α1-α2-β-γ]-L-5'的順序編碼10個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，目前已經(jīng)確定了其中5種主要結(jié)構(gòu)蛋白，包括核蛋白(Nucleoprotein，N)、磷蛋白(Phosphoprotein，P)、基質(zhì)蛋白(Matrixprotein，M)、糖蛋白(Glycoprotein，G)和RNA依賴性聚合酶(Large multi-functional enzyme，L)，還有1個(gè)比較特殊的非結(jié)構(gòu)糖蛋白II(Non-structural glycoprotein II，GNS)，其基因?yàn)槲挥贕基因下游的第2個(gè)糖蛋白基因，但在病毒粒子中并未發(fā)現(xiàn)該蛋白，可能在自然感染宿主的過(guò)程中發(fā)揮作用[8]。

在我國(guó)，牛流行熱于1934年首次在江蘇省被報(bào)道。自1955年以來(lái)，該病迅速傳播擴(kuò)散到我國(guó)的25個(gè)省份，其中，包括平均海拔超過(guò)4 000 m的西藏地區(qū)[9]。1991年8月位于我國(guó)44°N的吉林省某些地區(qū)報(bào)道出現(xiàn)了牛流行熱。2011—2014年，對(duì)奶牛、水牛和耗牛進(jìn)行血清學(xué)調(diào)查，在全國(guó)19個(gè)省、5個(gè)自治區(qū)和2個(gè)直轄市均檢測(cè)到了BEFV中和抗體，其中，包括東北部的黑龍江[10]。這些發(fā)現(xiàn)表明中國(guó)的BEFV感染范圍可能比臨床觀察的要廣。因此，本研究對(duì)近年流行的病毒進(jìn)行連續(xù)監(jiān)視，對(duì)了解流行病學(xué)模式、遺傳進(jìn)化以及病毒之間的抗原關(guān)系至關(guān)重要。

1 材料與方法

1.1 病毒株

JM 2020病毒原液分離于廣東省江門市疑似牛流行熱病牛全血，將牛全血樣品接種入乳鼠腦內(nèi)盲傳3代，每代乳鼠腦組織都進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)[11]。將第3代檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的腦組織勻漿處理后，用高速冷凍低溫離心機(jī)在4℃條件下，6 000 r/min離心10min，取上清液接種于BHK-21細(xì)胞，傳代培養(yǎng)有明顯病變后收集病毒液。采集的全血和凍存的病毒液均保存于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院外科實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要試劑

通用RNA提取試劑盒購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa有限公司，DNA純化回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，pEASY?-Blunt Simple Cloning Kit試劑盒購(gòu)自全式金試劑公司，細(xì)胞用DMEM、PBS以及預(yù)染蛋白Marker購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)

從GenBank下載已發(fā)表的BEFV全長(zhǎng)基因組序列[12]，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)G基因以及10個(gè)片段引物(表1)。所有引物均合成于廣州天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司。

表1 擴(kuò)增G基因以及JM 2020全基因組序列引物Table 1 Primers employed for the amplication of G gene and whole genome of JM 2020 strain

1.4 RNA提取

根據(jù)通用RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取病毒液樣品總RNA，取200μL病毒液樣品至無(wú)RNA酶的離心管中，避光加入1m L RL溶液，渦旋震蕩15 s后室溫靜置5 min；加入200μL三氯甲烷，渦旋震蕩15 s后室溫靜置3min；高速低溫離心機(jī)4℃、12 000 r/min離心10min，樣品將分為3層，取第1層水相層到新的無(wú)RNA酶的離心管中；加入水相層50%體積的無(wú)水乙醇，混勻后將溶液轉(zhuǎn)移到純化柱中，4℃、12 000 r/min，離心30 s，棄廢液；加入500μLRPI溶液，4℃、12 000 r/min離心30 s，棄廢液；加入500μL RW溶液，室溫靜置2min，4℃、12 000 r/min離心30 s，棄廢液；加入500μLRW溶液，室溫靜置2min，4℃、12 000 r/min離心30 s，棄廢液；4℃、12 000 r/min離心2 min，充分晾干；將純化柱轉(zhuǎn)移到新的無(wú)RNA酶的離心管中，加入30μL RNase-free ddH2O室溫靜置2 min，4℃、12 000 r/min離心2 min，得到總RNA，儲(chǔ)存于?80 ℃冰箱備用。

1.5 G基因及全基因組的擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增G基因及有重疊序列的10個(gè)片段，反應(yīng)條件為95℃3 min；95℃15 s、55℃15 s、72℃1min，35個(gè)循環(huán)；72℃5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于15 g/L瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，結(jié)束后使用凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察；切下目的膠塊用于純化回收DNA片段；連接pEasy?-Blunt載體后，轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌落經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性菌落后測(cè)序。

1.6 G基因進(jìn)化分析及全基因組序列分析

對(duì)JM 2020毒株G基因全長(zhǎng)序列、疫苗株JB76H、JT02L、LS11 2011等以及不同地區(qū)野毒株共70株毒株進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，使用DNAStar中Editseq和M egalign對(duì)G基因核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行編輯和相似性比較，并使用MEGA 6.0繪制BEFV G基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，分析獲得的野毒株G基因與其他地理株之間的差異。選取分支代表序列，先用鄰近法構(gòu)建初步進(jìn)化樹(shù)，然后用最大似然法重復(fù)計(jì)算構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 G基因與全基因組的擴(kuò)增

以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，使用設(shè)計(jì)的引物分別對(duì)G基因(圖1)及10個(gè)片段(圖2)進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，電泳結(jié)合測(cè)序結(jié)果顯示在1 872、820、2 120、1 455、2 066、2 196、864、1 275、1904、2 181、2 185 bp處有明亮條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。將測(cè)序結(jié)果比對(duì)后進(jìn)行拼接，JM 2020全長(zhǎng)為14 902 nt。

圖1 PCR擴(kuò)增G基因Fig.1 PCR amplification of G gene

圖2 全基因組(G基因及10個(gè)片段)PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Results of whole genome(G gene and 10 fragments)amplification by PCR

2.2 G基因序列相似性及系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了更詳細(xì)地研究廣東BEFV毒株的遺傳進(jìn)化關(guān)系和分子流行病學(xué)，使用MEGA 6.0軟件對(duì)測(cè)序所得的BEFV G基因與Genbank下載的國(guó)內(nèi)外共70株毒株G基因進(jìn)行分析并構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示，BEFV感染區(qū)域主要分為東亞、澳大利亞及中東3個(gè)地區(qū)；本毒株與中國(guó)、日本及泰國(guó)流行的毒株處于一大分支，與qy2017/China/2017、TH/NMA0012/2015/Thailand/2015、TH/NMA0025/2015/Thailand/2015、TH/NMA 0076/2013/Thailand/2013、TH/NM 0072/2017/Thailand/2017關(guān)系較近，JM 2020與疫苗株JB76H處于不同小分支，關(guān)系較遠(yuǎn)(圖3)。

圖3 JM 2020G基因進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of JM 2020G gene

核苷酸序列相似性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，JM 2020 G基因和全球BEFV G基因之間的核苷酸序列相似性為90.1%～99.3%；其中，與澳大利亞毒株的相似性最低，為90.1%～91.1%，與中東毒株相似性為92.0%～92.4%，與國(guó)內(nèi)流行株相似性為95.5%～98.9%，與泰國(guó)地區(qū)毒株相似性為94.9%～99.3%(圖4)。

圖4 JM 2020毒株G基因核苷酸相似性分析(部分)Fig.4 Nucleotide similarity analysis of G gene of JM 2020 strain (part)

G蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為72 300，含有特異的中和抗原位點(diǎn)，是誘導(dǎo)牛保護(hù)性免疫的主要抗原蛋白[13]。G蛋白包括4個(gè)抗原位點(diǎn)：G1(第487～503 aa)，G2(第168～189 aa)，G3(第49～63 aa、第215～231 aa和第262～271 aa)和G4(第455～482 aa)；G基因序列有較高的保守性，在毒株之間具有超過(guò)90%的相似性；G蛋白抗原位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，在高保守性抗原蛋白的G 2(T 170N)、G 3(K 53N、G 263E)及G4(K461E、I475M)出現(xiàn)5個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變(圖5)，這可作為近年來(lái)JB76H疫苗對(duì)廣東地區(qū)保護(hù)效果差的原因之一。

圖5 JM 2020毒株G蛋白抗原位點(diǎn)分析Fig.5 Antigenic sites of G protein of JM 2020 strain

2.3 全基因組系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

應(yīng)用MEGA 6.0軟件構(gòu)建JM 2020毒株全基因組系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示，JM 2020毒株與泰國(guó)毒株TH/LRI0045/East Asia/2016親緣關(guān)系最近，與南非毒株RSA/OBP/BEF2008/South Africa/2008親緣關(guān)系最遠(yuǎn)(圖6)。

圖6 JM 2020毒株全基因組進(jìn)化樹(shù)Fig.6 Phylogenetic tree of whole genome of JM 2020 strain

2.4 全基因組結(jié)構(gòu)分析

JM 2020病毒全基因組的GC含量為33.35%，包括1個(gè)50 nt的前導(dǎo)序列、1 296 nt的N基因、837 nt的P基因、672 nt的M基因、1 872 nt的G基因、1 812 nt的GNS基因、618 nt的α1、α2基因、444 nt的β蛋白基因、345 nt的γ蛋白基因、6 444 nt的L基因和73 nt的尾隨序列(表2)。每個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄起始信號(hào)和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)序列保守，分別為AACAGG和CATGAAAAAAA，而α1、α2基因的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)序列為CTTGAAAA AAA。

表2 JM 2020單個(gè)基因編碼區(qū)之間的起始信號(hào)和終止信號(hào)Table2 Initiation signal and termination signal between individual gene coding region of JM 2020 strain

分離株JM 2020前導(dǎo)序列與其他7株毒株前導(dǎo)序列的前31 nt高度保守，3′端前導(dǎo)序列和5′端尾隨序列具有互補(bǔ)特性，最多可互補(bǔ)9 nt。此外，本毒株同qy2017及泰國(guó)株均出現(xiàn)P′基因截?cái)郲14]的情況(圖7)，P′蛋白是P基因多順?lè)醋拥漠a(chǎn)物，正常株P(guān)′為49 aa，JM 2020株P(guān)′為22 aa。截?cái)嗟脑蚩赡苁腔虬l(fā)生突變，導(dǎo)致翻譯提前終止。由此推測(cè)，P′蛋白是非功能性蛋白，不參與病毒結(jié)構(gòu)的組成。截?cái)嗟腜′蛋白對(duì)病毒復(fù)制周期的影響仍有待闡明[15]。

圖7 JM 2020毒株P(guān)′基因序列分析Fig.7 Analysis of P′ gene sequence of JM 2020 strain

由表3可知，在氨基酸水平，N蛋白氨基酸序列最為保守，與其他毒株的平均相似性為98.9%；其次為L(zhǎng)蛋白(平均相似性為97.9%)、G蛋白(平均相似性為96.6%)、M蛋白(平均相似性為95.2%)、GNS蛋白(平均相似性為93.0%)和P蛋白(平均相似性為90.2%)?？傮w上，JM 2020毒株各基因與泰國(guó)株TH/LRI0045/East Asia/2016毒株相比變異最小，JM 2020全基因組和泰國(guó)分離株核苷酸序列相似性最高，為99.0%；這表明廣東近年流行株JM 2020和泰國(guó)分離株很可能具有相同的起源。且有分析顯示，BEFV分離株的進(jìn)化關(guān)系與地理位置密切相關(guān)[16-17]。

表3 JM 2020與參考毒株各基因編碼區(qū)氨基酸序列相似性Table 3 Amino acid sequence similarity of individual gene coding region between JM 2020 and reference strains%

3 討論與結(jié)論

牛流行熱在廣東省每年都有小范圍流行[17]，比中國(guó)其他地區(qū)更常見(jiàn)。根據(jù)本研究前期調(diào)研顯示，2013—2017年，在兩廣地區(qū)每年都檢測(cè)到BEFV，截至2022年，已檢測(cè)到包括JM 2020在內(nèi)共6株BEFV毒株。基于JM 2020全基因組序列的分子特征和G基因的系統(tǒng)發(fā)育分析，證明了JM 2020與其他地理區(qū)域，尤其是與泰國(guó)的BEFV遺傳關(guān)系較近，這為BEFV在東亞和東南亞之間流通提供了證據(jù)。有證據(jù)表明，BEFV分離株之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與地理位置密切相關(guān)[16-17]。風(fēng)和動(dòng)物活體貿(mào)易在BEFV的跨界傳播中起重要作用[18]。由于季風(fēng)環(huán)流的作用，夏季風(fēng)在高溫季節(jié)給泰國(guó)和我國(guó)的亞熱帶地區(qū)帶來(lái)豐沛的降水，形成溫暖濕潤(rùn)的氣候，有利于泰國(guó)蟲(chóng)媒介乘風(fēng)傳入中國(guó)廣東沿海地區(qū)，這為蟲(chóng)媒介的繁殖和傳播病毒提供了有利的條件，由于BEFV核苷酸序列數(shù)量有限，東亞和東南亞之間的BEFV傳播的具體途徑仍然未知。中國(guó)為泰國(guó)農(nóng)產(chǎn)品最重要的出口市場(chǎng)之一，但截至2022年，泰國(guó)牛肉還未獲得中國(guó)市場(chǎng)準(zhǔn)入許可，中泰兩國(guó)還沒(méi)有牛肉進(jìn)出口方面的相關(guān)協(xié)議；因此，基本可以排除通過(guò)活體貿(mào)易傳播BEFV的可能。

進(jìn)化分析表明，JM 2020毒株與2017年在廣東清遠(yuǎn)地區(qū)檢測(cè)到的毒株qy2017核苷酸序列相似性為98.9%，與2017年以前廣東地區(qū)檢測(cè)到的BEFV序列相似性較低。但本毒株與2013—2017年的泰國(guó)流行株(TH/LRI0045/East Asia/2015等)G基因以及全基因組的核苷酸和氨基酸序列相似性均最高，G蛋白氨基酸序列相似性更是高達(dá)99.2%，這表明近幾年所流行毒株應(yīng)與泰國(guó)株密切相關(guān)，且2株毒株和泰國(guó)株處于同一分支，很可能具有相同起源。JM 2020與疫苗株JB 76H、JT02L等國(guó)內(nèi)毒株核苷酸序列相似性為95.1%～98.0%，存在一定進(jìn)化距離。qy2017與泰國(guó)株的氨基酸序列相似性最高，為99.4%，表明該毒株很可能是從泰國(guó)傳入，而JM 2020可能是1株新的突變株。這一研究對(duì)廣東地區(qū)BEFV的流行及進(jìn)化情況有了一定了解，豐富中國(guó)流行BEFV基因庫(kù)的同時(shí)，為病毒的變異性研究和新型快速診斷技術(shù)的研發(fā)提供了新的BEFV種源，為開(kāi)發(fā)有效、保護(hù)力更強(qiáng)的新疫苗[19]提供了依據(jù)。

本研究成功擴(kuò)增且測(cè)定了廣東近年來(lái)流行毒株JM 2020全基因組，繪制了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)JM 2020與泰國(guó)株進(jìn)化關(guān)系最近，核苷酸序列相似性最高，與澳大利亞毒株最遠(yuǎn)；與JB76H G基因核苷酸序列有一定差異。全基因組結(jié)構(gòu)分析為在基因結(jié)構(gòu)方面對(duì)BEFV進(jìn)行分子研究提供了有用信息，了解BEFV的基因進(jìn)化關(guān)系及基因組特征有助于廣東省牛流行熱流行病學(xué)的研究。