樟子松木材組織染色研究

彭俊懿，林 巧，石江濤

（南京林業(yè)大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 210037）

在木材解剖的研究中，不同細(xì)胞或組織水平上，高質(zhì)量的顯微切片是必要的基礎(chǔ)工作。現(xiàn)階段的顯微切片制作中，無論是用于觀察的石蠟切片[1]、滑走切片[2]，還是半薄切片，染色都是關(guān)鍵步驟。幾十年來，對于木材顯微切片染色方法的研究已有較多報道。隨著染色劑的多樣化，多個染色劑對顯微切片進(jìn)行復(fù)染的染色方法也越來越受關(guān)注。番紅-固綠雙染法是植物制片中最普通的二重染色法，染色手續(xù)簡單并能清晰的顯示出細(xì)胞的結(jié)構(gòu)[3]。國內(nèi)早在1960年江西師范學(xué)院的生物制片手冊就已記錄了番紅-固綠雙重染色法；1979年容壽柏嘗試在其基礎(chǔ)上嘗試兩色一步整染改進(jìn)[4]；而后很多學(xué)者對番紅-固綠雙染進(jìn)行了減少耗時和提高染色效果的改進(jìn)[5-6]。至今番紅-固綠經(jīng)典雙染法已廣泛運用于各類研究中。番紅-固綠雙染法多用于細(xì)胞化學(xué)成分區(qū)別較大的細(xì)胞切片，如制作樹皮、樹葉等植物組織的顯微切片使用番紅-固綠雙染法鏡檢出石質(zhì)化和栓質(zhì)化的細(xì)胞呈紅色[7-8]，制作應(yīng)拉木鵝掌楸顯微切片時使用番紅-固綠雙染法鏡檢出呈綠色的區(qū)域中膠質(zhì)木纖維含量高[9]。而細(xì)胞化學(xué)成分差異較小的細(xì)胞切片，番紅-固綠經(jīng)典雙染法會出現(xiàn)不適用的情況。

阿利新藍(lán)[10]為羧基基團(tuán)染色劑。在木材木質(zhì)部中，羧基大多位于纖維素和半纖維素中，一般認(rèn)為木質(zhì)素中不存在羧基[11]。推測新藍(lán)的染色目標(biāo)應(yīng)該與固綠是一致的。新藍(lán)的染色研究在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域開展較多[12]，在木材研究和植物研究領(lǐng)域僅有很少的報道[13]。新藍(lán)與其他染料復(fù)染的相關(guān)研究國內(nèi)幾乎沒有開展。為拓展木材顯微切片的雙染染色方法，以及進(jìn)一步提高顯微切片的清晰度和分辨率，從細(xì)胞染色角度入手建立一種更有效的顯微制片方法。其中番紅O 幾乎可以與任何染料配合在一起，用作雙重、三重或四重染色[3]。選取樟子松木質(zhì)部為實驗材料，采用了番紅、固綠和阿利新藍(lán)三種染料，對樟子松木材切片進(jìn)行了單染和復(fù)染。就番紅-新藍(lán)雙染法進(jìn)行了改良，通過鏡檢和拍照比較染色效果，找到了效果滿意的染色工藝流程，希望能得到廣泛的實驗和應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

樟子松木材采自黑龍江省雞東縣大頂山。樹齡約22 a，在胸高處取10 cm 厚圓盤，帶回實驗室氣干備用。番紅O（Safranine O）（上海金穗公司）分子式為C20H19ClN4，相對分子質(zhì)量：350.85；固綠（Fast green FCF）（MACKLIN 公司）分子式為C37H34N2O10S3Na2，相對分子質(zhì)量：808.85；阿拉丁的阿利新藍(lán)（Alcian blue 8GX）（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）分子式為C56H68N16S4Cl14Cu，相對分子質(zhì)量：1 295.86，以下簡稱新藍(lán)。

1.2 顯微切片制作

取樟子松中心條，以髓心開始的3 ～9年輪之間的木質(zhì)部作為染色試樣。使用純凈水進(jìn)行90 ℃水浴軟化2 h，使用日本電動式組織切片機(jī)REM-710 進(jìn)行厚度15 ～20 um 組織切片，分別切取橫切面、徑切面和弦切面；應(yīng)力釋放6 h 后備用。染色劑為1%番紅水溶液；0.5%固綠的95%乙醇溶液，1%新藍(lán)的70%乙醇溶液。染色脫水后封片；染色流程對不同的樹種和不同的部位存在一定差異[14]，本研究所用染色流程見表1。常用封片方式有臨時封片和永久性封片，臨時封片是在脫水處理以后不進(jìn)行透明處理而直接用甘油進(jìn)行封片，臨時封片操作少、出片速度快，本文選用臨時封片。新藍(lán)和固綠單染時脫水至染色劑對應(yīng)的酒精濃度后染色即可，其他流程與番紅單染流程基本一致。使用日本OLYMPUS BX51 光學(xué)顯微鏡觀察切片并拍照，而后使用Oplenic 軟件進(jìn)行測量和記錄。

改進(jìn)后的番紅-新藍(lán)雙染具體流程如下：1%番紅染色60 min；30%～70%乙醇梯度脫水，各 2 min； 酸 洗1 min；1% 新 藍(lán) 染 色2 min；70%乙醇洗凈浮色后使用甘油封片。其中酸洗液為13%～17%冰乙酸的70%乙醇溶液。

1.3 管胞解離

選取第3 ～9年輪，將樣品以早晚材分開，切成細(xì)條后使用富蘭克林離析法解離樟子松管胞。將樣品置于試管內(nèi)，加入去離子水后放入70℃水浴鍋至樣品全沉水；而后換入由30%過氧化氫溶液與冰乙酸1∶1 混合制得的解離液中，放入沸水浴中蒸煮至試樣膨化和完全變白；將樣品取出，用去離子水進(jìn)行沖洗5 ～6 次，分別滴入番紅、固綠和新藍(lán)進(jìn)行染色；觀察時只需將其滴在載玻片上并蓋上蓋玻片即可，使用日本OLYMPUS BX51 光學(xué)顯微鏡觀察。

表1 脫水和染色流程Table 1 Dehydration and dyeing treatment

2 結(jié)果與分析

2.1 單染

對樟子松橫切面顯微切片進(jìn)行番紅、固綠和新藍(lán)單染效果如圖1 所示。圖1-a 是使用番紅染色，其中早晚材管胞均被染成紅色，射線位置也被染上紅色；圖1-b 圖是使用固綠染色，早晚材管胞被染成藍(lán)綠色，射線上染顏色較淡，能觀察到有沉積的色塊；圖1-c 圖是使用新藍(lán)染色，對軸向管胞上染程度極低，射線位置能觀察到染上了明顯藍(lán)色。有學(xué)者研究認(rèn)為新藍(lán)對針葉材的管胞幾乎不染色，對泌脂細(xì)胞和薄壁細(xì)胞染色效果較好[13]，據(jù)此推測：圖1-c 圖中射線位置被新藍(lán)染成明顯藍(lán)色的細(xì)胞是射線薄壁細(xì)胞。僅以細(xì)胞壁的染色情況排序：番紅染色效果優(yōu)于固綠，新藍(lán)染色效果最差。

圖1 三種染料單染效果Fig.1 Staining effect of three dyes

2.2 復(fù)染

為比較對木材顯微切片的番紅-固綠復(fù)染和番紅-新藍(lán)復(fù)染效果。對樟子松三切面進(jìn)行番紅-固綠雙染后效果見圖2 中a、b 和c，三圖中僅呈現(xiàn)紅色，未見細(xì)胞被染為明顯綠色。圖2-a 中在輪界線上能夠觀察到極其輕微的綠色；在圖2-b 圖中能看到很多固綠沉積的綠色色塊；圖2-c 中觀察不到有綠色。番紅-新藍(lán)雙染效果見圖2 中d、e 和f。與番紅-固綠雙染不同，番紅-新藍(lán)雙染后能觀察到部分細(xì)胞被染成藍(lán)綠色。圖2-d 中橫切面上射線薄壁細(xì)胞被染為藍(lán)綠色，樹脂道內(nèi)也能觀察到被染成藍(lán)綠色的薄壁細(xì)胞和內(nèi)含物；圖2-e 中單列木射線內(nèi)的射線薄壁細(xì)胞被染為藍(lán)綠色，紡錘形木射線中多見綠色的薄壁細(xì)胞包裹絮狀團(tuán)的結(jié)構(gòu)；圖2-f 中也能觀察到射線薄壁細(xì)胞染成了綠色，但是綠色分布不均，染色程度較低。

樟子松管胞和薄壁細(xì)胞的化學(xué)成分存在差異。管胞木質(zhì)化程度高于薄壁細(xì)胞，管胞細(xì)胞壁含大量木質(zhì)素和結(jié)晶度較高的纖維素，薄壁細(xì)胞細(xì)胞壁內(nèi)纖維素和半纖維素含量高于木質(zhì)素。固綠在水溶液中溶解度為4%，在酒精內(nèi)溶解度能達(dá)到9%[14]。在其他學(xué)者的研究中番紅-固綠雙染時，固綠上色較快，15 s 就能對細(xì)胞進(jìn)行染色[15-17]。本次實驗中使用的是1%固綠溶液（95%乙醇溶劑）染色時間2 min，依然沒有染上綠色。因此番紅-固綠雙染不適用于樟子松木質(zhì)部顯微切片，固綠都沉積成了色塊，沒有對細(xì)胞進(jìn)行染色。新藍(lán)多用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)游锛?xì)胞染色，屬于陽離子染料，能與組織內(nèi)含有的陰離子基團(tuán)，如羧基和硫酸根等形成不溶性復(fù)合物[18-19]。本次番紅-新藍(lán)雙染實驗中，樟子松管胞被染成紅色，薄壁細(xì)胞（射線薄壁細(xì)胞和泌脂細(xì)胞均為薄壁細(xì)胞）被染成藍(lán)綠色。說明了番紅-新藍(lán)雙染適用于樟子松木質(zhì)部顯微切片的染色。

圖2 復(fù)染與改進(jìn)后效果Fig.2 The staining and improved results

醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)有文獻(xiàn)報道稱，新藍(lán)在酸性環(huán)境下對羧基著色效果更為活躍[18-19]。對番紅-新藍(lán)雙染工藝進(jìn)行改進(jìn)，在新藍(lán)著色過程中為其提供一個酸性反應(yīng)環(huán)境。染色改進(jìn)后，木材細(xì)胞染色清晰、染色程度較高、易于辨識，見圖2 g ～ l。能夠看到經(jīng)過改進(jìn)后的番紅-新藍(lán)雙染法區(qū)分細(xì)胞組織的能力非常優(yōu)秀，把樟子松軸向管胞染成紅色，把樟子松射線薄壁細(xì)胞和樹脂道泌脂細(xì)胞染成藍(lán)色，紅色和藍(lán)色兩個顏色之間沒有出現(xiàn)相互混合的現(xiàn)象。特別是在圖2-l 中，番紅-新藍(lán)雙染對薄壁細(xì)胞的染色效果明顯比圖2-f 未改進(jìn)前的染色效果要好，能看到不僅厚壁管胞被均勻的染成紅色，射線薄壁細(xì)胞也被均勻的染成亮藍(lán)色，從染色效果上能看出酸性反應(yīng)環(huán)境提高了新藍(lán)對薄壁細(xì)胞的染色活力。能夠清楚的觀察到射線薄壁細(xì)胞和射線管胞的形態(tài)。清楚地觀察到射線管胞內(nèi)壁有鋸齒狀加厚，鋸齒狀加厚存在于硬松類，如馬尾松、油松和黑松等。而在紅松、華山松和白皮松等軟松類中射線管胞內(nèi)壁平滑。鋸齒狀加厚對木材識別與鑒定具有重要意義[11]。

酸洗過程會破壞番紅的著色，冰乙酸含量過高會導(dǎo)致切片上番紅嚴(yán)重褪色；酸洗不足則難以提高新藍(lán)活性，導(dǎo)致切片染色不均勻或不上色。研究以后酸洗液配比為13%～17%冰乙酸的70%乙醇溶液是效果較好的。研究動物骨骼和粘液細(xì)胞染色的學(xué)者們發(fā)現(xiàn)：亮藍(lán)色是新藍(lán)染色效果較好和染色活力較高的宏觀表現(xiàn)[19-20]。

2.3 解離后管胞和樹脂道的染色

在針葉材管胞形態(tài)的研究中，管胞解離是比較常用的方法。在管胞解離以后需要對管胞進(jìn)行染色處理，高質(zhì)量的染色能有效地幫助觀察者判別管胞是否完整。前文已得知三種染料對管胞單染的效果是：番紅染色效果優(yōu)于固綠，新藍(lán)染色效果最差。但是分別將番紅、固綠和新藍(lán)用于已解離的管胞染色后，出現(xiàn)了一個有趣的現(xiàn)象：新藍(lán)對管胞的染色效果最好、程度最高，如圖3 所示。圖3-a 顯示管胞被番紅染成紅色，圖3-b 反映固綠染色效果較差，圖3-c 中管胞被新藍(lán)染成了藍(lán)色。新藍(lán)對管胞上色效果較好的原因可能是解離體系中含有冰醋酸滲入管胞腔，在沖洗時沒有完全去除，而冰醋酸的存在恰恰改變了染色體系的pH 值，提高了新藍(lán)對管胞的上染。靜置1 天后使用pH 試紙測得，管胞內(nèi)殘留的乙酸使得溶液變成了酸性。新藍(lán)管胞溶液依舊無色透明，能用肉眼觀察到新藍(lán)全染到了懸浮的管胞上。證明冰乙酸中的-COOH 沒有參與反應(yīng)，新藍(lán)是對管胞上的-COOH 染色。番紅染色效果比新藍(lán)略差，固綠染色程度遠(yuǎn)低于前二者。

圖3 解離后管胞的染色，F(xiàn)ig.3 The processed tracheid

分別將番紅、固綠和新藍(lán)用于樟子松含樹脂道的顯微切片染色，得到的效果如圖4 所示。能觀察到圖4-a 和圖4-b 中番紅和固綠分別把切片內(nèi)所有細(xì)胞和內(nèi)含物都染上了顏色。番紅、固綠和新藍(lán)都能對樹脂道的內(nèi)含物染色，再加上新藍(lán)對軸向管胞上染程度極低的反差，在以樹脂道為研究對象的顯微切片制作中新藍(lán)單染是最好的選擇。

3 結(jié)論與討論

對樟子松橫切面顯微切片進(jìn)行番紅、固綠和新藍(lán)單染后鏡檢得，番紅對木質(zhì)化程度高的厚壁管胞染色效果最好；新藍(lán)對木質(zhì)化程度低的薄壁細(xì)胞染色效果最好；固綠染色效果居于兩者之間。對比樟子松橫切面顯微切片復(fù)染效果得，該流程操作下番紅-固綠雙染不適用于樟子松木質(zhì)部顯微切片的制作，固綠都沉積成了色塊，沒有對細(xì)胞進(jìn)行染色。番紅-新藍(lán)雙染能區(qū)分樟子松細(xì)胞組織，樟子松管胞被染成紅色，薄壁細(xì)胞（射線薄壁細(xì)胞和泌脂細(xì)胞均為薄壁細(xì)胞）被染成藍(lán)綠色。薄壁細(xì)胞的染色不夠理想，改進(jìn)后的番紅-新藍(lán)雙染效果較好，能清楚地區(qū)分木材細(xì)胞組織，薄壁細(xì)胞染色更加充分、均勻。

圖4 樹脂道的染色Fig.4 Staining of resin canal

已有較多對木材組織染色的同類研究，如能染細(xì)胞內(nèi)脂類物質(zhì)的蘇丹黑[21]；能染高度木質(zhì)化、栓質(zhì)化細(xì)胞的番紅[22]和甲苯胺藍(lán)[23]；能染糖類的高碘酸-Schif[24]等。該方法優(yōu)點在于能夠簡單快速的區(qū)別木材中薄壁細(xì)胞和厚壁細(xì)胞。傳統(tǒng)的番紅-固綠雙染能夠通過調(diào)控時間來達(dá)到對不同石質(zhì)化細(xì)胞的區(qū)分，調(diào)控時間來達(dá)到區(qū)分不同木材的薄壁細(xì)胞將是該方法進(jìn)一步的研究方向。往后計劃將對多種木材進(jìn)行試驗，驗證該方法的可靠性和普試性，解決本次試驗樣本單一的問題。在對一些特殊木材的試驗中，如應(yīng)力木，應(yīng)該結(jié)合現(xiàn)代儀器分析技術(shù)，完善該方法，達(dá)到定性、半定量甚至定量的目的。對解離后的管胞染色觀察發(fā)現(xiàn)，新藍(lán)單染效果略高于番紅，二者都能夠得到很好的觀察效果，但從經(jīng)濟(jì)方面考慮，番紅依舊是解離后對細(xì)胞進(jìn)行染色的首選。在以樹脂道為研究對象的顯微切片制作中新藍(lán)單染是最佳選擇。綜上所述，木材細(xì)胞對不同染料響應(yīng)各異，同時也受到染色介質(zhì)的影響。