TRIM8在高糖高脂誘導(dǎo)的小鼠心肌細胞凋亡中的作用*

唐名揚, 宋志平, 侯娟妮, 馮 健, 馮 娟, 裴海峰△, 楊永健, △

(1 川北醫(yī)學(xué)院， 四川 南充 637000； 2西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院心內(nèi)科， 四川 成都 610083)

目前，糖尿病已成為發(fā)達國家及發(fā)展中國家共同面對的巨大健康難題，根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟的統(tǒng)計，2017年全球糖尿病患者人數(shù)已達4.25億[1]，其中2型糖尿病占所有糖尿病患者的90%，不僅如此，60%的2型糖尿病患者常常伴有血脂異常，主要表現(xiàn)為血中甘油三酯升高、低密度脂蛋白膽固醇正?；蛏?、高密度脂蛋白膽固醇降低和游離脂肪酸升高，其中以游離脂肪酸升高最為常見[1]。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病的主要心血管并發(fā)癥之一，2/3的2型糖尿病患者伴有心血管疾病危險因素或經(jīng)歷過心血管事件，而血脂異常，特別是游離脂肪酸的增加被證實是導(dǎo)致這一現(xiàn)象的主要原因[2-3]。但目前DCM的防治效果并不理想，其龐大的患者人群和不斷攀升的發(fā)病率已成為嚴重的公共衛(wèi)生問題。因此，有必要研究高糖尤其是合并高脂狀態(tài)下心肌易損性的機制與防范措施。

含三基序蛋白8(tripartite motif-containing protein 8，TRIM8)屬于TRIM蛋白家族成員，在固有免疫、炎癥反應(yīng)及胰島素抵抗等多種病理過程中發(fā)揮著重要作用，例如它能夠介導(dǎo)非酒精性肝硬化[4]和高脂誘導(dǎo)的肥胖[5]等多種疾病的發(fā)生發(fā)展。除此之外，Chen等[6]報道TRIM8能夠通過介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和胰島素抵抗等途徑加重心肌肥厚。上述研究表明，TRIM8與心血管疾病在內(nèi)的多種疾病的發(fā)病機制密切相關(guān)，但其在DCM中的作用尚無報道。因此，本研究在前期研究基礎(chǔ)上，在細胞水平采用高糖高脂(high glucose and high free acid, HGHF)培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠心肌細胞(mouse cardiomyocytes，MCMs)為模型，旨在研究糖尿病合并高脂的心肌細胞中TRIM8的作用及其相關(guān)機制，期望進一步揭示糖尿病心肌病的發(fā)生及發(fā)展機制。

材 料 和 方 法

1 細胞系及主要試劑

小鼠心肌細胞系購自豪地華拓生物科技有限公司，產(chǎn)品批號：HTX2799。DMEM培養(yǎng)基及胰蛋白酶購自HyClone；胎牛血清購Sigma；TRIzol和Lipofectamine 2000購自Invitrogen；反轉(zhuǎn)錄及PCR檢測試劑盒購自TaKaRa；qPCR 引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司設(shè)計；二氫乙啶(dihydroethidium,DHE)超氧化物陰離子熒光探針購自凱基生物；annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自BD；TRIM8-siRNA及scrambled siRNA (Scra-siRNA)購自銳博生物；抗α-actinin抗體購自Abcam；抗TRIM8抗體購自Santa Cruz；抗核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2)抗體購自CST；Nrf2抑制劑ML385購自Selleck。

2 實驗方法

2.1高糖高脂心肌細胞的培養(yǎng) MCMs中加入含10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM正常糖培養(yǎng)基(葡萄糖濃度為5.5 mmol/L)，后置于5% CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選擇生長良好的對數(shù)生長期細胞，接種于6孔培養(yǎng)板中，給予高糖(葡萄糖濃度為33 mmol/L)及軟脂酸鈉(軟脂酸鈉濃度為300 μmol/L)培養(yǎng)基干預(yù)培養(yǎng),并按分組進行實驗。

2.2免疫熒光染色鑒定小鼠心肌細胞 將MCMs制作成細胞爬片，待細胞生長至70%左右用PBS清洗3次；滴加50 μL破膜工作液，室溫孵育20 min后PBS清洗3次；3%牛血清白蛋白均勻覆蓋爬片，室溫封閉30 min后PBS清洗3次；加入I抗(抗α-actinin抗體，1∶100稀釋)4 ℃孵育過夜，PBS清洗3次；加入II抗(1∶500稀釋)37 ℃避光孵育60 min，PBS清洗3次；滴加DAPI復(fù)染核，避光孵育5 min，PBS清洗3次后晾干用抗熒光淬滅封片劑封片，置于熒光顯微鏡下觀察。

2.3流式細胞術(shù)檢測心肌細胞凋亡水平 用0.25%不含EDTA的胰酶消化收集各組細胞后，預(yù)冷PBS洗滌2次，binding buffer重懸細胞，加入 annexin V-FITC及PI各2.5 μL混勻細胞，檢測前5 min再加入binding buffer，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率，F(xiàn)lowJo軟件分析數(shù)據(jù)。

2.4qPCR 檢測心肌細胞TRIM8、Nrf2、谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基(glutamate-cysteine ligase catalytic subunit, GCLC)、血紅素加氧酶(heme oxyge-nase-1, HO-1)和NAD(P)H:醌氧化還原酶1 [NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1, NQO-1]的mRNA表達水平 采用TRIzol提取細胞的總RNA，再反轉(zhuǎn)錄為cDNA，qPCR擴增(引物序列見表1)，GADPH為內(nèi)參照，采用 2-ΔΔCt法計算目的基因的mRNA表達量。

表1 qPCR引物序列Table1. ThesequencesoftheprimersforqPCR

2.5Western blot檢測心肌細胞TRIM8及Nrf2的含量 取40 μg各組蛋白樣品，用SDS-PAGE分離，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，于5%牛血清白蛋白中室溫封閉1 h;再用抗TRIM8抗體(1∶500)、抗Nrf2抗體(1∶1 000)和抗GAPDH抗體(1∶5 000)孵育，于4 ℃過夜;洗膜后再用 II 抗孵育(37 ℃，1 h)，再次洗膜后發(fā)光并使用ImageJ軟件分析結(jié)果。目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參照蛋白灰度值。

2.6心肌細胞轉(zhuǎn)染 細胞培養(yǎng)以Lipofectamine 2000作為轉(zhuǎn)染試劑按50 nmol/L濃度進行TRIM8-siRNA轉(zhuǎn)染，每組設(shè)3個復(fù)孔，其中control組給予Lipofectamine 2000處理，TRIM8-siRNA組給予Lipofectamine 2000+TRIM8-siRNA處理，Scra-siRNA組給予Lipofectamine 2000+Scra-siRNA處理。轉(zhuǎn)染24 h后檢測細胞TRIM8 mRNA表達，48 h后檢測TRIM8蛋白表達以明確敲減效率。轉(zhuǎn)染48 h后給予33 mmol/L葡萄糖及300 μmol/L軟脂酸鈉繼續(xù)干預(yù)18 h并檢測MCMs的凋亡率、Nrf2表達水平及活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的水平。

2.7DHE染色實驗 將DHE熒光探針按5 μmol/L濃度用培養(yǎng)基稀釋后加入到各組細胞培養(yǎng)皿中，每組重復(fù)3孔，37 ℃避光孵育30 min，PBS清洗3次，采用激光共聚焦顯微鏡檢測DHE熒光水平并拍照。

2.8ML385配制 將ML385溶于100%DMSO中制備儲備溶液，接著用PBS稀釋成5% DMSO溶液再使用。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 高糖高脂增加MCMs的凋亡及ROS水平

用α-actinin免疫熒光鑒定小鼠心肌細胞,見圖1。經(jīng)流式細胞術(shù)檢測MCMs的凋亡率，DHE染色法及流式細胞術(shù)檢測MCMs中ROS的含量，結(jié)果顯示在HGHF環(huán)境中，MCMs的凋亡率及ROS水平增加(P<0.05),見圖2、3。上述結(jié)果表明HGHF能增加MCMs的凋亡，氧化應(yīng)激反應(yīng)增強是HGHF致MCMs損傷的原因之一。

Figure 1. The identification of mouse cardiomyocytes. The scale bar=50 μm.
圖1 小鼠心肌細胞的鑒定

Figure 2. The effect of HGHF on the apoptosis of the MCMs 18 h after intervention was detected by flow cytometry. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNG group.
圖2 流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡率

Figure 3. The effect of HGHF on the ROS production in the MCMs was detected by DHE staining (×400) and flow cytometry. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNG group.
圖3 流式細胞術(shù)檢測各組細胞ROS的生成

2 高糖高脂增加MCMs中TRIM8的表達水平

qPCR及Western blot檢測MCMs中TRIM8的表達水平，結(jié)果顯示在單獨HG及HF的作用下，MCMs中TRIM8的表達增加，HG合并HF可進一步增加TRIM8的表達，其表達量隨著干預(yù)時間的延長而增加(P<0.05)，見圖4、5。

Figure 4. The expression of TRIM8 in the MCMs exposed to HGHF. A: the mRNA expression of TRIM8 was detected by qPCR; B: the results of Western blot for determining the protein expression of TRIM8. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNG group;#P<0.05vsHG group;△P<0.05vsHF group.
圖4 HGHF對各組細胞TRIM8 mRNA和蛋白表達的影響

Figure 5. The expression of TRIM8 in the MCMs exposed to HGHF for different time. A: the mRNA expression of TRIM8 was detected by qPCR; B: the results of Western blot for determining the protein expression of TRIM8. Mean±SD.n=6.*P<0.05vs0 h group;#P<0.05vs6 h group;△P<0.05vs12 h group.
圖5 HGHF對各組細胞TRIM8 mRNA和蛋白表達的影響

3 敲減TRIM8的表達減輕MCMs的凋亡并降低ROS水平

采用siRNA敲減MCMs中TRIM8的表達，通過qPCR及Western blot檢測對TRIM8的沉默效率，結(jié)果表明TRIM8 siRNA成功抑制了TRIM8在MCMs中的表達水平(P<0.05)，見圖6。經(jīng)流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率，DHE染色法及流式細胞術(shù)檢測MCMs中ROS的含量，結(jié)果表明TRIM8 siRNA/HGHF組MCMs的凋亡率及ROS水平明顯降低(P<0.05)，見圖7。

Figure 6. The effects ofTRIM8expression knock-down on the expression of TRIM8 at mRNA and protein levels in the MCMs with or without HGHF exposure. A: the mRNA expression of TRIM8 in the MCMs after siRNA transfection for determining the knock-down efficiency; B and C: the effects ofTRIM8expression knock-down on the expression of TRIM8 at mRNA and protein levels in the MCMs exposed to HGHF. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsScra-siRNA group;△P<0.05vsScra-siRNA/PBS group;▲P<0.05vsScra-siRNA/HGHF group.
圖6 敲減TRIM8在MCMs中的效率驗證和對HGHF作用的影響

Figure 7. Knock-down ofTRIM8expression attenuated the apoptosis and ROS production in the MCMs exposed to HGHF. A: the results of flow cytometry for analyzing the apoptosis of the MCMs exposed to HGHF 18 h after intervention; B: the results of DHE staining (×400) and flow cytometry for analyzing the ROS production in MCMs. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsScra-siRNA/PBS group;#P<0.05vsScra-siRNA/HGHF group.
圖7 敲減TRIM8表達減輕MCMs凋亡并降低ROS水平

4 高糖高脂減少MCMs中Nrf2的表達水平

Western blot檢測MCMs中Nrf2的蛋白表達水平，qPCR檢測Nrf2及其下游基因GCLC、HO-1和NQO-1的表達水平，結(jié)果表明在HGHF作用下，MCMs中的Nrf2及其下游基因GCLC、HO-1和NQO-1的表達降低(P<0.05)，見圖8、9。

Figure 8. The effect of HGHF on the expression of Nrf2 in the MCMs. A: the mRNA expression detected by qPCR; B: the protein expression determined by Western blot. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs NG group.圖8 qPCR和Western blot檢測HGHF 對MCMs Nrf2蛋白表達的影響

Figure 9. The effect of HGHF on the mRNA expression of the down-stream molecules of Nrf2 signalling pathway was detected by qPCR. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNG group.
圖9 qPCR檢測MCMs內(nèi)Nrf2信號通路下游分子mRNA的表達

5 敲減TRIM8的表達增加MCMs中Nrf2的表達水平

敲減TRIM8的表達水平后，qPCR及Western blot檢測MCMs中Nrf2的表達水平，結(jié)果顯示TRIM8-siRNA/HGHF組的Nrf2表達水平升高(P<0.05)，Nrf2下游基因GCLC、HO-1和NQO-1表達亦增加(P<0.05)，表明TRIM8可影響Nrf2抗氧化通路及其下游基因GCLC、HO-1和NQO-1的表達，見圖10、11。

Figure 10. The efects ofTRIM8expression knock-down on the expression of Nrf2 at mRNA and protein levels in the MCMs with or without HGHF exposure. A: the mRNA expression was detected by qPCR; B: the protein expression determined by Western blot. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsScra-siRNA/PBS groups;#P<0.05vsScra-siRNA/HGHF group.
圖10 敲減TRIM8對Nrf2在MCMs中表達和對HGHF作用的影響

Figure 11. The effects ofTRIM8expression knock-down on the mRNA expression of the down-stream molecules of Nrf2 signalling pathway in the MCMs with or without HGHF exposure were detected by qPCR. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsScra-siRNA/PBS group;#P<0.05vsScra-siRNA/HGHF group.
圖11 敲減TRIM8表達對MCMs在HGHF條件下Nrf2信號通路下游分子mRNA表達的影響

6 Nrf2抑制劑ML385部分逆轉(zhuǎn)敲減TRIM8減輕MCMs損傷的作用

在敲減TRIM8表達的同時予以Nrf2特異性抑制劑ML385干預(yù)MCMs，qPCR結(jié)果顯示，在HGHF作用下，同樣轉(zhuǎn)染TRIM8-siRNA的細胞，用Nrf2特異性抑制劑ML385(4 μmol/L)干預(yù)18 h后，MCMs中的抗氧化分子Nrf2、GCLC、HO-1及NQO-1的表達減少(P<0.05)，見圖12。流式細胞術(shù)及DHE檢測結(jié)果顯示，MCMs中的ROS及細胞凋亡水平增加(P<0.05)，見圖13。這些結(jié)果表明 TRIM8通過抑制Nrf2的表達激活氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進高糖高脂誘導(dǎo)的MCMs凋亡。

Figure 12. The effects of Nrf2 specific inhibitor ML385 andTRIM8expression knock-down on the mRNA expression of the down-stream molecules of Nrf2 signalling pathway in the MCMs with HGHF exposure detected by qPCR. Ts： TRIM8-siRNA. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsHGHF/DMSO group;#P<0.05vsHGHF+Ts/DMSO group.
圖12 Nrf2特異性抑制劑ML385和敲減TRIM8表達對MCMs在HGHF條件下Nrf2信號通路下游分子mRNA表達的影響

Figure 13. The effects of Nrf2 specific inhibitor ML385 andTRIM8expression knock-down on the ROS production and apoptosis of MCMs with HGHF exposure. A: DHE staining (×400) and flow cytometry for evaluating the ROS production; B: flow cytometry was used for analyzing the cell apoptosis. Mean±SD.n=6. Ts： TRIM8-siRNA.*P<0.05vsHGHF/DMSO group;#P<0.05vsHGHF+Ts/DMSO group.
圖13 Nrf2特異性抑制劑ML385和敲減TRIM8表達對MCMs在HGHF條件下ROS生成和細胞凋亡的影響

討 論

DCM是一種獨立于高血壓和冠心病的特異性心肌病，與糖尿病患者心力衰竭的高發(fā)生率和死亡率密切相關(guān)，且嚴重影響患者的生活質(zhì)量。現(xiàn)有研究表明，DCM可能與糖脂代謝異常[7]、炎癥反應(yīng)[8]和氧化應(yīng)激[9]等多種因素相關(guān)，有學(xué)者認為氧化應(yīng)激可能在DCM發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵性作用[10]，在糖尿病合并高脂血癥患者中，高糖、高游離脂肪酸將導(dǎo)致心肌細胞內(nèi)線粒體過氧化產(chǎn)物的堆積，從而導(dǎo)致細胞內(nèi)ROS的增加，ROS的異常增加可以通過誘導(dǎo)心肌細胞凋亡，最終出現(xiàn)DCM的心臟功能及結(jié)構(gòu)異常。在本研究中，我們采用HGHF培養(yǎng)MCMs來模擬糖尿病合并高脂環(huán)境，并檢測心肌細胞凋亡率及ROS水平，結(jié)果顯示在高糖合并高脂環(huán)境中，心肌細胞凋亡率及ROS水平增加，這與文獻報道一致[11-12]。

近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，TRIM8能夠與多種底物相互作用，調(diào)節(jié)先天免疫、病毒反應(yīng)和炎癥等病理過程[13-15]。Yan等[4]發(fā)現(xiàn)，TRIM8能夠通過激活脂代謝、胰島素抵抗和炎癥反應(yīng)等途徑介導(dǎo)肝硬化的發(fā)生發(fā)展；而在心血管方面，Chen等[6]發(fā)現(xiàn)，TRIM8能夠通過激活心肌細胞的代謝異常、胰島素抵抗及炎癥等途徑加重心肌肥厚及心肌纖維化，以上研究證明TRIM8可能在DCM的發(fā)病過程中起作用，但目前暫無相關(guān)報道。在本研究中，用HG和HF分別干預(yù)MCMs后，TRIM8的表達明顯升高，而在HG合并HF的作用下，TRIM8的表達水平進一步升高，其表達量隨著干預(yù)時間的延長而增加，為了進一步探索TRIM8在DCM中的作用，我們給予心肌細胞特異性siRNA 來降低MCMs的TRIM8水平，結(jié)果顯示，降低TRIM8的表達能夠減輕MCMs的凋亡及 ROS 的生成。

既往有文獻報道，Nrf2所介導(dǎo)的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)通路是細胞內(nèi)最主要的抵御氧化應(yīng)激產(chǎn)生的細胞毒性作用的途徑，當(dāng)激活Nrf2后, 將啟動其下游GCLC、HO-1和NQO-1基因的轉(zhuǎn)錄及高效表達, 從而減輕ROS的產(chǎn)生，保護機體免受氧化應(yīng)激的損傷[16-19]。在本研究中，我們觀察到HGHF干預(yù)后，MCMs中抗氧化分子Nrf2及其下游基因GCLC、HO-1和NQO-1的表達降低。既往研究發(fā)現(xiàn)，在病理情況下，TRIM8能夠通過Nrf2相關(guān)信號通路調(diào)節(jié)組織內(nèi)氧化應(yīng)激水平[20]，所以我們推測TRIM8介導(dǎo)高糖高脂誘導(dǎo)心肌細胞凋亡的作用可能是通過調(diào)節(jié)Nrf2抗氧化通路產(chǎn)生的。本實驗發(fā)現(xiàn)降低TRIM8的表達能夠增加MCMs中Nrf2及其下游基因GCLC、HO-1和NQO-1的表達，為了進一步明確此機制，我們給予Nrf2特異性抑制劑ML385抑制Nrf2的表達，結(jié)果顯示ML385可降低細胞內(nèi)Nrf2及其下游基因GCLC、HO-1和NQO-1的表達，升高ROS的含量，逆轉(zhuǎn)了敲減TRIM8表達減輕HGHF誘導(dǎo)MCMs凋亡的作用。上述結(jié)果表明TRIM8能夠通過抑制Nrf2通路的表達激活氧化應(yīng)激反應(yīng)增加高糖高脂誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡。有文獻報道，TRIM8是TNF-α和IL-1β介導(dǎo)的NF-κB活性的關(guān)鍵調(diào)控分子[4, 6, 20]，在DCM中，體內(nèi)高血糖與蛋白質(zhì)產(chǎn)生非酶糖化反應(yīng)生成糖基化終產(chǎn)物，糖基化終產(chǎn)物修飾的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)與心肌細胞表面的受體結(jié)合，使NF-κB表達增加，從而激活炎癥途徑，導(dǎo)致抗氧化分子減少以及大量的ROS產(chǎn)生，進而誘導(dǎo)細胞凋亡[21-22]。綜合之前的報道，我們推測在高糖高脂環(huán)境中，TRIM8可能通過激活NF-κB炎癥通路導(dǎo)致Nrf2抗氧化分子減少，從而使心肌細胞氧化應(yīng)激水平增加，最終引起心肌細胞凋亡，故仍需在下一步實驗中明確TRIM8影響細胞內(nèi)Nrf2通路及其氧化應(yīng)激的具體機制。

綜上所述，TRIM8通過抑制Nrf2通路的表達激活氧化應(yīng)激反應(yīng)增加高糖高脂誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡。這為糖尿病患者心血管方面的防護提供了新的理論基礎(chǔ)，有利于開發(fā)新的干預(yù)靶點和治療措施。