3種體外培養(yǎng)方法誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化效果比較

周 巖， 金蓮花，盧 娜，韓立志

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院小兒心血管科，吉林 長(zhǎng)春 130021)

擴(kuò)張型心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)是一種臨床常見的心肌病，該病預(yù)后差，5～10年生存率較低(30%～40%)[1-2]，目前尚無特效的治療藥物及治療方法[3]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)作為一類研究較早、較深入的成體干細(xì)胞，具有多種分化潛能，現(xiàn)已成為以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的治療策略中不可或缺的重要種子細(xì)胞，對(duì)維持組織穩(wěn)態(tài)和再生能力必不可少[4-5]。研究[6-8]表明：BMSCs可以分化為心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，是目前心血管疾病細(xì)胞移植治療的理想種子細(xì)胞，已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。但BMSCs向心肌細(xì)胞的分化率較低，其分化機(jī)制及誘導(dǎo)分化條件等問題均有待解決。本研究旨在探討在體外不同誘導(dǎo)條件下BMSCs分化為心肌細(xì)胞的作用，模擬DCM體內(nèi)微環(huán)境誘導(dǎo)分化BMSCs，尋找BMSCs誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞的最佳方法，為采用BMSCs移植治療DCM奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器 Wistar大鼠乳鼠15只，出生5 d，購(gòu)自吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(吉)2013-0001。DCM大鼠為本課題組在前期工作中用阿霉素誘導(dǎo)制備。FITC 標(biāo)記的CD44和CD105抗體、 PE標(biāo)記的CD29和CD34抗體購(gòu)自美國(guó)DAKO公司， 胎牛血清(FBS)和L-DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司，Trizol試劑盒購(gòu)自美Invitrogen 公司，RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒和細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司。VE-180型垂直電泳槽、VE-186轉(zhuǎn)移電泳儀和Tanon 1600型凝膠成像系統(tǒng)均購(gòu)自上海天能科技有限公司， FACSCalibur 流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD 公司。

1.2 BMSCs的分離培養(yǎng)及鑒定 頸椎脫臼法處死出生5 d大鼠(體質(zhì)量為8～10 g)，75%酒精浸泡5 min，無菌條件下分離股骨脛骨，剪去骨兩端，收集細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代BMSCs，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34、CD44、CD29和CD105表達(dá)。同時(shí)采用成脂和成骨誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)分化，觀察細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)，在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后行堿性磷酸酶染色鑒定。成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)后油紅O染色鑒定。

1.3 3種體外誘導(dǎo)方法培養(yǎng)大鼠BMSCs ①5-氮胞苷(5-aza)組： 3代BMSCs接種于6孔板內(nèi)(孔內(nèi)預(yù)置無菌蓋玻片)，24 h后換用含10 μmol·L-15-aza、10%FBS的L-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液更換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。②DCM模型大鼠心肌細(xì)胞裂解液組：處死DCM模型大鼠，迅速取出心臟，預(yù)冷生理鹽水沖洗后，置于冰上，按150 mg組織加入1 mL L-DMEM培養(yǎng)基比例加入L-DMEM培養(yǎng)基，制備心肌細(xì)胞裂解液。采用DCM大鼠心肌細(xì)胞裂解液誘導(dǎo)培養(yǎng)大鼠BMSCs，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含10%心肌細(xì)胞裂解液和10%FBS的L-DMEM培養(yǎng)基。③DCM模型大鼠血清+5-aza組：腹主動(dòng)脈采集DCM模型大鼠全血，分離血清，采用DCM大鼠血清+5-aza誘導(dǎo)培養(yǎng)BMSCs，誘導(dǎo)培養(yǎng)方法為5 μmol·L-15-aza干預(yù)培養(yǎng)24 h后去培養(yǎng)液，改用含20%DCM大鼠血清的L-DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。對(duì)照組BMSCs始終采用含10%FBS 的L-DMEM培養(yǎng)基在同等條件下培養(yǎng)，每3～4 d換液1次。

1.4 RT-PCR法檢測(cè)BMSCs中cTnT mRNA表達(dá) 采用Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA,檢測(cè)總RNA純度，A(260)/A(280)為1.9～2.1,說明RNA純度比較好，一步法RT-PCR試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA, PCR擴(kuò)增cDNA，取20 μL PCR產(chǎn)物于3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。β-actin引物：147 bp，P1 5′-GTCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3′，P2 5′-AGAGGTCTTTACGGATGTCAACGT-3′；cTnT引物： 202 bp，P1 5′-GCAGGCTCTTCATGCCCAACT-3′，P2 5′-CGC-

TCTGCCCGACGCTTTT-3′。

1.5 Western blotting法檢測(cè)BMSCs中 cTnT蛋白表達(dá) 冰浴下刮取細(xì)胞并裂解，4℃離心獲得的上清液即是總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。制作蛋白電泳濃縮膠及分離膠，取30 μg蛋白上樣，進(jìn)行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳2 h，半干式轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗溶液(兔抗大鼠cTnT單抗，稀釋度為1∶100) 4℃過夜孵育,辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗溶液室溫孵育1 h，DAB顯色，凝膠成像系統(tǒng)攝片，觀察cTnT蛋白表達(dá)情況。

1.6 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)BMSCs中cTnT陽性表達(dá)率 取出細(xì)胞爬片 PBS沖洗2 min×3次，4%多聚甲醛固定30 min，3%過氧化氫甲醇液浸泡30 min，封閉內(nèi)源性過氧化物酶，1%Triton X-100破膜，PBS沖洗后，按照免疫組織化學(xué)試劑盒說明書操作。結(jié)果判定：細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕褐色顆粒為陽性,每組觀察計(jì)數(shù)5個(gè)低倍視野，計(jì)算cTnT陽性表達(dá)率。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠BMSCs的分離培養(yǎng)及鑒定 分離獲得的細(xì)胞培養(yǎng)48 h后換液，鏡下可見部分呈梭形生長(zhǎng)的貼壁細(xì)胞，少數(shù)細(xì)胞為多角形；培養(yǎng)7～10 d單層生長(zhǎng)細(xì)胞達(dá)80%～90%融合，呈旋渦狀排列(圖 1)。第3代BMSCs高表達(dá)MSCs的特征性表面標(biāo)記CD44、CD29和CD105，不表達(dá)造血干細(xì)胞的特征性表面標(biāo)志CD34(圖 2)。BMSCs成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)下分化為成骨細(xì)胞，堿性磷酸酶染色陽性，胞漿內(nèi)有灰黑色沉淀；在成脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)下分化為脂肪細(xì)胞，油紅O染色陽性，胞漿內(nèi)有橘紅色脂肪滴(圖3，見插頁五)。

A：BMSCs (4 d); B：BMSCs (10 d);C: Subculture for 24 h(passage 3); D: Subculture for 7 d (passage 3).圖1 BMSCs的形態(tài)表現(xiàn) (×40)Fig.1 Morphology of BMSCs(×40)

A:FITC-control;B:CD44;C:CD105;D:PE-control;E:CD29;F:CD34.圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BMSCs表面抗原的表達(dá)Fig.2 Expressions of surface antigens of BMSCs detected by flow cytometry

A:Oil red O staining; B: Alkaline phosphates staining.
圖3 BMSCs的脂肪和成骨分化 (×100)
Fig.3 Adipogenic and osteogenic differentiation of BMSCs(×100)

2.2 3種體外培養(yǎng)方法誘導(dǎo)培養(yǎng)的大鼠BMSCs形態(tài)表現(xiàn) 對(duì)照組BMSCs呈成纖維細(xì)胞樣整齊排列，未發(fā)生形態(tài)改變(圖4)。5-aza組BMSCs誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d，細(xì)胞增大明顯，逐漸變?yōu)槎讨鶢?，排列方向一致，?xì)胞增殖減慢，部分細(xì)胞脫壁死亡；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，貼壁細(xì)胞數(shù)量較同期對(duì)照組明顯減少，形態(tài)多樣，胞漿粗糙，2周后出現(xiàn)肌絲樣結(jié)構(gòu)(圖5)；DCM模型大鼠心肌細(xì)胞裂解液組BMSCs生長(zhǎng)狀態(tài)較5-aza組好，誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d，細(xì)胞變寬，呈柱狀，排列具有方向性，2周后出現(xiàn)肌絲樣結(jié)構(gòu)(圖 6)。DCM模型大鼠血清+5-aza組BMSCs生長(zhǎng)狀態(tài)明顯優(yōu)于前2組，7 d后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，多緊密平行排列生長(zhǎng)，體積變大；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)梭形細(xì)胞的比例下降，多呈桿狀，少數(shù)細(xì)胞呈不規(guī)則外形，相鄰細(xì)胞間的胞膜有接觸，逐漸相連呈肌管狀(圖7)。

A: Culture 7 d; B: Culture 14 d; C: Culture 21 d; D: Culture 28 d.圖4 對(duì)照組大鼠BMSCs形態(tài)表現(xiàn) (×100)Fig.4 Morphology of rat BMSCs in control group(×100)

A: Culture 7 d; B: Culture 14 d; C: Culture 21 d; D: Culture 28 d.圖5 5-aza組大鼠BMSCs形態(tài)表現(xiàn) (×100)Fig.5 Morphology of rat BMSCs in 5-aza group(×100)

A:Culture 7 d; B: Culture 14 d; C: Culture 21 d; D: Culture 28 d.圖6 DCM模型大鼠心肌細(xì)胞裂解液組BMSCs形態(tài)表現(xiàn) (×100)Fig.6 Morphology of rat BMSCs in DCM model rat myocardial cell cleavage group(×100)

A: Culture 7 d; B: Culture 14 d; C: Culture 21 d; D: Culture 28 d.圖7 DCM模型大鼠血清+5-aza組BMSCs形態(tài)表現(xiàn)(×100)Fig.7 Morphology of rat BMSCs in DCM model rat serum +5-aza group(×100)

2.3 各組大鼠BMSCs 中cTnT mRNA和蛋白表達(dá) 5-aza組、DCM模型大鼠心肌細(xì)胞裂解液組和DCM模型大鼠血清+5-aza組BMSCs誘導(dǎo)培養(yǎng)28 d后，均可見cTnT mRNA和蛋白表達(dá)，對(duì)照組BMSCs中未見cTnT mRNA和蛋白表達(dá)(圖 8)。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：5-aza組、DCM模型大鼠心肌細(xì)胞裂解液組和DCM模型大鼠血清+5-aza組BMSCs體外誘導(dǎo)培養(yǎng)7、14、21和28 d時(shí)cTnT均呈陽性表達(dá)，隨時(shí)間延長(zhǎng)，cTnT陽性表達(dá)率明顯增高，DCM模型大鼠血清+5-aza組BMSCs中cTnT陽性表達(dá)率最高； 21和28 d時(shí),與5-aza組和DCM模型大鼠心肌細(xì)胞裂解液組比較，DCM模型大鼠血清+5-aza組 BMSCs中cTnT陽性表達(dá)率明顯升高(P=0.048，P=0.036；P=0.026，P=0.020)。對(duì)照組BMSCs中未見cTnT表達(dá)。見圖9(插頁五)和表1。

Lane 1: Control group; Lane 2: 5-aza group; Lane 3: DCM model rat myocardial cell cleavage group;Lane 4: DCM model rat serum +5-aza group.
圖8 各組BMSCs中cTnT mRNA(A)和蛋白表達(dá)(B)電泳圖
Fig.8 Expressions of cTnT mRNA(A) and protein (B) in BMSCs in various groups

表1 各組大鼠BMSCs中cTnT陽性表達(dá)率Tab.1 Positive expression rates of cTnT in BMSCs in various groups

*P<0.05 compared with 5-aza group;△P<0.05 compared with DCM model rat myocardial cell cleavage group.

3 討 論

BMSCs來源廣泛，具有低免疫原性、可以分化為多種組織細(xì)胞且分離培養(yǎng)較為容易，在組織器官損傷性疾病、組織器官退行性疾病和遺傳缺陷疾病等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。研究[9]表明：BMSCs可以分化為心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞,已經(jīng)成為心血管疾病細(xì)胞移植治療的理想種子細(xì)胞，是近年來心血管疾病領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

5-aza是胞嘧啶核苷的一個(gè)類似物，是一種去甲基化藥物，可引起DNA中某些胞嘧啶的低甲基化，從而使控制向心肌分化的特定調(diào)控基因阻遏蛋白去甲基化而發(fā)生構(gòu)型改變，促進(jìn)BMSCs向心肌細(xì)胞分化。1995年WAKITANI等[10]首先證實(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞(marrow mesenchymal stem cells, MSCs)在體外經(jīng)5-aza誘導(dǎo)后分化成心肌樣細(xì)胞，分化率約為30%。有文獻(xiàn)[11-14]報(bào)道：5-aza能誘導(dǎo)BMSCs分化為心肌表型，10 μmol·L-1為5-aza誘導(dǎo)BMSCs的最佳劑量，但是隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，其對(duì)細(xì)胞的毒性也會(huì)越來越大，可以引起干細(xì)胞的凋亡。干細(xì)胞進(jìn)入體內(nèi)不同器官能在不同的環(huán)境及生長(zhǎng)因子作用下發(fā)生定向分化，其中微環(huán)境是誘導(dǎo)干細(xì)胞分化的關(guān)鍵因素。在體外模擬心肌微環(huán)境，可高效誘導(dǎo)BMSCs分化為心肌細(xì)胞。如通過體外心肌細(xì)胞與MSCs共同培養(yǎng)、添加心肌細(xì)胞裂解液和添加心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液等體外模擬心肌微環(huán)境的方法均可誘導(dǎo)BMSCs分化為心肌細(xì)胞[15-16]。本研究中，大鼠BMSCs分為3組，5-aza組采用10 μmol· L-15-aza進(jìn)行誘導(dǎo)，DCM模型大鼠心肌細(xì)胞裂解液組采用DCM大鼠心肌細(xì)胞裂解液進(jìn)行誘導(dǎo)，DCM模型大鼠血清+5-aza組采取減少5-aza用量(5 μmol·L-1)并結(jié)合DCM大鼠血清進(jìn)行誘導(dǎo)，觀察采用不同誘導(dǎo)方法培養(yǎng)后BMSCs向心肌細(xì)胞分化的效果。本研究結(jié)果顯示：DCM模型大鼠血清+5-aza組BMSCs生長(zhǎng)狀態(tài)明顯優(yōu)于5-aza組和DCM模型大鼠心肌細(xì)胞裂解液組，7 d后細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)變化，多緊密平行排列生長(zhǎng),體積變大，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)梭形細(xì)胞的比例下降，多呈桿狀，少數(shù)細(xì)胞呈不規(guī)則外形,相鄰細(xì)胞間的胞膜有接觸，排列具有方向性，逐漸相連呈肌管狀。cTnT是心肌肌鈣蛋白中具有較高特異性的亞型，是鑒定心肌源性細(xì)胞的特異性標(biāo)志物[17-20]。本研究中RT-PCR法和Western blotting法檢測(cè)結(jié)果顯示：3組BMSCs體外誘導(dǎo)培養(yǎng)后均可見cTnT mRNA和蛋白表達(dá)；免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：隨時(shí)間延長(zhǎng)，cTnT陽性表達(dá)率逐漸升高，DCM模型大鼠血清+5-aza組cTnT表達(dá)陽性率最高。研究[21-23]表明：心肌微環(huán)境中的各種因素為MSCs向心肌細(xì)胞定向分化提供了關(guān)鍵的信號(hào)，即“環(huán)境誘導(dǎo)分化”，包括化學(xué)性因素和物理性因素?；瘜W(xué)因素包括細(xì)胞因子、激素、離子梯度和其他可溶性因子；物理性因素可能包括細(xì)胞間的直接/間接接觸，剛性細(xì)胞外基質(zhì)，流體剪切應(yīng)力和機(jī)械張力等[24]。本研究在體外采用DCM模型大鼠心肌細(xì)胞裂解液和DCM模型大鼠血清+5-aza培養(yǎng)BMSCs均顯示出較好的向心肌細(xì)胞分化的結(jié)果，均比單純應(yīng)用5-aza誘導(dǎo)效果好，其機(jī)制考慮與心肌損傷后產(chǎn)生的細(xì)胞因子、激素和可溶性因子等有關(guān)。本研究采用10 μmol·L-15-aza 對(duì)BMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)，可以使其向心肌細(xì)胞分化，但在培養(yǎng)過程中呈現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)差，出現(xiàn)較多的細(xì)胞脫壁死亡,考慮與5-aza的細(xì)胞毒性有關(guān)；但DCM模型大鼠心肌細(xì)胞裂解液和DCM模型大鼠血清+5-aza(5 μmol·L-1)誘導(dǎo)組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，出現(xiàn)細(xì)胞脫壁死亡的數(shù)量較少,考慮DCM模型大鼠心肌細(xì)胞裂解液及血清均可誘導(dǎo)BMSCs向心肌細(xì)胞分化。本研究中DCM模型大鼠血清+5-aza(5 μmol·L-1)組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)及向心肌細(xì)胞分化的結(jié)果最佳。推測(cè)其原因可能為：一方面DCM大鼠模型血清可能含有相關(guān)細(xì)胞因子等誘導(dǎo)BMSCs向心肌細(xì)胞分化；另一方面與減少5-aza的劑量，降低了5-aza的細(xì)胞毒性有關(guān)。

A: Control group;B: 5-aza group;C: DCM rat model myocardial cell cleavage group;D: DCM rat serum +5-aza group.
圖9 各組大鼠BMSCs中cTnT的表達(dá)情況(免疫組織化學(xué),×100)
Fig.9 Expressions of cTnT in BMSCs of rats in various groups (Immunohistochemistry,×100)

綜上所述，本研究采用5-aza、DCM模型大鼠的心肌細(xì)胞裂解液、DCM模型大鼠血清+5-aza 3種方法體外誘導(dǎo)大鼠BMSCs向心肌細(xì)胞分化，DCM模型大鼠血清+5-aza組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)最佳，心肌源性細(xì)胞的特異性標(biāo)志物cTnT表達(dá)最高，向心肌細(xì)胞分化的結(jié)果最佳。本研究結(jié)果為BMSCs移植治療DCM奠定了基礎(chǔ)。