尼古丁通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化加重實(shí)驗(yàn)性脈絡(luò)膜新生血管的形成*

鞏亞軍，賴?yán)へ悾铨堓x，黃創(chuàng)新，許發(fā)寶，周立軍，金陳進(jìn)

(中山大學(xué)中山眼科中心眼科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東 廣州 510060)

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular dege-neration, AMD)是發(fā)達(dá)國家60歲以上人群中首要的不可逆性致盲眼病,AMD導(dǎo)致中心視力下降甚至失明而嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，給家庭和社會(huì)造成了極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1-2]。晚期AMD一般分為地圖樣萎縮和新生血管性或濕性AMD，脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)是濕性AMD的典型特征[3]。AMD是基因和環(huán)境共同作用的多因素疾病，在眾多危險(xiǎn)因素中，吸煙被認(rèn)為是最重要的可修正因素，而尼古丁是香煙中最重要的有害生物活性物質(zhì)[4-5]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究均證實(shí)香煙中的尼古丁可加重CNV病情[6-7]，而且吸煙對CNV病情的有害作用即使在戒煙后仍可持續(xù)將近20年[8]。令人遺憾的是，吸煙加重CNV病情的原因至今不明，因此目前臨床上無任何手段能有效阻止吸煙患者CNV 病情的惡化。而我國吸煙人數(shù)眾多，由吸煙導(dǎo)致CNV患者病情惡化的情況不容忽視，迫切需要將吸煙加重CNV病情的機(jī)制進(jìn)行詳細(xì)研究。

濕性AMD的病理過程以多種細(xì)胞的增殖和(或)浸潤為特點(diǎn)，包括視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞[9],而巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是AMD病灶中最重要的炎癥浸潤細(xì)胞，在CNV的發(fā)展中具有重要的作用[10],但巨噬細(xì)胞在尼古丁加重CNV的過程中發(fā)揮著何種作用迄今未知。因此，本實(shí)驗(yàn)通過尼古丁暴露的激光誘導(dǎo)小鼠CNV模型探究巨噬細(xì)胞在尼古丁加重CNV中所發(fā)揮的重要作用及其機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6J小鼠74只，6～8周，雄性，SPF級，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證號： No.44007200044340; No.44007200046721; No.44007200050429; No.44007200048117)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)條件及使用遵循國家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.2主要試劑及儀器 尼古丁、TRIzol和異硫氰酸熒光素標(biāo)記的葡聚糖(fluorescein isothiocyanate-labeled dextran,FITC-dextran)均購自Sigma;熒光素鈉注射液(廣州白云山明興制藥公司);大鼠抗小鼠F4/80抗體(Bio-Rad);兔抗小鼠誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)抗體、山羊抗兔Ⅱ抗和山羊抗大鼠Ⅱ抗(CST);兔抗小鼠CD206抗體(Abcam);VECTASHIELD?Mounting Medium水溶性封片劑(H-1000，VECTOR);實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物公司);引物(Thermo Fisher);白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6) ELISA Kit、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)ELISA Kit、細(xì)胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)ELISA Kit和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)ELISA Kit (R&D);PMSF和RIPA(CST)。810紅外半導(dǎo)體激光器(IRIDEX);裂隙燈顯微鏡(Zeiss);小鼠角膜接觸鏡(Ocular);MicronⅢ小鼠視網(wǎng)膜成像系統(tǒng)(Phoenix Research);冰凍切片機(jī)(Lecia);酶標(biāo)儀(Bio-tex);熒光定量PCR儀(Roche);熒光顯微鏡(OLYMPUS)；激光共聚焦顯微鏡(Zeiss)。

2 方法

2.1實(shí)驗(yàn)分組及處理 6～8周的C57BL/6J小鼠由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購進(jìn)后，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組小鼠均給予相同體積的飲用水，但實(shí)驗(yàn)組飲水中按100 mg/L的劑量加入尼古丁。為保證飲水的新鮮，每天更換。飼養(yǎng)4周后采用激光光凝建立CNV小鼠模型。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)中山大學(xué)中山眼科中心動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(2016-106)，實(shí)驗(yàn)中嚴(yán)格遵循動(dòng)物福利和倫理準(zhǔn)則。

2.2小鼠脈絡(luò)膜新生血管激光誘導(dǎo)模型的建立 尼古丁或水飼養(yǎng)4周后采用激光誘導(dǎo)脈絡(luò)膜新生血管模型，具體操作流程如下:復(fù)方托吡酰胺充分散瞳，4.3%的水合氯醛經(jīng)腹腔注射麻醉小鼠(10 mL/kg)，充分麻醉后鹽酸丙美卡因點(diǎn)眼以降低角膜敏感性，2%的羥甲基纖維素作為耦合劑，用810紅外半導(dǎo)體激光器造模(激光參數(shù)：50 μm，50 ms，250 mW)，在距離視乳頭2PD處3、6、9及12 鐘點(diǎn)行視網(wǎng)膜光凝，光凝后以能看見有白色氣泡產(chǎn)生提示Bruch’s膜被擊穿為標(biāo)準(zhǔn)，4點(diǎn)均符合此標(biāo)準(zhǔn)者才入選為研究對象，光凝處視網(wǎng)膜出血者排除。造模結(jié)束后雙眼涂妥布霉素眼膏，置于保溫毯復(fù)蘇后放回飼養(yǎng)間。

2.3小鼠眼底血管熒光造影檢測滲漏程度 造模7 d后行熒光素眼底血管造影術(shù)(fluorescein fundus angiography，F(xiàn)FA)，復(fù)方托吡酰胺散瞳，4.3%的水合氯醛經(jīng)腹腔注射麻醉小鼠(10 mL/kg)，充分麻醉后鹽酸丙美卡因點(diǎn)眼，修剪小鼠胡須，滴2%的羥甲基纖維素于目標(biāo)眼，用視網(wǎng)膜成像系統(tǒng)拍攝小鼠眼底彩照，觀察激光斑是否存在。1%的熒光素鈉，按照10 mL/kg的劑量腹腔注射，觀察小鼠早期(1 min)和晚期(5 min)的熒光素鈉滲漏情況，采用Krzystolik等[11]的方法將激光斑按熒光素滲漏程度分為4級：1級，無滲漏，光斑無高熒光；2級，輕度滲漏，光斑有高熒光但無熒光素滲漏；3級，中度滲漏，光斑高熒光，伴有輕度熒光素滲漏，但滲漏不超過光斑邊界；4級，重度滲漏，光斑高熒光，伴有顯著熒光素滲漏，且滲漏超過光斑邊界。結(jié)束后雙眼涂妥布霉素眼膏，置于保溫毯復(fù)蘇后放回飼養(yǎng)間。

2.4脈絡(luò)膜鋪片測量小鼠CNV面積大小 造模后第7天，4.3%水合氯醛(10 mL/kg)充分麻醉小鼠，用大頭針將小鼠四肢固定在泡沫板，從腹中部剪開腹腔直至劍突下，剪開橫膈，血管鉗夾住胸主動(dòng)脈。暴露心臟，剪開右心耳，將1 mL的FITC-dextran溶液(使用前用PBS配成50 g/L)從左心室快速注入。灌注成功的標(biāo)志為小鼠舌頭及四肢變黃，手術(shù)顯微鏡下可見視網(wǎng)膜的血管被黃綠色熒光素充盈。摘除灌注成功的小鼠眼球，4%多聚甲醛固定2 h。手術(shù)顯微鏡下剔除肌肉纖維組織，從赤道部剪開眼球，去除前節(jié)，小心將玻璃體視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層剝離，剩余RPE-脈絡(luò)膜-鞏膜組織，用角膜剪從赤道部到視乳頭放射狀剪開5～6刀(避開激光斑)，將RPE-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體平鋪在載玻片上，滴加VECTASHIELD@Mounting Medium水溶性封片劑，加蓋玻片，熒光顯微鏡下拍攝CNV圖片，ImageJ軟件(版本號1.52a)測量CNV的面積。

2.5免疫熒光觀察巨噬細(xì)胞時(shí)間和空間分布 各組分別于造模后1、3、7和14 d檢測CNV 病灶處M1和M2型巨噬細(xì)胞，在上述時(shí)點(diǎn)取小鼠眼球經(jīng)固定、梯度脫水、包埋后行冰凍切片，厚度6 μm，選取脈絡(luò)膜新生血管病灶最大處切片行熒光染色，將F4/80分別與iNOS、CD206共染，經(jīng)打孔、封閉、孵育Ⅰ和Ⅱ抗，復(fù)染核后滴加抗淬滅劑加蓋玻片，在熒光顯微鏡/共聚焦顯微鏡下觀察M1和M2 巨噬細(xì)胞的時(shí)空分布，計(jì)數(shù)20倍鏡下CNV病灶周圍M1和M2型巨噬細(xì)胞，計(jì)算M2/M1比例。

2.6RT-qPCR檢測M1、M2型巨噬細(xì)胞極化相關(guān)分子標(biāo)志物 各組分別于造模后第3天摘取眼球，3只眼球?yàn)橐唤M，顯微鏡下冰上操作小心去除結(jié)締組織和肌肉，去除前節(jié)，分離RPE-脈絡(luò)膜-鞏膜組織，加入1 mL TRIzol，超聲波充分破碎組織后，提取總RNA?？俁NA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板進(jìn)行RT-qPCR。各基因特異引物序列見表1。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s，57 ℃退火及延伸30 s，循環(huán)40次。熔解曲線溫度65～95 ℃。以β-actin為內(nèi)參照，對各個(gè)基因相對表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算。

2.7ELISA檢測病灶局部炎癥因子及VEGF的改變 各組分別于造模后第1和3天摘取眼球，3只眼球?yàn)橐唤M，顯微鏡下冰上操作小心去除結(jié)締組織和肌肉，去除前節(jié)，分離RPE-脈絡(luò)膜-鞏膜組織。將組織放入200 μL RIPA與PMSF(100∶1)的混合液中，超聲波充分破碎組織后，提取總蛋白。BCA法測定總蛋白濃度，按照ELISA試劑盒說明測定炎癥因子(IL-6、TNF-α和ICAM-1)及VEGF的濃度。

表1 RT-qPCR引物Table 1. Primers of RT-qPCR

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究中定量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示[CNV面積以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示]，F(xiàn)FA滲漏程度使用卡方檢驗(yàn)，CNV的面積、極化巨噬細(xì)胞及炎癥因子的改變使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 尼古丁增加CNV的大小和滲漏

造模7 d后FFA結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組和對照組的滲漏分?jǐn)?shù)分別為3.31±0.93和2.97±0.94，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=6.07，P<0.05)，見圖1、表2。尼古丁明顯加重CNV滲漏程度，相比于對照組(31.25%)，實(shí)驗(yàn)組重度滲漏率(56.25%)明顯增加(2=4.06，P<0.05)，見表3。造模7 d后，ImageJ軟件測量CNV面積，實(shí)驗(yàn)組為(17 569.96±1 444.00) μm2，對照組為(10 158.63±711.00) μm2，尼古丁可顯著促進(jìn)CNV的發(fā)展(P<0.05)，見圖2。

Figure 1. Representative images of laser spot fluorescein leakage. Seven days after laser injury, CNV leakage was imaged with fluorescein fundus angiography. Image were taken at 1 and 5 min after intraperitoneal injection of fluorescein sodium.
圖1 激光斑熒光素滲漏代表圖片

表2 第7天激光斑熒光素滲漏情況Table 2. Laser spot fluorescein leakage on day 7

2=6.07.*P<0.05vscontrol group.

表3 第7天激光斑熒光素重度滲漏與非重度滲漏情況Table 3. Severe and non-severe leakage of laser spot fluorescein on day 7

2=4.06.*P<0.05vscontrol group.

Figure 2. Nicotine aggravated CNV in mice. Mean±SEM.n=8.*P<0.05vscontrol group. Scale bars=50 μm.
圖2 尼古丁加重CNV的發(fā)展

2 尼古丁增加M2型巨噬細(xì)胞的浸潤

造模后1、3、7及14 d，F(xiàn)4/80和CD206免疫熒光雙染結(jié)果表明,M2型巨噬細(xì)胞早期出現(xiàn)，逐漸增加，第7天達(dá)到高峰，隨后緩慢下降，表現(xiàn)為早期低晚期高的時(shí)間變化趨勢；并且由病灶外圍，逐漸向病灶中央浸潤，表現(xiàn)出由外到內(nèi)的空間分布規(guī)律，表明尼古丁可明顯增加M2型巨噬細(xì)胞的浸潤,見圖3。造模后1、3、7及14 d，F(xiàn)4/80和iNOS免疫熒光雙染結(jié)果表明，M1型巨噬細(xì)胞早期高，第3天為高峰，隨后逐漸減少，表現(xiàn)為早期高晚期低的時(shí)間變化趨勢，見圖4。通過計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)尼古丁主要增加M2型巨噬細(xì)胞的浸潤，同時(shí)升高M(jìn)2/M1的比率，改變巨噬細(xì)胞極化平衡，從而促進(jìn)CNV的生長(P<0.05)，見圖5。

Figure 3. Spatiotemporal expression of M2-type macrophages around CNV lesions. Immunofluorescent F4/80 and CD206 double staining of CNV sections on 1, 3, 7, and 14 d after laser photocoagulation. Green indicates F4/80, red indicates CD206 and blue indicates DAPI-stained cellular nuclei. F4/80+/CD206+M2-type macrophages (white arrows) were detected in CNV sections. Scale bars=20 μm.
圖3 CNV病灶周圍M2型巨噬細(xì)胞的時(shí)空表達(dá)

Figure 4. Spatiotiemptoral expression of M1-type macrophages around CNV lesions. Immunofluorescent F4/80 and iNOS double staining of CNV sections on 1, 3, 7, and 14 d after laser photocoagulation. Green indicates F4/80, red indicates iNOS and blue indicates DAPI-stained cellular nuclei. F4/80+/ iNOS+M1-type macrophages (white arrows) were detected in CNV sections. Scale bars=20 μm.
圖4 CNV病灶周圍M1型巨噬細(xì)胞的時(shí)空表達(dá)

Figure 5. Changes of the number and proportion of the macrophages with immunofluorescence staining. Blinded cell counting was performed by two separate observers for each image. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.
圖5 巨噬細(xì)胞個(gè)數(shù)及比例的變化

3 尼古丁促進(jìn)巨噬細(xì)胞相關(guān)分子標(biāo)志物mRNA的表達(dá)

造模后第3天RT-qPCR結(jié)果表明，尼古丁組M2相關(guān)的分子標(biāo)志物(Ccl-2、CD163和CD206)mRNA的表達(dá)量較對照組顯著升高(P<0.05),但是M1相關(guān)的分子標(biāo)志物(Cxcl-10、Cxcl-11和iNOS)mRNA的表達(dá)量兩組間并無顯著差異，見圖6。

Figure 6. RT-qPCR analysis for M2-related and M1-related marker mRNA expression in RPE-choroid-sclera complexes 3 d after laser photocoagulation. M2-related markers included Ccl-2, CD163 and CD206; M1-related markers included Cxcl-10, Cxcl-11 and iNOS. Mean±SD.n=9.*P<0.05vscontrol group.
圖6 各類巨噬細(xì)胞標(biāo)志物mRNA的表達(dá)

4 尼古丁促進(jìn)炎癥因子和VEGF的表達(dá)

ELISA結(jié)果表明，造模后早期(第1天和第3天)，相對于對照組，尼古丁要明顯促進(jìn)炎癥因子和VEGF的表達(dá)(P<0.05)，見圖7。

Figure 7. Nicotine promoted the secretion of inflammatory factors and VEGF. One and three days after laser injury, the concentrations of inflammatory factors (IL-6, TNF-α and ICAM-1) and VEGF in RPE-choroid-sclera complexes CNV mice were detected by ELISA. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.
圖7 尼古丁促進(jìn)炎癥因子及VEGF的分泌

討 論

AMD是一個(gè)基因和環(huán)境共同作用的多因素疾病，許多危險(xiǎn)因素包括衰老、家族史、糖尿病、高血壓、體重指數(shù)、吸煙和飲酒都與AMD的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[12]。大量的臨床研究表明在眾多危險(xiǎn)因素中吸煙是最重要的可修正危險(xiǎn)因素，香煙中4 000多種有毒物質(zhì)中，尼古丁被認(rèn)為是最有力的促血管損傷病理反應(yīng)物質(zhì)[5]。一項(xiàng)對4 439居民長達(dá)20年的縱向隨訪研究證實(shí)吸煙不僅增高人群中AMD的患病率，而且使晚期CNV的發(fā)生率明顯上升[13]。Lechanteur等[14]的研究也證實(shí)吸煙不僅使AMD患者的發(fā)病年齡提前，而且吸煙者發(fā)生CNV的幾率比不吸煙者高2～4倍，且與年吸煙量密切相關(guān)。同時(shí)尼古丁可以阻斷雷珠單抗(ranibizumab，Lucentis?)抑制CNV的效應(yīng)，使吸煙的CNV患者抗VEGF療法的療效明顯降低[15]，這或許從一定程度上解釋了為何臨床中部分患者對抗VEGF療法不敏感的原因。目前對尼古丁的病理作用研究主要在促進(jìn)腫瘤新生血管上，但尼古丁促進(jìn)CNV的確切機(jī)制目前并不清楚。

我們的實(shí)驗(yàn)表明尼古丁不僅明顯增加了CNV的面積，同時(shí)加重CNV的滲漏程度，這與先前的研究結(jié)果是一致的[16]。CNV是病理性脈絡(luò)膜的新生血管長入視網(wǎng)膜下腔，由于新生血管通透性高導(dǎo)致視網(wǎng)膜下出血和滲出物沉積使視細(xì)胞變性壞死從而造成90%AMD患者永久性視力喪失[17-18]。脈絡(luò)膜新生血管的病理機(jī)制是血管生成,血管生成是一個(gè)復(fù)雜的病理過程，包括細(xì)胞外基質(zhì)變性，內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖、管腔形成和血管壁的重構(gòu)，該過程由促新生血管因子和抗新生血管因子的平衡所決定[19]。而尼古丁作為一種天然存在的促新生血管物質(zhì)，最早在腫瘤和動(dòng)脈粥樣硬化的研究中被發(fā)現(xiàn)。Heeschen等[20]發(fā)現(xiàn)，尼古丁可以通過血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的N型乙酰膽堿受體發(fā)揮強(qiáng)效促血管生成作用，從而促進(jìn)腫瘤生長和動(dòng)脈粥樣硬化的形成。

Pons等[21]的實(shí)驗(yàn)表明尼古丁能通過結(jié)合色素上皮細(xì)胞表面N型乙酰膽堿受體的β1和α4亞基促進(jìn)VEGF分泌而抑制色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)分泌，上調(diào)VEGF/PEDF比率，從而打破促新生血管因子和抗新生血管因子的平衡，加重CNV生長。但添加尼古丁受體阻滯劑后，CNV的生長并沒有完全被抑制[16]，這說明尼古丁還通過其它機(jī)制促進(jìn)CNV生長。許建英等[22]的研究結(jié)果表明香煙提取物可明顯通過NF-κB通路刺激巨噬細(xì)胞來源的ICAM-1，后者是巨噬細(xì)胞促進(jìn)新生血管的重要因子。我們的研究表明尼古丁可以增加巨噬細(xì)胞的浸潤，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化，從而升高M(jìn)2/M1的比率。巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，局部組織損傷后釋放趨化因子，引導(dǎo)外周血中單核細(xì)胞向損傷部位聚集，并且活化為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞具有高度的可塑性，在不同微環(huán)境中可分化為功能不同的表型，稱為巨噬細(xì)胞極化[23]。極化的巨噬細(xì)胞在炎癥反應(yīng)、損傷修復(fù)、血管生成等病理過程中扮演著重要角色。通常將巨噬細(xì)胞分為經(jīng)典活化型(M1型)和選擇活化型(M2型)，二者代表巨噬細(xì)胞的兩個(gè)極端，M1型巨噬細(xì)胞抑制血管生成，而M2型巨噬細(xì)胞促進(jìn)新生血管形成，即M2/M1的比例決定新生血管的形成[24]。我們的研究表明尼古丁可以影響巨噬細(xì)胞的極化平衡，形成M2High/M1Low的促血管形成模式。此外免疫熒光的結(jié)果提示，CNV病灶中M2型巨噬細(xì)胞早期就已出現(xiàn)，并且緩慢上升，直至第7天達(dá)到高峰，第7～14天則恢復(fù)至基線水平。這與激光誘導(dǎo)小鼠CNV在第3天開始出現(xiàn)，第7天明顯生長相符合，提示M2型巨噬細(xì)胞在CNV的整個(gè)發(fā)展過程中發(fā)揮作用，并在中晚期CNV的持續(xù)發(fā)展中發(fā)揮重要作用，這與Yang等[3]的研究結(jié)果一致。

巨噬細(xì)胞促進(jìn)新生血管是通過VEGF、ICAM-1和TNF-α等一系列細(xì)胞因子實(shí)現(xiàn)的[25]。RPE細(xì)胞的損傷在CNV的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，損傷的RPE細(xì)胞可以分泌前列腺素E2誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞移行，并分化為M2型巨噬細(xì)胞?；罨腗2型巨噬細(xì)胞可影響內(nèi)皮細(xì)胞、RPE細(xì)胞產(chǎn)生ICAM-1、TNF-α和VEGF等細(xì)胞因子，改變病灶局部的炎癥微環(huán)境，進(jìn)一步促進(jìn)血源性巨噬細(xì)胞的移行浸潤，形成惡性循環(huán)，而內(nèi)皮細(xì)胞、RPE細(xì)胞為中后期VEGF的主要來源細(xì)胞，促進(jìn)CNV中后期的發(fā)展。ICAM-1高表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞和RPE細(xì)胞表面，是細(xì)胞識(shí)別的重要分子，介導(dǎo)巨噬細(xì)胞的粘附與移行[26]。TNF-α具有調(diào)節(jié)炎癥、增殖、細(xì)胞毒性的多種作用，可以促進(jìn)VEGF和單核細(xì)胞趨化蛋白-1等促血管生成因子的表達(dá)[27]，而我們的實(shí)驗(yàn)表明尼古丁通過增加M2型巨噬細(xì)胞的浸潤，促進(jìn)ICAM-1和TNF-α等的炎癥因子分泌，這說明尼古丁可以通過調(diào)控巨噬細(xì)胞極化而增加ICAM-1和TNF-α等炎癥因子的分泌，從而改變病灶周圍炎癥微環(huán)境，增加VEGF的分泌?；罨腗2型巨噬細(xì)胞是早期VEGF的重要來源，并且通過分泌IL-8和IL-10等細(xì)胞因子作用于RPE細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)其產(chǎn)生更多的VEGF，推動(dòng)中晚期CNV的發(fā)展[28-29]。我們的實(shí)驗(yàn)通過ELISA檢測激光后早期(第1、3天)CNV病灶周圍的VEGF蛋白水平，發(fā)現(xiàn)尼古丁刺激可以明顯增加早期VEGF的分泌，我們推測尼古丁刺激早期激光斑周圍浸潤的血源性巨噬細(xì)胞向M2型極化，促使早期VEGF的分泌增加，促進(jìn)CNV早期的生長。

綜上所述，我們的實(shí)驗(yàn)表明了尼古丁能夠通過促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞的極化，形成M2High/M1Low的促新生血管形成模式，進(jìn)而上調(diào)炎癥因子(IL-6、TNF-α和ICAM-1)及VEGF的表達(dá)和翻譯，最終加重激光誘導(dǎo)小鼠CNV的發(fā)展。我們的研究結(jié)果提示巨噬細(xì)胞極化介導(dǎo)的炎癥在CNV的發(fā)展中發(fā)揮重要作用，這在一定程度上解釋了臨床吸煙的AMD患者單純抗VEGF療法不敏感的原因，也為這類患者的治療提供了新思路和新策略。巨噬細(xì)胞極化發(fā)生在CNV早期，調(diào)控巨噬細(xì)胞極化有望從源頭控制促血管生成因子的表達(dá)及由此觸發(fā)的CNV，為針對巨噬細(xì)胞的靶向治療提供理論依據(jù)。但是小鼠CNV模型的病理過程與人類AMD并不完全相同，因此，還需進(jìn)一步在人體中驗(yàn)證該機(jī)制的確切性。