羊傳染性胸膜肺炎與羊口瘡混合感染的診斷與分析

趙潔雅 沙吾爾江·阿不都力艾拉 郭會玲 古麗·巴哈吾拉音 汪陽 木克日木 古麗扎提 梁紀元 陳世軍 夏俊 薛晶 金映紅

摘? ? 要：為探明新疆某羊場疑似羊口瘡和羊胸膜肺炎感染死亡羊只的病原，本試驗在無菌條件下對送檢肺臟病料進行細菌培養(yǎng)，并用支原體引物進行PCR擴增，后利用羔羊睪丸細胞對處理后的唇部痂皮病料進行毒株分離，分離到的毒株用羊口瘡特異性引物進行PCR擴增和動物回歸試驗。結果顯示，根據(jù)細菌培養(yǎng)和PCR擴增判斷死亡羊只的傳染性胸膜肺炎陽性，用羊睪丸細胞成功分離到的毒株經(jīng)PCR驗證顯示羊口瘡陽性，通過動物回歸試驗羊口瘡攻毒組羊只出現(xiàn)口唇部膿皰痂皮等羊口瘡典型病變，綜合說明死亡羊只為傳染性胸膜肺炎和羊口瘡病原混合感染。本試驗成功分離到一株羊口瘡毒株且該毒株有較強的致病性，為今后進一步研制羊口瘡疫苗打下了良好的基礎。

關鍵詞：羊;傳染性胸膜肺炎;口瘡病毒;鑒定

中圖分類號：S858.26? ? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2020.12.019

Diagnosis and Analysis of Mixed Infection of Infectious Pleuropneumonia and Aphthous Sore in Sheep

ZHAO Jieya1， SHAJIANG·Abduli Ella2， GUO Huiling3， GURI·Bahawula Yin4， WANG Yang1， MUKE Rimu3， GURI Zati3， LIANG Jian1， CHEN Shijun3， XIA Jun3， XUE Jin3， JIN Yinghong3

（1.College of Animal Madicine， Xinjiang Agricultural University， Urumqi 830000，China; 2. Xinjiang Animal Health Supervision Institute， Urumqi， Xinjiang 830000， China; 3.Institute of Veterinary Science， Xinjiang Academy of Animal Science， Urumqi 830000，China; 4. Yanqi County Beidaqu Township Animal Husbandry and Veterinary Station， Yanqi， Xinjiang 841100， China）

Abstract：To find out the pathogen of dead sheep infected with sheep aphthous ulcer and pleuropneumonia in a sheep farm in Xinjiang， the bacteria culture was performed on the samples of pulmonary diseases under aseptic conditions; the PCR amplification was performed with Mycoplasma primers of sheep; the strains were isolated from the crusts of the diseased lips with the sheep testicular cells， and the PCR amplification were performed with the specific primers for sheep sores; the animal regression test were performed to judge the virulence of the sheep oral sore virus strain. According to the results of the bacterial culture and PCR amplification indicated that the sheep infected sheep infectious pleuropneumonia. The virus strain was successfully isolated with sheep testis cells， and the results of PCR showed that the sheep infected ORFV. The animal regression experiment showed that the? typical lesions of sheep's mouth sores such as lip pustular scab skin appeared in the poisonous group， indicating that the strain had strong pathogenicity. Comprehensively， the dead sheep were mixed infection of sheep infectious pleuropneumonia and sheep's mouth sore pathogen. This experiment successfully isolated a strain of sheep's mouth sore and the strain had strong pathogenicity， which laid a good foundation for further development of sheep's mouth sore vaccine in the future.

Key words： sheep; infectious pleuropneumonia; oral sore virus; identification

支原體是目前已知的缺乏細胞壁但能獨立生活的最小原核微生物[1]，該病原微生物于1963年在英格蘭首次由Mackey等[2]從綿羊體內(nèi)分離到，后來在其他國家和地區(qū)均有出現(xiàn)該病的報道[3]，發(fā)病羊表現(xiàn)在肺臟和胸膜出現(xiàn)漿液性狀和纖維素性狀的炎癥。該病發(fā)病率較高、發(fā)病速度較快且流行范圍廣泛，死亡率極高，給養(yǎng)羊業(yè)造成巨大的危害。羊口瘡又稱為羊傳染性膿皰、羊接觸傳染性膿皰皮炎，是由羊口瘡病毒（ORFV）引起的一種主要感染綿羊和山羊等小反芻獸的高度接觸性傳染病[4]。羊口瘡病毒屬于痘病毒科副痘病毒屬，一般呈橢圓形、球形、錐形等，ORFV基因組全長約140 kb，羊口瘡病毒的編碼區(qū)又分為中心保守區(qū)和末端變異區(qū)，中心保守區(qū)是病毒完成復制和形成病毒粒子所必需的區(qū)域，兩側非必須的末端變異區(qū)主要為病毒的毒力基因，與病毒的致病性密切相關[5-6]。幼齡動物對該病敏感，發(fā)病率較高但致死率不高;而成年羊患羊口瘡病后由于口唇部病變導致無法正常進食，影響羊只生長;此外，人在與患病動物頻繁接觸時也有被感染的可能[7]。羊口瘡最早被發(fā)現(xiàn)于歐洲，現(xiàn)已分布于全世界[8]，其傳染性強、傳播速度快，據(jù)報道我國主要養(yǎng)羊地區(qū)如新疆、甘肅、青海、內(nèi)蒙古及東北三省均有該病發(fā)生和流行[9-14]。

2019年1月，新疆某羊場部分羊只出現(xiàn)羊口唇部丘疹、潰瘍、痂皮和呼吸道的癥狀，初步懷疑為羊口瘡和支原體的混合感染，故以死亡羊肺組織及口唇部痂皮為材料，通過細菌培養(yǎng)和PCR方法對相關病癥和病毒進行診斷與鑒定，旨在為新疆羊傳染性胸膜肺炎和羊口瘡混合感染的流行病學調(diào)查及防控提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病料采集與主要試劑

病料采自新疆某羊場發(fā)病死亡羊只。T4連接酶購自NEB公司;pMD-18T載體購自寶生物工程（大連）有限公司;E. coli感受態(tài)細胞DH5a由新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所（新疆畜牧科學院動物臨床醫(yī)學研究中心）提供;克隆載體pGEM-T購自Promega公司;ExTaq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶EcoR I、DNA膠回收試劑盒、質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖?、LB培養(yǎng)基、BHI培養(yǎng)基、DNA Marker DL2000均購自寶生物工程（大連）有限公司;MEM細胞培養(yǎng)液、血清購自Hyclone公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 實驗室診斷

1.2.1 細菌培養(yǎng) 在無菌條件下，取死亡羊只肺和肝組織涂片，接種于普通LB培養(yǎng)平板和BHI培養(yǎng)平板，置37 ℃培養(yǎng)14 h，觀察是否有細菌生長。

1.2.2 支原體鑒定 參照綿羊傳染性胸膜肺炎基因的保守序列，用生物軟件DNAstar分別設計支原體目和綿羊支原體兩種引物，擴增片段長度分別為380 bp和600 bp。PCR擴增體系（50 μL）：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，上下游引物各2 μL，模板DNA 2 μL，超純水19 μL，混合均勻后PCR擴增。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30個循環(huán);72 ℃延伸10 min。反應結束后，上樣1%瓊脂糖凝膠電泳。瓊脂凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，送上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.3 羊口瘡鑒定 （1）病料處理。將送檢的口唇部痂皮組織病料按15%（w/v）比例加入PBS（青霉素終濃度100 U·mL-1，鏈霉素終濃度100 μg·mL-1）進行充分研磨后，以10 000 r·min-1，離心5 min，取上清，經(jīng)0.22 μm濾器過濾。

（2）分離病毒株。取研磨后的病料上清液1 mL接種于生長良好的羊睪丸細胞，37 ℃吸附1 h，吸附完成后棄上清液更換完全培養(yǎng)基，于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2細胞培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，每天觀察細胞，細胞出現(xiàn)病變效應（CPE），反復凍融3次，12 000 r·min-1離心10 min，將上清1 mL接種到新的細胞中，連續(xù)盲傳4代，直到細胞出現(xiàn)明顯CPE，將病毒液置-20 ℃/室溫（15～25 ℃）凍融3次，以10 000 r·min-1，離心5 min，取上清，經(jīng)0.22μm濾器過濾，即為分離到的毒株。

（3）PCR鑒定。按照DNA提取試劑盒說明書操作，從分離到的病毒中提取DNA。用生物軟件DNAstar 設計羊口瘡引物，引物序列F：5-CGAACTTCCACCTCAACCACTCC-3，R：5-CCTT

GACGATGTCGCCCTTCT-3，以提取的病毒基因組DNA為模板擴增目的片段，擴增片段長度約為510 bp，PCR擴增反應體系（50 μL）：2 ×Taq PCR Master Mix25 μL，上下游引物各2 μL，DNA模板2 μL，ddH2O水補至50 μL，混合均勻后PCR擴增。反應條件：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物上樣1%瓊脂糖凝膠跑電泳，參照標準DL2000 DNA Marker。用瓊脂凝膠回收試劑盒將PCR產(chǎn)物回收，送上海生工生物工程有限公司測序。

1.3 動物回歸試驗

將4只羔羊分為2組，分別為攻毒組和對照組。攻毒組劃井字接種200 μL分離出的羊口瘡毒株，對照組以相同方式和劑量接種無菌PBS。攻毒后每天觀察各組羔羊的臨床癥狀并記錄，觀察試驗組出現(xiàn)丘疹和潰爛的時間、病變范圍大小、預后等，連續(xù)觀察7 d，來判斷初步分離到的羊口瘡病毒株致病力強弱。

2 結果與分析

2.1 細菌培養(yǎng)結果

病料于普通LB培養(yǎng)平板和BHI培養(yǎng)平板涂板培養(yǎng)后，平板中未未觀察到菌落，說明病變不是由于細菌感染引起。

2.2 支原體鑒定結果

瓊脂糖凝膠電泳結果（圖1）顯示，在600 bp和380 bp處均出現(xiàn)明亮條帶，與預期相符，說明死亡羊只感染了支原體。

2.3 羊口瘡鑒定結果

2.3.1 毒株分離結果 病料經(jīng)處理后接種細胞，接種16 h后細胞開始出現(xiàn)羊口瘡病毒的病變，表現(xiàn)為細胞出現(xiàn)網(wǎng)格狀且呈變圓固縮趨勢（圖2），說明分離到的毒株為羊口瘡病毒。

2.3.2 羊口瘡分離株PCR結果 瓊脂糖凝膠電泳結果（圖3）顯示，在510 bp出現(xiàn)明亮條帶，與預期相符，說明分離到的病毒株為羊口瘡病毒。

2.4 動物回歸試驗

臨床觀察結果（圖4）為攻毒組兩只綿羊在攻毒后48 h即可觀察到口唇部出現(xiàn)丘疹，后有膿皰破潰形成結痂，無死亡羊只，而對照組正常。

3 結論與討論

羊口瘡和羊傳染性胸膜肺炎是重要的人畜共患病，傳播速度快，波及范圍廣，嚴重危害養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展和人類的健康。羊口瘡病不會造成很高的死亡率，但是發(fā)病期間會嚴重影響到羊只的生長發(fā)育，導致飼養(yǎng)者增加經(jīng)濟投入，造成較高的經(jīng)濟損失。疫苗免疫是預防和控制羊口瘡的最有效的手段，但是近年來有羊場采用弱毒活疫苗免疫羊只后不能起到有效保護作用的報道[15-16]，可能是毒株在不同地區(qū)發(fā)生了遺傳變異?；佳騻魅拘孕啬し窝椎难虻男啬ず头闻K會出現(xiàn)炎癥，類似纖維素性狀和漿液性狀，死亡率極高。近來年，羊群的飼養(yǎng)模式更加規(guī)?；图s化，羊的傳染性胸膜炎在羊群中流行會對養(yǎng)羊業(yè)的經(jīng)濟效益造成嚴重的損害。若要有效防止此病的發(fā)生，必須要讓綿羊傳染性胸膜肺炎的診斷方式和防治手段都得到提升，以最快的速度掌握病情，同時采取積極有效的隔離措施，避免羊只相互傳染，造成更大的經(jīng)濟損失。

本研究于新疆某羊場對疑似傳染性胸膜肺炎和羊口瘡的綿羊進行病情和癥狀跟蹤記錄，對死亡羊只進行剖檢、病原鑒定、實驗室診斷和病原分離。根據(jù)肺部病變情況初步懷疑為巴氏桿菌或羊傳染性胸膜肺炎感染。為確診和鑒別病原微生物，本試驗通過對16S RNA保守區(qū)的基因擴增，判定此次病原為綿羊肺炎支原體。該方法較細菌涂片染色后形態(tài)學觀察、生化試驗、動物試驗等更加快速、準確，為綿羊肺炎支原體感染的診斷提供參考。同時，發(fā)病羊只具備口唇部水皰、結痂等羊口瘡的典型病變，為確定并分離到病原，本研究通過處理口唇部痂皮后接種于羊睪丸細胞，以細胞培養(yǎng)產(chǎn)物為模板，擴增該分離株的保守基因片段，該病毒株在羊睪丸細胞上傳第5代時出現(xiàn)明顯的病變，PCR擴增結果出現(xiàn)與預期大小一致的條帶，表明成功分離到一株ORFV。將羊口瘡病毒株接種于羔羊口唇部，兩天后羔羊唇部出現(xiàn)明顯病變，證實此次分離出的羊口瘡病毒致病力較強，為今后進一步研制羊口瘡疫苗打下了良好的基礎，進而為該病的防控提供保障。

綜合臨床癥狀、病理變化、實驗室診斷結果確診此次發(fā)病羊只病原為綿羊傳染性胸膜肺炎和羊口瘡病毒混合感染，結合試驗過程和疾病的特征，建議選用高敏藥物或中敏藥物進行臨床治療，避免濫用抗生素導致病原微生物對大量藥物產(chǎn)生耐藥性。

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