感應(yīng)草石油醚部位的ＧＣ－ＭＳ分析及其體外生物活性研究

廖彭瑩 吳家明 曾維錦 李務(wù)榮 廖秋麗 王淼蘭 羅彭 潘為高

【摘 要】 目的：研究感應(yīng)草石油醚部位的化學(xué)組成及其對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶和二肽基肽酶-4（DPP-IV）的抑制作用。方法：運用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用儀分析鑒定石油醚部位及甲酯化產(chǎn)物的化學(xué)組成，采用酶標板法測定體外抑制作用。結(jié)果：從感應(yīng)草石油醚部位中檢出7種成分，從甲酯化產(chǎn)物中檢出6種成分，其對α-葡萄糖苷酶的抑制作用較好，對α-淀粉酶和DPP-IV的抑制效果均較弱。結(jié)論：感應(yīng)草石油醚部位的主要成分是脂肪族類，其對α-葡萄糖苷酶有較好抑制作用，發(fā)揮作用的主要成分是脂肪酸。

【關(guān)鍵詞】 感應(yīng)草;石油醚部位;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）;體外生物活性

【中圖分類號】R284.1?? 【文獻標志碼】A??? 【文章編號】1007-8517（2020）21-0035-05

GC-MS analysis of the Petroleum Ether Extracts from Biophytum

sensitivum and the Evaluation of the Biological Activities in vitro

LIAO Pengying1，2 WU Jiaming1 ZENG Weijin1 LI Wurong1 LIAO Qiuli1 WANG Miaolan1 LUO Peng1，2 PAN Weigao1，2

Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530200，China

Abstract：Objectives To study the chemical composition of the petroleum ether part of Biophytum sensitivum and the inhibitory activities against α-glucosidase，α-amylase and dipeptidyl peptidase-4 （DPP-IV）.Methods The main chemical components of petroleum ether part and its methylated products were analyzed and identified by gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）.The inhibitory activities were measured by enzyme plate method. Results Seven components were identified from the petroleum ether part，and six components were identified from its methylated products.The petroleum ether part showed inhibitory activity against α-glucosidase，but weak inhibitory activities against α-amylase and DPP-IV.Conclusions The main component of the petroleum ether part of Biophytum sensitivum is fatty group，and showed inhibitory activity against α-glucosidase.The main active component was fatty acid.

Keywords：Biophytum sensitivum; Petroleum Ether Extracts;Gas Chromatography-mass Spectrometry （GC-MS）; Biological Activities in Vitro

酢漿草科植物感應(yīng)草Biophytum sensitivum（L.）DC.又名羞禮草、羅傘草、降落傘等，主要分布于臺灣、廣東、海南、廣西、貴州、云南等地，具有化痰定喘、消積利水的功效，用于哮喘、小兒疳積、水腫、淋濁等證[1]，壯醫(yī)記載其可“調(diào)谷道、通水道”，主治哢疳（小兒疳積）、笨?。ㄋ[）等[2]。在印度阿育吠陀醫(yī)療體系中，該植物用作補品、興奮劑、用于治療胃痛、糖尿病和哮喘等[3]。現(xiàn)代研究表明，感應(yīng)草有多方面生理活性，包括抗氧化、抗炎、抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗疲勞等[3]。

α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase，EC 3.2.1.20）、α-淀粉酶和二肽基肽酶-IV（dipeptidyl peptidase IV，DPP-IV）均為人體內(nèi)重要的糖代謝相關(guān)酶。α-葡萄糖苷酶位于人體小腸刷狀緣膜上皮細胞，能夠水解低聚糖釋放出葡萄糖，α-葡萄糖苷酶抑制劑可以延緩腸道內(nèi)碳水化合物的吸收，有效控制餐后血糖水平，在預(yù)防改善糖尿病大血管并發(fā)癥方面具有重要作用[4- 5]。淀粉酶是分解淀粉和多糖的酶，人體內(nèi)以α-型為主[6]，α-淀粉酶抑制劑通過抑制腸道內(nèi)唾液和胰淀粉酶的活性，阻礙食物中多糖的水解和消化，減少糖分攝取[7]。DPP-IV可以降解體內(nèi)胰高血糖素樣肽-1和葡萄糖依賴性促胰島素多肽，二者在維持血糖穩(wěn)定方面均發(fā)揮重要作用[8- 9]，DPP-IV抑制劑通過增強二者活性，刺激胰島β細胞再生，提高糖耐量及胰島素敏感性以有效降低血糖[10]。天然植物資源是人們挖掘醫(yī)藥財富的寶庫，類型豐富的二次代謝產(chǎn)物蘊藏著許多潛在藥用活性成分，研究人員對藥用植物提取物進行篩選分離，已經(jīng)獲得大量能夠抑制三種糖代謝相關(guān)酶的活性組分[11-13]。研究表明，感應(yīng)草莖的乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶具有良好的體外抑制活性[14]，在動物實驗中感應(yīng)草葉水提取物和整株水提取物、甲醇提取物則均表現(xiàn)出降糖作用[15-17]。

為了系統(tǒng)深入挖掘感應(yīng)草的藥用價值，分析其降糖作用機理，本實驗在已有研究基礎(chǔ)上，對感應(yīng)草的低極性組分進行提取分析鑒定，研究其對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶和DPP-IV的體外抑制效果，探討感應(yīng)草低極性組分的化學(xué)組成及對三種糖代謝相關(guān)酶的作用效果。

1 材料與方法

1.1 儀器 電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent 8890/5977B）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52AA（上海亞榮生化儀器廠）、DHJF-2005型低溫恒溫攪拌反應(yīng)浴（武漢亨泰達儀器設(shè)備有限公司）、SHZ-D（III）循環(huán)水式多用真空泵（河南省予華儀器有限公司）、HWS-26 型電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）、KQ-500DA型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、酶標儀（美國Dynex Spectra MR）、721紫外可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）、96孔板（美國True line）、微量移液器（德國Eppendoff公司）、Flex Station 3多功能酶標儀工作站（美國Molecular Devices公司）、DPP-IV抑制活性檢測試劑盒（美國Cayman Chemical公司）。

1.2 材料 感應(yīng)草于2019年4月采于廣西武鳴，經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)李國棟教授鑒定為酢漿草科感應(yīng)草屬植物感應(yīng)草（Biophytum sensitivum）的全株，干燥。

石油醚、無水硫酸鈉、無水碳酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、二甲基亞砜（DMSO）均為分析純（國藥集團化學(xué)試劑有限公司），α-葡萄糖苷酶（α-Glucosidase）、4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）（Sigma-Aldrich公司），阿卡波糖（acarbose）（阿拉丁生化科技股份有限公司），α-淀粉酶（α-amylase）、3，5-二硝基水楊酸（DNS）（上海麥克林生化科技有限公司），可溶性淀粉（廣東光華科技股份有限公司），超純水（南京易普易達科技發(fā)展有限公司）。

1.3 石油醚提取物的制備 將感應(yīng)草藥材10 Kg粉碎，用200 L石油醚冷浸提取，提取2次，每次72 h，將提取液過濾，減壓濃縮，得到石油醚提取物70 g。

1.4 氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）分析條件

1.4.1 樣品處理 稱取感應(yīng)草石油醚提取物10 mg，用5 mL乙醚充分溶解，靜置，取上清液，加入適量無水硫酸鈉，靜置過夜，離心10 min，取上清液用微孔濾膜過濾，進樣分析。

稱取感應(yīng)草石油醚提取物約200 mg，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入20 mL石油醚-正己烷（1∶1，V∶V）溶劑使之溶解，再加入0.4 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液10 mL，振蕩搖勻，40 ℃水浴加熱30 min，再加入蒸餾水20 mL，振搖，靜置分層，取上層揮干溶劑后，加乙醚溶解、過濾、濃縮，加無水硫酸鈉干燥過夜，取上清液用微孔濾膜過濾，進樣分析。

1.4.2 氣相色譜分析條件 石油醚提取物分析條件：HP-5MS石英毛細管柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）;載氣為高純氦氣;進樣量1 μL;分流比為30∶1;程序升溫條件：柱溫100 ℃，溶劑延遲3 min，以10 ℃/min升溫至150 ℃，維持2 min，再以10 ℃/min升溫至200 ℃，維持2 min，再以6 ℃/min升溫至280 ℃，維持2 min。

石油醚提取物甲酯化產(chǎn)物分析條件：HP-5MS石英毛細管柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）;載氣為高純氦氣;進樣量1 μL;分流比為30∶1;程序升溫條件：柱溫100 ℃，溶劑延遲3 min，以10 ℃/min升溫至150 ℃，維持2 min，再以10 ℃/min升溫至200 ℃，維持2 min，再以10 ℃/min升溫至280 ℃，維持2 min。

1.4.3 質(zhì)譜分析條件 電離方式EI，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，接口溫度280 ℃，質(zhì)量范圍50～400 amu。

1.5 對三種糖代謝相關(guān)酶體外抑制活性評價

1.5.1 α-葡萄糖苷酶體外抑制活性評價[7，14]?? 以pH 6.8濃度為0.1 mol/L的磷酸緩沖液（PBS）作為反應(yīng)溶液，將樣品配成濃度為625、313、156、78、39 μg/mL的溶液。在酶標板上設(shè)樣品反應(yīng)孔（A）、樣品對照孔（B）、空白反應(yīng)孔（C）及空白對照孔（D），每組設(shè)3個重復(fù)孔。在A、B孔中均加入50 μL樣品溶液，在C、D孔中均加入50 μLPBS緩沖液。在A、C孔中均加入50 μLα-葡萄糖苷酶溶液，在B、D孔中均加入50 μLPBS緩沖液，混合均勻后，37 ℃孵育10 min。再向每孔中加入100 μL濃度為10 mg/mL的pNPG溶液，混合均勻后，37 ℃孵育20 min，最后加入100 μL0.2 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)。在405 nm處讀取各孔吸光值（OD）。樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制率（IP%）計算公式如下：

IP%=（1-ODA-ODB）ODc-ODD）×100%

1.5.2 α-淀粉酶體外抑制活性評價[7] 以pH 6.8的0.02 mol/L磷酸緩沖液（含0.006 mol/L NaCl）作為反應(yīng)溶液，將樣品配成濃度為313 μg/mL的溶液。設(shè)樣品反應(yīng)管（A）、樣品對照管（B）、空白反應(yīng)管（C），每管設(shè)3個平行。在A、B管中均加入500 μL樣品溶液，在C管中加入500 μL緩沖液。在A、C管中均加入500 μL α-淀粉酶溶液，在B管中加入500 μL緩沖液，混合均勻后，37 ℃孵育10 min。再向每管中加入500 μL1%可溶性淀粉溶液，混合均勻后，37 ℃孵育10 min，最后加入1 mLDNS試劑，沸水浴5 min終止反應(yīng)，冷卻至室溫，每管均用純水稀釋至10 mL。在540 nm處讀取各管吸光值（OD）。樣品對α-淀粉酶的抑制率（IP%）計算公式如下：

IP%=（1-ODA-ODB）ODc）×100%

1.5.3 DPP-IV酶抑制活性評價[11] 按照DPP-IV酶抑制活性檢測試劑盒說明書開展活性測試，以pH 7.5的50 mM Tris緩沖液為反應(yīng)溶液，將樣品配成濃度為50 μg/mL溶液。在酶標板上設(shè)全酶孔（A）、空白孔（B）及樣品孔（C），每組設(shè)3個重復(fù)孔。在A孔中依次加入100 μL緩沖液，50 μLDPP-IV酶和50 μL H-Gly-Pro-AMC溶液，在B孔中依次加入150 μL緩沖液，50 μL H-Gly-Pro-AMC溶液，在C孔中依次加入50 μL樣品溶液、50 μL緩沖液、50 μLDPP-IV酶和50 μL H-Gly-Pro-AMC溶液。加樣結(jié)束后，37 ℃孵育30 min。在激發(fā)光波長350～360 nm，發(fā)射光波長450～465 nm處讀取熒光值（F）。樣品對DPP-IV酶的抑制率（IP%）計算公式如下：

IP%=（1-FC-FB）FA-FB）×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 氣相色譜-質(zhì)譜分析結(jié)果 對感應(yīng)草石油醚提取物及其甲酯化產(chǎn)物的GC-MS總離子流圖中的各峰進行質(zhì)譜掃描，經(jīng)計算機檢索NIST05a、Wiley275標準譜庫，采用峰面積歸一化法計算出各成分的相對含量，結(jié)果見表1和2，從石油醚提取物中鑒定出7個化學(xué)成分，占流出峰總面積的37.95%，其中相對含量最高的成分是棕櫚酸乙酯（15.57%）和硬脂酸乙酯（6.39%），化學(xué)成分類型主要是脂肪族類（36.55%）、芳香族類（1.40%）。從石油醚提取物甲酯化產(chǎn)物中鑒定出6個化學(xué)成分，占流出峰總面積的39.13%，其中相對含量最高的成分是棕櫚酸甲酯（14.99%）和二十四酸甲酯（6.87%），化學(xué)成分類型主要是脂肪族類（36.69%）、芳香族類（2.44%）

2.2 對三種糖代謝相關(guān)酶體外抑制活性評價結(jié)果 感應(yīng)草石油醚提取物對三種糖代謝相關(guān)酶的體外抑制活性測定結(jié)果見表3、4和5，從中可以看出，石油醚提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用較好，在本測定條件下，其抑制效果優(yōu)于陽性對照阿卡波糖;在625～39 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，石油醚提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用隨樣品濃度上升而提高，呈劑量依賴性，其IC50值為81 μg/mL，低于陽性對照阿卡波糖的IC50值393 μg/mL。但石油醚提取物對α-淀粉酶和DPP-IV酶的抑制活性較差，在同等質(zhì)量濃度下，其抑制效果均低于陽性對照。

3 結(jié)論

從感應(yīng)草石油醚提取物及其甲酯化產(chǎn)物中各檢出7個和6個化學(xué)成分，這些成分均為首次從該植物中檢出，化學(xué)成分類型主要是脂肪族類，包括多種脂肪酸及其酯，分別為棕櫚酸乙酯、棕櫚酸、亞油酸乙酯、硬脂酸乙酯、9，15-十八碳二烯酸、硬脂酸、二十四酸（相對含量均大于5%），同時均檢出芳香族類成分2，5-二叔丁基酚（相對含量均大于1%）。Jirovetz L.等[18]曾對產(chǎn)于印度的感應(yīng)草所含揮發(fā)油組分進行分析，從中鑒定了69個成分，所得成分以芳香族和萜類成分為主，脂肪族類成分占少數(shù)。石油醚提取物和揮發(fā)油組分均屬于低極性組分，但由于提取方法的差異，所得組分的化學(xué)組成一般有較大差異，石油醚冷浸提取溫度低，所得組分以醇、酸、酯類為主，水蒸氣蒸餾法所得揮發(fā)油中酮、醛、萜、烷烴、烯烴類低沸點組分較多[19]。另外，同一品種植物的成分及含量會隨著季節(jié)不同及生長環(huán)境變化而波動，因此不同產(chǎn)地和不同采收季節(jié)的藥材化學(xué)組成有差異[20]。感應(yīng)草低極性組分的化學(xué)組成與產(chǎn)地和時間的相關(guān)性有待進一步研究。

活性測定結(jié)果表明，感應(yīng)草石油醚提取物對α-葡萄糖苷酶體外抑制活性較好，在本測定條件下，其抑制效果優(yōu)于陽性對照阿卡波糖。Liu B等報道海草中的油酸、亞油酸、二十碳五烯酸、α-亞麻酸、花生四烯酸和棕櫚酸均對α-葡萄糖苷酶有抑制作用[21]。感應(yīng)草石油醚提取物中檢出的成分主要是脂肪族類，其中的脂肪酸類應(yīng)為抑制α-葡萄糖苷酶的主要成分。

本研究表明，感應(yīng)草石油醚提取物具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，抑制效果優(yōu)于阿卡波糖，其中發(fā)揮抑制作用的功能成分包括脂肪酸及其酯類，進一步證實了感應(yīng)草是開發(fā)α-葡萄糖苷酶抑制劑的良好天然植物資源。感應(yīng)草的化學(xué)組成仍有待進一步分析，特別是對不同產(chǎn)地不同時間采集的感應(yīng)草的化學(xué)成分和生理活性的差異性關(guān)注較少。本課題組將對其展開更深入的分離分析，挖掘其中能夠抑制糖代謝相關(guān)酶的活性組分和單體，加深對該植物資源的系統(tǒng)研究。

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（收稿日期：2020-06-12 編輯：劉 斌）

基金項目：2019年廣西中醫(yī)藥大學(xué)引進博士科研啟動基金項目（2019BS012）;廣西壯瑤藥重點實驗室課題子項目（GXZYKF2019-11）;2019-2021年廣西一流學(xué)科建設(shè)開放課題（2019XK112）;廣西中醫(yī)藥大學(xué)2019 年校級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃（201910600190）;廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥學(xué)學(xué)科青年教師提升計劃（050170035）。

作者簡介：廖彭瑩（1984-），女，漢族，博士，副教授，研究方向為中藥化學(xué)、天然藥物化學(xué)。E-mail：gxlpy@163.com