近紅外光譜分析技術在監(jiān)測L-異亮氨酸發(fā)酵過程中的應用

王 森, 王雪松, 張 昕, 石國新, 王 健

(1.吉林大學 生物與農業(yè)工程學院, 長春 130022; 2.吉林大學 生命科學學院, 長春 130012)

氨基酸發(fā)酵液的成分復雜, 通常是氣體、 液體、 固體三態(tài)共存.傳統(tǒng)分析方法需使用昂貴的化學試劑, 且分析過程復雜[1-2].近紅外光譜分析技術以化學計量學、 基礎測量及光譜衡量為基礎, 多種技術相互耦合.與傳統(tǒng)分析方法相比, 近紅外光譜分析僅需對被測樣品進行一次光譜采集, 即可在較短時間內完成多項性能指標檢測, 具有分析重現(xiàn)性好、 無污染、 成本低等優(yōu)點.因此, 近紅外光譜分析技術在生命科學、 石油化工、 農業(yè)、 醫(yī)藥和輕工食品等領域應用廣泛[3-6].

用近紅外光譜分析技術測定氨基酸發(fā)酵過程中的參數(shù), 主要是采集透射光譜信息, 建立發(fā)酵液中單一主產物濃度或葡萄糖含量光譜預測模型.對含量較少的副產物建立預測模型與多種產物同時檢測的研究目前文獻報道較少[7-9]: 郭宇飛等[10]利用近紅外光譜分析技術, 采集透射光譜信息, 建立了谷氨酸棒桿菌發(fā)酵過程中異亮氨酸質量濃度的單一光譜預測模型; Liang等[11]利用近紅外光譜分析技術建立了谷氨酸發(fā)酵過程中各成分的光譜模型, 達到了快速、 準確檢測的目的, 由于樣品為離心后發(fā)酵液, 因此未充分發(fā)揮近紅外光譜分析技術的優(yōu)勢.本文以L-異亮氨酸發(fā)酵過程的發(fā)酵液為樣品, 用偏最小二乘法研究不同光譜預處理和波段選擇對液體透射采集和懸濁液反射采集下發(fā)酵液中各成分建模精度的影響, 分別建立L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-蘇氨酸、L-谷氨酸和L-丙氨酸的兩種不同采集方式光譜預測模型, 并通過比較得到最佳模型建立方法.

1 材料和方法

1.1 材料及樣品

黃色短桿菌BrevibacteriumflavumKM011(Met-+LysL+ Ethr+α-ABr+AECr)由吉林大學氨基酸代謝工程實驗室保藏.其培養(yǎng)基及發(fā)酵條件參見文獻[12].

在L-異亮氨酸補料分批發(fā)酵過程中, 每小時取樣一次, 共收集105個樣品.

1.2 氨基酸的測定

發(fā)酵液中氨基酸的質量濃度用2,4-二硝基氟苯柱前衍生高效液相法測定, 參見文獻[12].

1.3 光譜信息采集

透射光譜掃描：在1 mm的比色杯中加入0.5 mL發(fā)酵液樣品, 用Thermo AntarisⅡ型近紅外掃描儀(美國賽默飛世爾公司)掃描, 分辨率為16 cm-1, 掃描次數(shù)為32, 在4 000～10 000 cm-1處掃描樣品，以去離子水為掃描背景, 采集原始近紅外光譜數(shù)據(jù).

反射光譜掃描：將5 mL發(fā)酵液樣品置于0號密封袋中, 溫度為20 ℃, 分辨率為8.0 cm-1, 掃描32次, 在4 000～10 000 cm-1處掃描樣品, 以儀器內置背景為參比, 采集原始近紅外光譜.用近紅外分析軟件TQ Analyst 9(美國賽默飛世爾公司)分析原始光譜.

1.4 近紅外光譜預處理

用近紅外分析軟件TQ Analyst 9內置的多種光譜預處理算法對原始光譜(Raw)預處理優(yōu)化, 包括多元散射校正(multiplicative scatter correction, MSC)、 標準正態(tài)變量變換(vector normalization, SNV)、 一階導數(shù)+Norris導數(shù)平滑處理(first derivative+Norris, FD+N)、 一階導數(shù)+S-G平滑處理(first derivative+S-G, FD+SG)、 二階導數(shù)+Norris導數(shù)平滑處理(second derivative+Norris, SD+N)和二階導數(shù)+S-G平滑處理(second derivative+S-G, SD+SG)等, 平滑點數(shù)設為15.

2 結果與分析

2.1 樣品原始光譜

圖1為樣品的原始透射掃描光譜.由圖1可見, 發(fā)酵液透射光譜的波峰波谷重疊嚴重, 在4 000～5 400 cm-1處, 由于水中O—H鍵吸收干擾, 導致吸收飽和, 因此噪聲較強, 在6 500～7 300 cm-1處, 發(fā)酵液中存在大量微小顆粒物和菌體, 使吸收光譜紊亂.樣品的原始反射光譜如圖2所示.由圖2可見, 其波峰波谷清晰, 有利于提取光譜信息, 通過光譜預處理, 使利用近紅外光譜分析技術同時檢測發(fā)酵過程多種物質含量成為可能.

圖1 樣品的原始透射掃描光譜

圖2 樣品的原始反射光譜

2.2 波長范圍選取

不同分子基團對不同波長光譜的吸收差異較大, 利用黃色短桿菌生產L-異亮氨酸過程中, 主副產物中存在大量N—H,O—H和C—H等基團, 由于不同氨基酸所含基團的種類和數(shù)量不同, 因此近紅外光譜可同時檢測多種氨基酸.為提取每種產物完整的光譜信息, 同時降低冗余波長攜帶噪聲的干擾, 選取有效波段：7 000～8 500 cm-1波段光譜能激發(fā)O—H和N—H基團的一級二級伸縮震動, 使C—H基團產生一級組合頻及二三級倍頻吸收光譜；6 000～7 000 cm-1波段為O—H的一級倍頻, 由于發(fā)酵液為液體, 含有大量水分, 因此該波段光譜吸收較明顯；芳香族的C—H伸縮振動和O—H組合頻位于5 000～6 000 cm-1處.由于透射光譜的波峰波谷重疊嚴重, 部分波段攜帶大量干擾信息, 其光譜在5 400～6 300 cm-1和7 300～10 000 cm-1處相對清晰, 因此在這兩個波段建立光譜校正模型.

反射光譜較透射光譜質量大幅度提高, 光譜曲線相對平滑, 但光譜攜帶信息減少.若僅根據(jù)波峰和波谷的位置選取波長范圍, 則會導致光譜有效信息提取不完整, 降低模型精度.為更好發(fā)揮光譜平滑的優(yōu)勢, 并降低攜帶信息較少的問題, 采用相關性分析法, 即用SPSS軟件計算不同光譜預處理下光譜吸收率與產物質量濃度間的相關關系, 根據(jù)二者間的顯著性水平高低選取最佳波段.計算結果表明: 當相關系數(shù)|r|≥0.471時, 光譜吸收率與真實值在0.01水平下具有顯著相關性; 當0.471>|r|≥0.368時, 波長吸收率與真實值在0.05水平下具有顯著相關性.圖3為7種不同光譜預處理下光譜吸收率與各產物真實值的相關系數(shù).由圖3(A)可見, 主副產物質量濃度與原始光譜吸收度在大部分波段呈負相關, 且質量濃度越大其相關性越高.為提高模型的精度, 選取|r|>0.471的波段, 即分別選取4 400～4 600 cm-1,5 300～6 500 cm-1和7 500～10 000 cm-1波段, 用于建立L-谷氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸和L-丙氨酸校正模型.由于L-亮氨酸與原始光譜吸收度的相關系數(shù)小于0.386, 因此原始光譜不能用于建立L-亮氨酸光譜預測模型.由圖3(B)可見, 在4 100～5 300 cm-1和5 500～7 300 cm-1處,L-谷氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸和L-丙氨酸的|r|>0.471, 具有較好的相關關系, 其中在4 500～5 100 cm-1和6 000～6 900 cm-1波段呈正相關, 在5 300～5 500 cm-1波段相關系數(shù)波動頻繁, 且|r|<0.471, 故舍棄.在4 100～4 500 cm-1,5 100～5 300 cm-1,5 500～6 000 cm-1和6 900～7 300 cm-1波段呈負相關, 為提取完整的光譜信息且不引入干擾信息, 選取4 100～5 300 cm-1和5 500～7 300 cm-1波段用于上述4種氨基酸建模分析.在7 900～8 300 cm-1和9 100～9 200 cm-1波段,L-亮氨酸的質量濃度與光譜吸光度的相關系數(shù)|r|>0.386, 表明L-亮氨酸在這兩個波段具有0.05水平顯著相關, 可用于建立光譜預測模型.

根據(jù)上述最佳波段的選擇方法, 由圖3(C)～(G)可見, 除L-亮氨酸外, 其他氨基酸在這5種光譜預處理下均具有較好的相關性.其中在FD+SG光譜預處理下, 選取4 000～5 500 cm-1和6 000～7 500 cm-1波段用于L-谷氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸和L-丙氨酸建模分析, 選取9 025～9 050 cm-1波段用于L-亮氨酸建模分析.在SD+N預處理下, 選取|r|>0.471的4 100～7 500 cm-1波段用于L-谷氨酸、L-蘇氨酸、L-丙氨酸和L-異亮氨酸建模分析, 選取9 050～9 150 cm-1波段用于建立L-亮氨酸光譜預測模型.在SD+SG光譜預處理下, 選取6 000～7 000 cm-1波段用于L-谷氨酸、L-蘇氨酸、L-丙氨酸和L-異亮氨酸建模分析.在MSC光譜處理下, 選取4 600～7 500 cm-1和9 000～10 000 cm-1波段用于L-谷氨酸、L-蘇氨酸、L-丙氨酸和L-異亮氨酸建模分析.與SD+SG光譜預處理結果相同, 未選出適于L-亮氨酸建模所用的波段.在SNV預處理下, 選取4 600～7 500 cm-1和9 000～10 000 cm-1波段用于L-蘇氨酸、L-異亮氨酸和L-谷氨酸建模分析, 分別選取4 600～7 200 cm-1和5 500～7 050 cm-1波段用于L-丙氨酸和L-亮氨酸建模分析.

圖3 不同光譜預處理下光譜吸收率與各產物真實值的相關系數(shù)

2.3 最優(yōu)模型的建立

選取5 400～6 300 cm-1,7 300～10 000 cm-1與(5 400～6 300)cm-1+(7 300～10 000)cm-1三個波段和7種光譜預處理方法進行組合, 用PLS交叉驗證方法建立L-異亮氨酸發(fā)酵過程主副產物的透射掃描光譜校正模型.根據(jù)7種光譜預處理和對應處理下的光譜吸收率和各成分真實值的相關性, 選取最佳波長范圍, 結合PLS交叉驗證方法建立主副產物反射光譜校正模型.透射掃描和反射掃描下發(fā)酵液樣品中各成分最優(yōu)模型參數(shù)分別列于表1和表2, 其中RMSEC為預測集均方根誤差.

由表1可見, 5 400～6 300 cm-1和7 300～10 000 cm-1是5種氨基酸的最佳波段,L-谷氨酸、L-蘇氨酸和L-異亮氨酸的交互驗證均方差(RMSECV)值分別為0.627,0.299,2.090, 校正集相關系數(shù)(Rc)均大于0.92, 相對分析誤差(RPD)均大于3, 表明透射掃描模型可滿足上述3種氨基酸精度檢測的要求.L-丙氨酸的RMSECV值為1.021, RPD值為2.9(<3), 表明近紅外光譜液體透射掃描丙氨酸模型基本達到檢測要求, 但檢測精度較低.L-亮氨酸的Rc值為0.649, RPD值為1.6(<2.5), 表明L-亮氨酸透射掃描光譜模型不能用于L-亮氨酸檢測.

表1 透射掃描下發(fā)酵液樣品中各成分模型參數(shù)

表2 反射掃描下發(fā)酵液樣品中各成分模型參數(shù)

由表2可見,L-谷氨酸、L-異亮氨酸、L-蘇氨酸和L-丙氨酸的懸濁液掃描光譜最優(yōu)模型的Rc值均大于0.98,L-亮氨酸的Rc值大于0.96, 均高于液體透射掃描的Rc值(0.93), 且RPD值均增大, 大于5.0, 因此表明反射掃描模型可提高L-谷氨酸、L-異亮氨酸、L-蘇氨酸和L-丙氨酸等4種成分的模型精度, 并可用于L-亮氨酸檢測.

2.4 模型外部驗證

為防止校正模型出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象, 利用剩余的35個發(fā)酵液樣品作為外部驗證材料, 分別對透射光譜和反射光譜校正模型進行驗證, 進一步確保光譜預測模型的準確性和可靠性.用相關分析法得到兩種光譜采集下的L-異亮氨酸、L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-蘇氨酸和L-亮氨酸質量濃度真實值和模型預測值間的相關關系, 分別如圖4和圖5所示, 光譜預測模型外部驗證結果分別列于表3和表4.

表3 透射掃描下各成分模型外部檢驗結果

表4 反射掃描下各成分模型外部檢驗結果

由表3和表4可見, 用光譜校正模型預測35個發(fā)酵液樣品的濃度, 在去除異常檢測樣品和異常光譜樣品后, 外部檢驗結果和校正模型參數(shù)基本一致.采用透射掃描方式時, 發(fā)酵液中主副產物的光譜模型僅L-蘇氨酸和L-異亮氨酸的RPD值大于3.0,L-谷氨酸和L-丙氨酸的RPD值為2.5～3.0, 與反射光譜的預測相關系數(shù)相差較大, 其檢測精度較低;L-亮氨酸的RPD值小于2.5, 表明無預測能力.反射掃描下發(fā)酵液中主副產物的光譜模型預測集均方根誤差值均小于液體透射掃描, 預測集相關系數(shù)(Rp)均大于0.98, 相對分析誤差均大于3.0, 因此反射光譜優(yōu)于透射光譜模型的預測能力.

圖5 透射掃描下驗證集中各成分真實值與預測值的散點圖

由圖4和圖5可見, 光譜的反射采集優(yōu)于透射采集方式, 這可能是由采集的光譜信息量不同所致.在發(fā)酵液中含有大量菌體和懸濁顆粒, 當用透射光譜采集方式時, 大量的近紅外光被懸濁顆粒和菌體吸收或反射, 僅少量近紅外光穿過, 導致接收器接收的光譜信息大量失真, 使其光譜圖較雜亂, 有效光譜信息較少.在建模過程中僅選取5 400～6 300 cm-1和7 300～10 000 cm-1波段用于建模, 因而無法保證發(fā)酵液中各成分的建模需求.當用反射光譜采集方式時, 在0號密封袋中加入樣品, 緊貼光源, 近紅外光射入樣品中, 雖有大量的近紅外光被發(fā)酵液中懸浮顆粒和菌體吸收、 反射, 但反射大多為漫反射, 方向不一, 僅較少部分的光可反射到接收器, 由于接收器接收的信息大多為首先接觸發(fā)酵液液體表面反射的光譜, 盡管光譜攜帶信息較少, 但大多為有效信息, 因此形成的光譜圖較平滑, 僅需在光譜預處理過程中將信息放大, 即可滿足發(fā)酵液各成分建模的信息需要.

綜上所述, 本文通過對L-異亮氨酸發(fā)酵過程中的發(fā)酵液進行采集和近紅外光譜掃描和分析, 確定了最佳光譜信息采集方式、 光譜預處理方法、 光譜波長范圍及模型因子數(shù), 建立了L-異亮氨酸發(fā)酵過程中主副產物最佳透射光譜和反射光譜預測模型.結果表明: 用反射優(yōu)于透射采集得到發(fā)酵液中各成分的近紅外光譜模型, 其L-異亮氨酸、L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-亮氨酸和L-蘇氨酸的Rc值分別為0.987,0.981,0.986,0.968,0.992；RMSECV值分別為1.760,0.462,0.430,0.259,0.199；RPD值分別為7.8,6.8,6.3,5.0,6.4; 預測值和測量值具有極顯著的相關性,L-異亮氨酸、L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-亮氨酸和L-蘇氨酸的預測集相關系數(shù)分別為0.998,0.981,0.996,0.980,0.992, RMSEC值分別為1.19,0.282,0.219,0.185,0.124, 較透射光譜相應的RMSEC值大幅度減少, 即建立的預測模型具有較高的精度及較好的預測能力, 可為L-異亮氨酸及其他氨基酸發(fā)酵過程中氨基酸質量濃度的實時監(jiān)控及優(yōu)化發(fā)酵過程提供理論和實踐依據(jù).