ARMCX1對宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖和凋亡的影響*

肖 莉，高 月，馬秀潔，孫雪竹，李亞娟，曹芳蕾，范 雪

(1 錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科， 遼寧 錦州 121001； 2重慶市北碚區(qū)中醫(yī)院檢驗(yàn)科， 重慶 400700)

含Armadillo重復(fù)序列X連鎖蛋白1(Armadillo repeat-containing X-linked protein 1, ARMCX1)是ARM蛋白家族的成員之一。研究顯示在人類多種正常組織中ARMCX1的mRNA水平表達(dá)增高而在腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞株中卻低表達(dá)[1]。研究也證實(shí)ARMCX1蛋白水平在乳腺癌組織中低表達(dá)，而在正常乳腺組織中高表達(dá)[2-4]。曾帆等[5-6]的研究卻發(fā)現(xiàn)ARMCX1蛋白水平在宮頸癌組織中高表達(dá)而在正常宮頸組織中低表達(dá)。ARMCX1在不同的腫瘤中蛋白水平表達(dá)不同，在不同的腫瘤中很可能發(fā)揮著不同的作用。因此，我們猜測ARMCX1在宮頸癌中很可能作為一種癌基因發(fā)揮重要作用。我們以宮頸癌細(xì)胞SiHa為研究對象，探討ARMCX1對宮頸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，為深入研究ARMCX1在宮頸癌發(fā)病機(jī)制中的作用提供依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

人宮頸癌SiHa細(xì)胞購自ATCC。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自Invitrogen；鼠抗人細(xì)胞周期蛋白E(cyclin E)、細(xì)胞分裂周期蛋白25A (cell division cycle 25A,Cdc25A)、Bcl-2、Bax和ARMCX1單克隆抗體及兔抗人β-actin多克隆抗體購自Santa Cruz；抗active caspase-3抗體購自Abways；siRNA由上海吉瑪公司合成。3條沉默ARMCX1的siRNAs和對照序列(RNAi-Con)如下：RNAi-1為5′-CCUGGAGCGAACAAAUGAUTT-3′(正義鏈)和5′-AUCAUUUGUUCGCUCCAGGTT-3′(反義鏈)；RNAi-2為5′-GCCUGCUACUGUGUAUACATT-3′(正義鏈)和5′-UGUAUACACAGUAGCAGGCTT-3′(反義鏈)；RNAi-3為5′-GCUGGGCUAAGACUGUUAATT-3′(正義鏈)和5′-UUAACAGUCUUAGCCCAGCTT-3′(反義鏈)；RNAi-Con為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′ (正義鏈)和 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ (反義鏈)。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) SiHa細(xì)胞在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，放置于5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融匯至70%～80%，生長良好用于實(shí)驗(yàn)。

2.2小干擾RNA轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞 將SiHa細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，按每孔1×105個細(xì)胞加入6孔板，待密度約50%，按Lipofectamine 2000說明書轉(zhuǎn)染細(xì)胞48～72 h。細(xì)胞分為對照(RNAi-Con)組和實(shí)驗(yàn)(RNAi-1、RNAi-2和RNAi-3)組，利用real-time PCR和Western blot檢測ARMCX1的表達(dá)水平，以確定其中一條沉默效果好的siRNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前將SiHa細(xì)胞制成懸液，接種于6孔板中。在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融匯至50%～60%時，加入8 μL的siRNA溶液和4 μL Lipofectamine 2000，再加入10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基到2 mL培養(yǎng)48 h。實(shí)驗(yàn)共分為NC-control組和siRNA-ARMCX1組。

2.4平板集落形成實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染后的SiHa細(xì)胞制成細(xì)胞懸液(1×106個/L)，以每孔500個的濃度加入12孔板，輕輕混勻，隔2 d換次培養(yǎng)液。孵育10 d，PBS緩沖液清洗3次，4%多聚甲醛固定10 min，PBS緩沖液清洗3次，用0.2%結(jié)晶紫染色液染色10 min，計數(shù)集落數(shù)目，上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布 siRNA轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞48 h后，胰酶消化后離心，收集細(xì)胞，PBS緩沖液沖洗2遍，離心棄上清，緩慢加入體積分?jǐn)?shù)75%的冷乙醇2 mL固定，4 ℃過夜；細(xì)胞密度調(diào)整為5×108～1×109個/L，PBS緩沖液重懸后加碘化丙啶(propidium iodide, PI)染液1 mL，避光15 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測分析各組細(xì)胞的DNA含量，上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 siRNA轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞48 h后，胰酶消化后離心，收集細(xì)胞，PBS緩沖液沖洗2次，離心棄上清，再加入1 mL PBS混勻，再加入5 μL annexin V-FITC，振蕩混勻，4 ℃孵育15 min加入5 μL PI，孵育5 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況，上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7Western blot 檢測各細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)蛋白的水平 收集轉(zhuǎn)染siRNA 48 h后的SiHa細(xì)胞。提取總蛋白，測定蛋白濃度。用8% SDS-PAGE進(jìn)行分離后，將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加 I 抗體4 ℃孵育過夜。TBST洗膜5次，加入 II 抗室溫再孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光，檢測蛋白表達(dá)水平。以β-actin作為內(nèi)參照，各組蛋白表達(dá)水平=各目的蛋白灰度值/β-actin蛋白灰度值。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，利用t檢驗(yàn)統(tǒng)計分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 RNAi效率的檢測

將RNAi-1、RNAi-2、RNAi-3及RNAi-Con序列分別轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞,real-time PCR檢測ARMCX1的mRNA表達(dá)量，72 h后收集細(xì)胞用Western blot檢測ARMCX1蛋白的表達(dá)量。結(jié)果顯示RNAi-3序列沉默ARMCX1效果明顯(P<0.01)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見圖1。將RNAi-3命名為siRNA-ARMCX1，對照組命名為NC-control。

Figure 1. The silencing ofARMCX1in SiHa cells transfected with siRNAs. A: the mRNA expression of ARMCX1 detected by real-time PCR; B: the protein expression of ARMCX1 detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsRNAi-Con group.
圖1 小干擾RNA轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞后ARMCX1的表達(dá)

2 siRNA轉(zhuǎn)染后SiHa細(xì)胞集落形成能力的改變

利用平板集落形成實(shí)驗(yàn)觀察敲減ARMCX1表達(dá)對SiHa細(xì)胞集落形成能力的影響，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組SiHa細(xì)胞的集落形成數(shù)目明顯少于對照組(P<0.05)，見圖2。

3 siRNA轉(zhuǎn)染后SiHa細(xì)胞周期分布的變化情況

敲減ARMCX1表達(dá)的SiHa細(xì)胞其細(xì)胞周期被阻滯在S期，見圖3。

4 siRNA轉(zhuǎn)染后SiHa細(xì)胞凋亡變化情況

敲減ARMCX1表達(dá)的SiHa細(xì)胞其凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多(P<0.05)，見圖4。

5 siRNA轉(zhuǎn)染對SiHa細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

敲減ARMCX1表達(dá)的SiHa細(xì)胞中cyclin E和磷酸化Cdc25A的蛋白水平降低,Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著減少，active caspase-3的蛋白水平顯著增加(P<0.05),見圖5。

討 論

ARM家族蛋白是一類含有Armadillo重復(fù)序列結(jié)構(gòu)的蛋白。Armadillo重復(fù)序列結(jié)構(gòu)首次在果蠅極性基因中發(fā)現(xiàn)，對果蠅胚胎和早期細(xì)胞極性形成以及維持上皮組織完整性具有重要作用[7]。ARMCX1蛋白是ARM蛋白家族的成員。生物信息學(xué)提示,ARMCX1基因位于Xq21.33-q22.2，其蛋白被一個外顯子編碼而且具有2個Armadillo重復(fù)序列結(jié)構(gòu)[1, 8-9]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在心臟、結(jié)腸、前列腺、腦和卵巢等大多數(shù)正常組織中ARMCX1表達(dá)呈高水平而在胰腺癌、乳腺癌和卵巢癌組織中低表達(dá)，在肺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌組織中沒有表達(dá)[1-3, 10-11]。但也有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)ARMCX1在宮頸癌組織中高表達(dá)而在正常宮頸組織中低表達(dá)[5-6]。與之前的學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)有所不同。我們猜測ARMCX1在宮頸癌中可能作為一種癌基因發(fā)揮重要作用。因此，我們以宮頸癌細(xì)胞SiHa為研究對象，探討ARMCX1對宮頸癌細(xì)胞增殖和凋亡方面的作用機(jī)制，為深入研究ARMCX1在宮頸癌發(fā)病機(jī)制中的作用提供依據(jù)。

Figure 2. The effect ofARMCX1expression knock-down on colony formation of SiHa cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC-control group.
圖2 敲減ARMCX1的表達(dá)對SiHa細(xì)胞平板集落形成能力的影響

Figure 3. The effect ofARMCX1expression knock-down on the cell cycle distribution of SiHa cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC-control group.
圖3 敲減ARMCX1的表達(dá)對SiHa細(xì)胞周期的影響

Figure 4. The effect ofARMCX1expression knock-down on the apoptosis of SiHa cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC-control group.
圖4 敲減ARMCX1的表達(dá)對SiHa細(xì)胞凋亡的影響

Figure 5. The effect ofARMCX1expression knock-down on the protein levels of apoptosis- and cell cycle-related molecules. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC-control group.
圖5 敲減ARMCX1的表達(dá)對SiHa細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白水平的影響

已有文獻(xiàn)報道，在宮頸癌HeLa細(xì)胞中沉默ARMCX1能夠抑制宮頸癌細(xì)胞的生長，并且細(xì)胞周期阻滯在S期[5]。我們的研究也發(fā)現(xiàn)在宮頸癌SiHa細(xì)胞中敲減ARMCX1的表達(dá)后，細(xì)胞的集落形成能力受抑制，并且S期細(xì)胞明顯增多，表明敲減ARMCX1的表達(dá)阻滯了SiHa細(xì)胞周期進(jìn)程。cyclin/cyclin依賴性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)是調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程的關(guān)鍵大分子，而cyclin E/CDK2是G1/S關(guān)鍵點(diǎn)重要的效應(yīng)子。在G1/S轉(zhuǎn)化進(jìn)程中，Cdc25A通過對cyclin E/CDK2的作用促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期，而Cdc25A 表達(dá)水平的下降導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在S期[12]。我們的研究發(fā)現(xiàn)敲減ARMCX1的表達(dá)后，cyclin E和Cdc25A蛋白質(zhì)表達(dá)水平均降低。因此我們猜測敲減ARMCX1的表達(dá)很可能直接或間接降低Cdc25A蛋白表達(dá)量，進(jìn)而使細(xì)胞周期阻滯在S期。細(xì)胞周期被阻滯能夠抑制細(xì)胞的增殖，最終誘發(fā)細(xì)胞凋亡。caspase-3是caspase家族的重要成員，在細(xì)胞凋亡程序中起最后的樞紐作用[13]，active caspase-3是caspase-3的主要活化形式，具有生物學(xué)活性，active caspase-3的表達(dá)量可反映細(xì)胞凋亡情況。Bcl-2是caspase-3的上游調(diào)控蛋白，可抑制active caspase-3的表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞的凋亡。而Bax的作用正好相反，它具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的功能[14-18]。本研究結(jié)果顯示，敲減ARMCX1的表達(dá)后凋亡的SiHa細(xì)胞數(shù)量增加，Bcl-2蛋白表達(dá)量減少，而Bax和active caspase-3蛋白量卻增加，提示敲減ARMCX1的表達(dá)很可能通過增加Bax和active caspase-3 的蛋白表達(dá)，降低Bcl-2的蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡。

綜上所述，本研究證明在宮頸癌細(xì)胞中敲減ARMCX1的表達(dá)能夠阻滯細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與沉默ARMCX1后引起細(xì)周期S期的相關(guān)蛋白cyclin E和Cdc25A蛋白表達(dá)量降低，細(xì)胞阻滯在S期，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。同時，引起B(yǎng)ax和active caspase-3的蛋白量的增加，降低了Bcl-2的蛋白表達(dá)，啟動內(nèi)源性凋亡通路引起細(xì)胞凋亡。本研究的發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究ARMCX1在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供了依據(jù)。