河北省葡萄座腔菌科菌物系統(tǒng)分類研究

王慶靈，于貴朋，邢軍超，崔建州，趙嘉平

（1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)新技術(shù)研究所，北京 100091；2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)試驗(yàn)中心，廣西 憑祥 532600；3.河北省塞罕壩機(jī)械林場(chǎng)，河北 承德 068450；4.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，河北 保定 071001）

樹木潰瘍病是引起多種樹木流水流膠、組織壞死和在病斑周圍形成愈傷組織等癥狀的病害總稱。葡萄座腔菌科Botryosphaeriaceae 真菌是引起樹木潰瘍病的主要菌物[1-2]。狹義上，樹木潰瘍病原真菌是指葡萄座腔菌科真菌，具有寄主植物多樣、危害癥狀復(fù)雜、分布廣泛等特征[1,3]。樹木潰瘍病病原真菌危害多種生態(tài)及經(jīng)濟(jì)林木的發(fā)展，特別是對(duì)楊樹人工林[4-5]，已造成嚴(yán)重的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)損失，是我國(guó)森林生物災(zāi)害之一[6]。在河北省，葡萄座腔菌科真菌曾引發(fā)核桃Juglans regia、板栗Castanea mollissima等多種植物的枝干潰瘍病，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致整株死亡[7-9]。雖然葡萄座腔菌科真菌的有性型名稱更適合形態(tài)鑒定，但由于在自然界和培養(yǎng)條件下很少見到有性型，因此鑒定相應(yīng)真菌的主要依據(jù)是較為常見的無性型；然而，某些種類真菌的無性型形態(tài)的某些特征會(huì)出現(xiàn)交叉重疊現(xiàn)象，且某類的孢子可能隨著孢子發(fā)育的時(shí)間發(fā)生變化[10-14]。因此，形態(tài)鑒定結(jié)合分子鑒定成為葡萄座腔菌科真菌的現(xiàn)代分類方法，有時(shí)會(huì)考慮病原的致病力和病害癥狀等[15-21]。筆者從河北省各地的樹木上采集到疑似潰瘍病的枝干樣本，并分離出菌株。然后綜合應(yīng)用培養(yǎng)學(xué)、形態(tài)學(xué)以及rDNA-ITS 系統(tǒng)發(fā)育特征對(duì)河北省樹木潰瘍病害的病原菌物進(jìn)行分類鑒定，其研究結(jié)果將為河北省樹木枝干潰瘍類病害的綜合控制奠定堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2011年1—5月份從河北省石家莊、保定、滄州、邢臺(tái)、邯鄲、衡水、承德、張家口等8 個(gè)縣市廣泛采集不同樹種、不同病害癥狀的樹木潰瘍病枝干樣本。將新鮮的有典型發(fā)病癥狀的枝干標(biāo)本，在室內(nèi)利用常規(guī)組織分離法和菌落邊緣菌絲純化法得到供試菌株[20]。分離和純化實(shí)驗(yàn)均在2% PDA 培養(yǎng)基上進(jìn)行，共得到73 份試驗(yàn)菌株。

1.2 病原菌的形態(tài)鑒定

1.2.1 培養(yǎng)學(xué)、形態(tài)學(xué)特征的獲得

本研究試驗(yàn)菌株活化培養(yǎng)采用2%PDA 培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，水 1 000 mL），25 ℃、黑暗培養(yǎng)4 ～7 d，觀察菌落典型特征。采用松針培養(yǎng)基誘導(dǎo)子實(shí)體形成，具體方法為：健康、新鮮的西黃松Pinus ponderosa Dougl.ex Laws松針剪成4 ～6 cm 小段，滅菌后放置在凝固的無菌水瓊脂培養(yǎng)基上，接入試驗(yàn)菌株P(guān)DA 培養(yǎng)物，封上封口膜；28 ℃黑暗培養(yǎng)10 d 左右，去掉封口膜，于室溫條件下繼續(xù)黑光燈光照培養(yǎng)20 d 以誘導(dǎo)子實(shí)體的形成，鏡檢試驗(yàn)菌株的形態(tài)學(xué)特征。

1.2.2 培養(yǎng)學(xué)、形態(tài)學(xué)特征的觀察

取典型的菌株子實(shí)體分別做徒手切片，在顯微鏡下觀察病菌的分生孢子和分生孢子器形態(tài)特征，并測(cè)量其大小。對(duì)理想的真菌切片進(jìn)行拍照并描述。根據(jù)試驗(yàn)菌株的培養(yǎng)學(xué)性狀和形態(tài)學(xué)特征，采用葡萄牙微生物里斯本大學(xué)微生物資源中心（Centro de Recursos Microbiológicos, CREM）的葡萄座腔菌分類檢索表（http://www.crem.fct.unl.pt/botryosphaeria_site/key.htm）及相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)參試菌株進(jìn)行初步鑒定[4]。

1.3 真菌的分子生物學(xué)鑒定

1.3.1 病原菌DNA 的提取

試驗(yàn)菌株在PD液體培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL）中靜置培養(yǎng)7 d，挑出菌絲并用濾紙吸干水分，直接提取DNA 或者-20 ℃ 保存?zhèn)溆?。DNA 提取在冰上進(jìn)行，用冷凍研磨棒充分研磨病原菌物菌絲直至糊狀，DNA 提取采用北京博邁德科技發(fā)展有限公司的CTAB 植物基因組DNA 提取試劑盒。分光光度計(jì)測(cè)定DNA 純度和濃度，4 ℃條件下保存。

1.3.2 病原菌rDNA-ITS 片段擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育分析

利用引物對(duì)ITS1（5’TCCGTAGGTGAACCTG CGG3’）/LR5（5’TCCTGAGGGAAACTTCG 3’）， 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR 反應(yīng)）擴(kuò)增供試菌株rDNA-ITS序列片段。PCR 反應(yīng)采用40 μL 擴(kuò)增反應(yīng)體系。每個(gè)反應(yīng)體系DNA 模板加入量為 2 μL，上下游引物（濃度為10 μmol/L）各2 μL，2×Taq PCR Master Mix 體系加入量為20 μL，最后用14 μL 滅菌的去離子水補(bǔ)足40 μL。PCR 擴(kuò)增共40 個(gè)循環(huán)，退火溫度58 ℃，退火時(shí)間30 s，擴(kuò)增循環(huán)完成后72 ℃延伸7 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序分析委托北京博邁德科技發(fā)展有限公司，測(cè)序引物為ITS1引物。

在NCBI 中使用Blast 在線比對(duì)序列，從GenBank 中提取37 個(gè)參比菌株rDNA-ITS序列。使用MEGA 5.05 軟件中的Muscle，對(duì)試驗(yàn)菌株的rDNA-ITS序列和參比菌株rDNA-ITS序列進(jìn)行同源比對(duì)分析；分別采用P-距離、Kimura-2 距離，以鄰位連接方法（Neighbour-joining method，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的培養(yǎng)學(xué)、形態(tài)學(xué)特征及鑒定

本研究從河北省石家莊、保定、滄州、邢臺(tái)、邯鄲、衡水、承德、張家口等8 個(gè)市（區(qū)、縣）25 個(gè)不同地點(diǎn)進(jìn)行樹木潰瘍病害標(biāo)本的采集，共分離獲得河北省樹木潰瘍病病原菌物73 株，菌株鑒定結(jié)果、寄主植物、采集地點(diǎn)等信息見表1。潰瘍病害的寄主植物包括楊樹、柳樹、蘋果、核桃、大葉黃楊、構(gòu)樹、火炬樹、連翹、花椒、刺梅等28 種樹木。

表1 本研究試驗(yàn)菌株的寄主植物，采集地點(diǎn)，采集地Table 1 The host plants, collecting locality of fungal isolates used in this study

續(xù)表1Continuation of table 1

研究發(fā)現(xiàn)，所有試驗(yàn)菌株均能培養(yǎng)成單菌落，并且在載有西黃松針的水瓊脂培養(yǎng)基上均可誘導(dǎo)形成理想的子實(shí)體。通過觀察記錄子實(shí)體形態(tài)特征和菌物菌落的培養(yǎng)學(xué)特征，將73 株試驗(yàn)菌株鑒定為5 種葡萄座腔菌科菌物：Botryosphaeria dothidea（共56 株）、B.obtusa（4 株）、B.stevensii（1 株）、B.sarmentorum（10 株）和Guignardia citricarpa（2 株）。5 種菌物的典型形態(tài)學(xué)及培養(yǎng)學(xué)特征分別描述如下：

Botryosphaeria dothidea的培養(yǎng)學(xué)特征（菌株CZ1066B）：在PDA 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)4 d 后，菌物菌絲布滿整個(gè)培養(yǎng)皿，比一般菌物生長(zhǎng)快；菌絲最初為透明狀，后逐漸變?yōu)榘咨?、灰白色、至灰綠色，菌絲由疏松到致密，呈絨毛狀。B.dothidea的形態(tài)學(xué)特征：分生孢子器為球形或器型、單腔室，表生，離散或聚生，分生孢子器直徑0.31 ～0.46 mm。分生孢子器外壁由厚壁角質(zhì)化組織構(gòu)成，致密；分生孢子器中無分生孢子梗，有產(chǎn)分生孢子細(xì)胞，其從分生孢子器內(nèi)壁層細(xì)胞上生出，全壁芽生，產(chǎn)分生孢子細(xì)胞無色，棒狀；分生孢子為梭形，先端漸尖，基部截距狀，薄壁，無色，無隔膜；分生孢子大小范圍為（11.31 ～28.16）μm×（3.72 ～ 5.57）μm，50 個(gè)分生孢子的長(zhǎng)、寬平均值及標(biāo)準(zhǔn)差 為（20.18±3.77）μm×（4.60±0.43）μm； 分生孢子長(zhǎng)寬比（L/W）為2.78 ～6.58，50 個(gè)分生孢子的L/W 比的平均值及標(biāo)準(zhǔn)差為4.40±0.79（圖1）。根據(jù)以上培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征，初步判定菌株CZ1066B 為菌種B.dothidea。

圖1 試驗(yàn)菌株CZ1066B 的培養(yǎng)學(xué)及形態(tài)學(xué)特征Fig.1 Cultural and morphological features of the isolate CZ1066B

B.sarmentorum的 培 養(yǎng) 學(xué) 特 征（ 菌 株CZ1038）：菌株生長(zhǎng)較慢，在PDA 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)4 d 后菌絲仍未長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿（直徑9 cm），菌落綠色，出現(xiàn)環(huán)狀，致密，基本無氣生菌絲體。B.sarmentorum的形態(tài)學(xué)特征：分生孢子器為球形或器型，單腔室至多腔室，單生、聚生或散生，灰黑色，直徑范圍為0.40 ～0.54 mm；分生孢子器棕黑色，由厚而致密的角質(zhì)化組織構(gòu)成；分生孢子圓柱形或卵圓形，頂部鈍圓、基部截距狀，淺棕色，半透明、光滑、無紋飾，具1 個(gè)膈膜；分生孢子大小范圍為（13.19 ～19.34）μm×（5.76 ～9.66）μm， 50 個(gè)分生孢子的長(zhǎng)、寬平均值及標(biāo)準(zhǔn)差為（16.61±1.58）μm×（7.88±0.84）μm；分生孢子長(zhǎng)寬比（L/W）為1.68 ～2.85，50 個(gè)分生孢子的L/W 比平均值及標(biāo)準(zhǔn)差為2.12±0.25（圖2）。根據(jù)以上培養(yǎng)學(xué)特征和形態(tài)學(xué)特征，初步判定菌株CZ1038 為菌種B.sarmentorum。

圖2 試驗(yàn)菌株CZ1038 的培養(yǎng)學(xué)及形態(tài)學(xué)特征Fig.2 Cultural and morphological features of the isolate CZ1038

B.stevensii的培養(yǎng)學(xué)特征（菌株CZ1080）：在PDA 培養(yǎng)基上6 d 菌絲未布滿培養(yǎng)皿，比一般菌株生長(zhǎng)較慢；培養(yǎng)初期為透明狀菌落，后漸變?yōu)榫G色及墨綠色，具疏松絨毛狀菌絲。B.stevensii的形態(tài)學(xué)特征：分生孢子體器型至球形，單腔室，單生、聚生或散生，直徑范圍為0.34 ～0.52 mm； 分生孢子體壁厚，由致密的角質(zhì)化細(xì)胞組成；分生孢子為卵形或圓柱形，頂端鈍圓，深棕色，具1 個(gè)膈膜，光滑、無紋飾；分生孢子大小范圍為（15.56 ～25.85）μm×（6.49 ～12.54）μm， 50 個(gè)分生孢子的長(zhǎng)、寬平均值及標(biāo)準(zhǔn)差為（20.34±2.23）μm×（9.56±1.19）μm；分生孢子長(zhǎng)寬比（L/W）為1.38 ～2.99，分生孢子的長(zhǎng)寬比（L/W）平均值及標(biāo)準(zhǔn)差為2.15±0.31（圖3）。由菌株的培養(yǎng)學(xué)特征和形態(tài)學(xué)特征可知，菌株CZ1080 為B.stevensii。

B.obtusa的培養(yǎng)學(xué)特征（菌株CZ1040）：真菌在PDA 平皿上培養(yǎng)4 d 其菌絲就布滿整個(gè)培養(yǎng)皿，與一般菌株相比生長(zhǎng)較快；菌絲連續(xù)3 天透明，后變?yōu)榛疑杷?。B.obtusa的形態(tài)學(xué)特征：分生孢子體球形、器型或燒瓶狀，單腔室至多腔室，單生、聚生或散生，直徑范圍為0.16 ～0.51 mm； 分生孢子體壁由致密的厚壁角質(zhì)化組織構(gòu)成；分生孢子圓柱形至卵形，端部圓，棕色，無膈膜，光滑，無紋飾；分生孢子大小范圍為（14.07 ～ 23.15）μm×（6.95 ～10.15）μm，50 個(gè)分生孢子的長(zhǎng)、寬平均值及標(biāo)準(zhǔn)差為（19.40±2.34）μm×（8.68±0.80）μm；分生孢子長(zhǎng)寬比（L/W）為1.46 ～2.99，分生孢子的長(zhǎng)寬比（L/W）平均值及標(biāo)準(zhǔn)差為2.25±0.33（圖4）。根據(jù)以上培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征，菌株CZ1040 被初步判定為B.obtusa。

Phyllosticta citrichinaensis的培養(yǎng)學(xué)特征（菌株CZ984A）：在PDA 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)6 d 菌絲還未鋪滿培養(yǎng)皿，比一般菌株生長(zhǎng)較慢；菌絲由透明變?yōu)榛揖G色，致密，呈粉末狀。P.citrichinaensis的形態(tài)學(xué)特征：子囊呈棍棒狀，包含8 個(gè)子囊孢子（子囊孢子不規(guī)則地分成兩列）無色；子囊孢子卵圓形至橢圓形。子囊孢子大小范圍為（5.1 ～ 9.83）μm×（4.96 ～7.91）μm，50 個(gè) 子 囊 孢 子的長(zhǎng)、寬平均值及標(biāo)準(zhǔn)差為（8.01±1.02）μm×（6.18±0.66）μm；子囊孢子長(zhǎng)寬比（L/W）為0.68 ～1.88，50 個(gè)孢子L/W 比的平均值及標(biāo)準(zhǔn)差為1.31±0.25（圖5）。由菌株的培養(yǎng)學(xué)特征和形態(tài)學(xué)特征可知，菌株CZ984A 被初步判定為Guignardia citricarpa，是P.citrichinaensis的無性型。

2.2 rDNA-ITS 片段擴(kuò)增及序列測(cè)定

利用引物對(duì)ITS1/LR5 擴(kuò)增所有菌株的rDNAITS 序列片段，經(jīng)過電泳檢測(cè)，均能產(chǎn)生特異性良好的條帶，基本上能產(chǎn)生單一且亮的條帶，并且rDNA-ITS序列的測(cè)序結(jié)果理想。試驗(yàn)菌株的rDNA-ITS序列片段大小一般約為1 600 bp，然而菌株CZ984A、CZ1049B 的rDNA-ITS序列片段卻較長(zhǎng)，約為2 000 bp。部分試驗(yàn)菌株rDNA-ITS序列PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖6。

圖3 試驗(yàn)菌株CZ1080 的培養(yǎng)學(xué)及形態(tài)學(xué)特征Fig.3 Cultural and morphological features of the isolate CZ1080

圖4 試驗(yàn)菌株CZ1040 的培養(yǎng)學(xué)及形態(tài)學(xué)特征Fig.4 Cultural and morphological feature of the isolate CZ1040

圖5 試驗(yàn)菌株CZ984A 的培養(yǎng)學(xué)及形態(tài)學(xué)特征Fig.5 Cultural and morphological features of the isolate CZ984A

圖6 部分試驗(yàn)菌株的rDNA-ITS序列擴(kuò)增結(jié)果Fig.6 rDNA-ITS sequences amplication results of partial experimental isolates

2.3 rDNA-ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

以GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中的37 個(gè)葡萄座腔菌科真菌的rDNA-ITS序列作為參比序列，采用Kimura-2-parameter 遺傳距離，以rDNA-ITS序列構(gòu)建試驗(yàn)菌株的鄰位連接法（Neighbor-joining，NJ）系統(tǒng)進(jìn)化樹。為了更清晰地揭示Botryosphaeria dothidea主要分支的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，本研究選取河北省內(nèi)不同地區(qū)且不同寄主的11 個(gè)B.dothidea代表菌株對(duì)原始進(jìn)化樹進(jìn)行簡(jiǎn)化，結(jié)果見圖7。

系統(tǒng)發(fā)育分析顯示本研究的所有試驗(yàn)菌株均為葡萄座腔菌科菌物（圖7）。以Kimura-2 距離構(gòu)建的NJ 系統(tǒng)發(fā)育分析將共110 個(gè)試驗(yàn)及參比菌株聚類為5 個(gè)主要分支，分別對(duì)應(yīng)于Lasiodiplodia/Diplodia、Phyllosticta、Fusicoccum、Neofusicoccum和Dothiodia這5 種 不 同LSU 類 群 的 無 性 型。Lasiodiplodia/Diplodia分支含有試驗(yàn)菌株：CZ1040、CZ922A、CZ1074、CZ1075A 與CZ1080；參 比 菌株：B.stevensii、B.obtusa、B.rhodina及其無性型菌株。在此分枝內(nèi)形成一對(duì)姐妹群，即由參比菌株（B.obtusa、B.stevensii）與CZ1080、CZ922A、CZ1040、CZ1074、CZ1075A 構(gòu)成的單系類群和由B.rhodina及其無性型菌株組成的單系類群。在這對(duì)姐妹群中，CZ1080 與B.stevensii親緣關(guān)系較 近（BS=57），CZ922A、CZ1040、CZ1074、CZ1075A 與B.obtusa親緣關(guān)系相近（BS=72）。利用分子鑒定和形態(tài)鑒定研究方法，最終將試驗(yàn)菌株CZ1080 鑒定為B.stevensii，將CZ1040、CZ922A、CZ1074、CZ1075A 這4 個(gè) 試 驗(yàn) 菌 株 鑒 定 為B.obtusa。Phyllosticta分 支 由2 個(gè)P.citrichinaensis菌株和2 個(gè)試驗(yàn)菌株CZ984A、CZ1049B 構(gòu)成，且具有最高支持率（BS=100）。試驗(yàn)菌株CZ984A、CZ1049B 和參比菌株P(guān).citrichinaensis的親緣關(guān)系極其相近，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，最終將CZ984A、CZ1049B 鑒定為P.citrichinaensis。在Fusicoccum分支中，除了2 個(gè)B.dothidea外，其余都是CZ864、CZ876、CZ927A 等56 個(gè)試驗(yàn)菌株（BS=89），分子鑒定結(jié)合形態(tài)鑒定，將這56 個(gè)試驗(yàn)菌株最終鑒定為B.dothidea。在Neofusicoccum分支中只有參比菌株N.mediterraneum、N.australe、N.parvum、N.ribis和N.vitifusiforme，無試驗(yàn)菌株。在Dothiodia分支中，除了2 個(gè)B.iberica和2 個(gè)B.sarmentorum菌株外，其余都是CZ1038、CZ1043、CZ1048B、CZ1037、CZ959、CZ970、CZ888、CZ887-2、CZ877A 和CZ1082 等10 個(gè)試驗(yàn)菌株（BS=76），其中試驗(yàn)菌株聚成一小枝（BS=65）；利用分子鑒定和形態(tài)鑒定研究方法，最終將這些試驗(yàn)菌株鑒定為B.sarmentorum。

圖7 簡(jiǎn)化后的rDNA-ITS 部分基因序列的Kimura-2-parameter NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Kimura-2-parameter NJ curtness tree obtained from rDNA-ITS gene partial sequences data

以P 距離構(gòu)建的NJ 系統(tǒng)發(fā)育分析同樣將110 個(gè)試驗(yàn)菌株和參比菌株聚類為5 個(gè)主要的分支，分別對(duì)應(yīng)于Dothiodia、Neofusicoccum、Lasiodiplodia/Diplodia、Fusicoccum和Phyllosticta等5 個(gè)不同的無性型（圖8）。在Dothiodia分支中，除了2個(gè)B.sarmentorum和2 個(gè)B.iberica菌株外，其余都是本研究采集的10 個(gè)試驗(yàn)菌株（BS=86），而且這10 個(gè)試驗(yàn)菌株聚成一小枝（BS=64）；根據(jù)形態(tài)鑒定和分子鑒定方法，最終將這些試驗(yàn)菌株確定為B.sarmentorum。在Neofusicoccum分支中只包含參比菌株N.ribis、N.australe、N.vitifusiforme、N.parvum和N.mediterraneum各2 個(gè)rDNA-ITS序列，但不包括試驗(yàn)菌株序列（BS=72）。Lasiodiplodia/Diplodia分 支 包 括B.obtusa、B.stevensii、B.rhodina及其無性型菌株，試驗(yàn)菌株CZ1040、CZ922A、CZ1074、CZ1075A和CZ1080（BS=85）；在此分枝內(nèi)形成一對(duì)姐妹 群：試 驗(yàn) 菌 株CZ1040、CZ922A、CZ1074、CZ1075A、CZ1080 與B.obtusa、B.stevensii聚成的單系類群和B.rhodina及其無性型菌株聚成的單系類群。CZ1080 與B.stevensii親緣關(guān)系相近（BS=55），試驗(yàn)菌株CZ922A、CZ1040、CZ1074、CZ1075A 與B.obtusa菌株遺傳距離較近（BS=81）；結(jié)合培養(yǎng)學(xué)和形態(tài)學(xué)特征將試驗(yàn)菌株CZ1080 鑒定為B.stevensii菌種，將CZ1040、CZ922A、CZ1074、CZ1075A 這4 個(gè) 試 驗(yàn) 菌 株鑒定為B.obtusa菌株。在Fusicoccum分支中，除了2 個(gè)B.dothidea菌株外，其余都是試驗(yàn)菌株CZ864、CZ876、CZ927A 等56 個(gè)（BS=100），結(jié)合培養(yǎng)學(xué)和形態(tài)學(xué)特征將這些試驗(yàn)菌株最終鑒定為B.dothidea。Phyllosticta分支僅包括2個(gè)Phyllosticta citrichinaensis菌 物 和CZ984A、CZ1049B 等2 個(gè)試驗(yàn)菌株（BS=100），結(jié)合培養(yǎng)學(xué)和形態(tài)學(xué)特征將這2 個(gè)試驗(yàn)菌株最終鑒定為P.citrichinaensis。

3 結(jié)論與討論

有些國(guó)內(nèi)專家學(xué)者相繼統(tǒng)計(jì)或者研究報(bào)道葡萄座腔菌科菌物的寄主[1,22-26]，2015年姜曉龍等首次報(bào)道浸染蓖麻Ricinus communisL.的病原菌物為B.dothidea[27]，2018年朱琪麗等首次報(bào)道葡萄座腔菌侵染柑橘Citrus reticulataBlanco.果實(shí)[28]，2018年黃靜等發(fā)現(xiàn)落葉松葡萄座腔菌引起草莓Fragaria ananassaDuch.病害[29]。Chen 等在希臘和美國(guó)加利福尼亞的開心果Pistacia veraL.中發(fā)現(xiàn)2 種新的葡萄座腔菌科菌物Neofusicoccum hellenicum sp.nov.和Lasiodiplodia americana sp.nov.[30]。A?imovi? 等 利 用ITS 和EF-1α序 列 分析，鑒定加利福尼亞海岸紅杉Sequoia的病原菌物為B.dothidea[31]。本研究根據(jù)大量的相關(guān)資料，發(fā)現(xiàn)6 個(gè)種寄主植物，即大葉黃楊Buxus megistophylla、 構(gòu) 樹Broussonetia papyrifera、 火炬樹Rhus typhina、連翹Forsythia suspensa、花椒Zanthoxylum bungeanum和刺梅Euphorbia milii var.splendens為葡萄座腔菌科菌物的新寄主植物。

為了明確引發(fā)河北省樹木潰瘍病的葡萄座腔菌科菌物種類，本研究采用無性型形態(tài)學(xué)和rDNA-ITS序列對(duì)該類菌物進(jìn)行系統(tǒng)分類研究，鑒 定 出B.dothidea、B.obtusa、B.stevensii、B.sarmentorum和Phyllosticta citrichinaensis等5 種葡萄座腔菌科菌物。B.dothidea是一類常見樹木潰瘍病病原菌物，分布廣泛、寄主多樣，其無性型為七葉樹殼梭孢Fusicoccum aesculi[32]。本研究將73 個(gè)試驗(yàn)菌株鑒定為葡萄座腔菌科菌物，其中56 個(gè)為B.dothidea菌株，占試驗(yàn)菌株總數(shù)的77%；這些B.dothidea菌株分別侵染核桃、蘋果、桃樹、梨樹、黑楊、北京楊、柳樹、國(guó)槐、山楂、連翹等20 種植物（甚至包括了外來入侵樹種火炬樹），顯示出該種菌物的寄主廣泛性。CZ1038、CZ1043、CZ1048B、CZ1037、CZ959、CZ970、CZ888、CZ887-2、CZ877A 和CZ1082 等10 個(gè)試驗(yàn)菌株具有Dothiorella型分生孢子，被鑒定 為B.sarmentorum。2005年P(guān)hillips 等 曾 報(bào) 道B.sarmentorum和B.iberica這2 種病原的形態(tài)學(xué)特征[33]。在Neofusicoccum分支內(nèi)，B.parva真菌無性型Neofusicoccum parvum是引發(fā)全球多種植物病害的病原[34]。Neofusicoccum ribis是B.ribis真菌無性型名稱[35]，B.ribis與B.parva向來很難區(qū)分，2009年P(guān)avlic 等采用多基因序列分析，明確B.parva和B.ribis是2 個(gè)不同的生物學(xué)種[36]。在Lasiodiplodia/Diplodia分支內(nèi)，試驗(yàn)菌株CZ922A、CZ1040、CZ1074、CZ1075A 和CZ1080均具有Diplodia型分生孢子，最終判定CZ1080 為菌種B.stevensii，其他4 個(gè)試驗(yàn)菌株為B.obtusa。B.stevensii、B.obtusa的無性型分別是Diplodia mutila、D.seriata。D.mutila引發(fā)楊樹潰瘍病害已經(jīng)有很多報(bào)道，D.seriara則在2011年被首次報(bào)道為我國(guó)楊樹潰瘍病的病原[23]。在Phyllosticta分支中，菌株CZ984A 和CZ1049B 作為Phyllosticta屬，明顯和Botryosphaeria屬分為2 大分支。Phyllosticta屬和葡萄座腔菌屬的不同之處：一是試驗(yàn)菌株CZ984A 和CZ1049B 的DNA 片段比其他試驗(yàn)菌株的DNA 片段較長(zhǎng)；二是通過rDNAITS 序 列 同 源 比 對(duì)，CZ984A 和CZ1049B 沒 有ITS4 序列，其ITS1 序列上游比其他菌株多出一段DNA 片段。

目前，在生物系統(tǒng)分類研究中，很多與生物體基本功能相關(guān)且具有結(jié)構(gòu)保守性的基因或者序列被廣泛用于揭示生物之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，如在植物學(xué)中的葉綠體ndhF 和rbcL[37]。β-tubulin 基因和EF-1α基因[18-19,21,30]等廣泛應(yīng)用于菌物的系統(tǒng)發(fā)育研究，但是ITS-rDNA 序列仍然是植物和菌物系統(tǒng)分類中應(yīng)用最廣泛的基因片段[10,12,16,18-19,30,38-40]。李文英等指出，以物種全型的培養(yǎng)特性、形態(tài)特征及多基因序列佐證等作為重要分類依據(jù)，是葡萄座腔菌科菌物類群分類學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育研究的必然趨勢(shì)[41]。本研究采用ITS-rDNA 序列，同時(shí)用Blast 方法搜集全部NCBI 中的相關(guān)菌株的基因序列，應(yīng)用聚類分析方法對(duì)真菌進(jìn)行分類；在此基礎(chǔ)上，結(jié)合真菌培養(yǎng)學(xué)性狀和形態(tài)學(xué)特征對(duì)河北省枝干潰瘍病菌進(jìn)行分類鑒定，結(jié)果具有較高的可靠性。

圖8 簡(jiǎn)化后的rDNA-ITS 部分基因序列的P-距離NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.8 P-distance NJ curtness tree obtained from rDNA-ITS gene partial sequences data

本研究首次對(duì)河北省樹木潰瘍類病害病原菌物分布及系統(tǒng)分類的分析，初步明確了該地區(qū)潰瘍類病害的寄主植物范圍并發(fā)現(xiàn)6 種新的寄主植物，為河北省樹木潰瘍病的防治和樹木潰瘍病菌物的系統(tǒng)分類研究提供理論依據(jù)。研究結(jié)果顯示，葡萄座腔菌B.dothidea仍然是危害河北省樹木健康生長(zhǎng)的最為重要、分布最為廣泛的枝干病原菌物，不僅危害楊樹、核桃、蘋果等傳統(tǒng)寄主，而且危害到花椒等新寄主植物，甚至是入侵樹種火炬樹。因此，有必要對(duì)B.dothidea潰瘍致病性分化和種群遺傳分化進(jìn)行深入分析，從而提出河北省以及鄰近地區(qū)樹木潰瘍類病害的防治策略。本研究的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，CZ1038、CZ1043 等10 個(gè)菌株以較高支持率（p 距離進(jìn)化樹：BS=64；Kimura-2 距離進(jìn)化樹：BS=65）單獨(dú)聚為一個(gè)分枝，然后與B.sarmentorum和B.iberica菌株聚類形成LSUDothiodia聚類群（圖7 和圖8），該類群的菌株具有Dothiorella型分生孢子。由于沒有觀察到與B.sarmentorum可區(qū)分的形態(tài)學(xué)特征，這些菌株被初步確定為B.sarmentorum，然而ITSrDNA 聚類分析結(jié)果提示我們這些菌株可能構(gòu)成一個(gè)新種。因此，未來需要在形態(tài)學(xué)特征觀察的基礎(chǔ)上，采用多基因分類的方法以最終確定這些菌株的系統(tǒng)分類地位。