不同雜交瘤細胞株單鏈抗體的構(gòu)建及性質(zhì)比較

胡 莉， 劉愛平， 王小紅

（1. 黃淮學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，河南 駐馬店463000；2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安625014；3. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，湖北 武漢430070）

黃曲霉毒素B1（AFB1）主要是由產(chǎn)毒黃曲霉、寄生曲霉和集峰曲霉產(chǎn)生的具有極高毒性的次生代謝產(chǎn)物。 AFB1 可以在農(nóng)作物生長、收獲、貯藏、運輸和銷售等任何環(huán)節(jié)中產(chǎn)生，并由此直接進入食物鏈，造成淀粉類食品、動物性食品與肉、蛋、奶等的交叉污染。 AFB1 對人和動物的肝臟具有很強的毒性，是國際公認的致癌物質(zhì)[1]。 因此，AFB1 的檢測與分析技術(shù)的研究是非常必要的。 到目前為止，關(guān)于AFB1 分析檢測方法的研究報道很多， 如薄層層析法、高效液相色譜法、納米金標記法、免疫親和柱法和近紅外光譜法[2-5]。 免疫化學(xué)學(xué)分析法因具有快速、簡單、靈敏、針對性強等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用，在這些檢測方法中，其中ELISA 法要求有較高質(zhì)量的抗體[6-13]。

在過去的十年里，在抗黃曲霉毒素多克隆抗體的基礎(chǔ)上，對半抗原具有不同親和力的抗黃曲霉毒素單克隆抗體應(yīng)運而生。 在免疫檢測方法中，抗原和抗體之間的高親和力是非常重要的。 隨著抗體技術(shù)的發(fā)展，重組抗體尤其是單鏈抗體（ScFv）已經(jīng)運用到黃曲霉毒素的檢測中[14]。重組抗體具有成本低、易于操作的親和力和靈敏度的特點。 而且，通過定點突變的方法可以提高抗體親和力。

單鏈抗體（single chain Fv antibody fragmment，ScFv）是由抗體的重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL） 通過一段約45~75 個堿基組成的柔性肽（Linker）連接而得到的[15-17]，是一種新型重組小分子抗體蛋白質(zhì)。 scFv 僅為完整抗體的1/6 大小，由于其相對分子質(zhì)量小，結(jié)構(gòu)單位小，因此其組織穿透力強，免疫原低，可在多種表達系統(tǒng)中表達，具有成本低，血流中半衰期短等特點，在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用極為廣泛[18-21]。又由于scFv 易于制備、無Fc 段引起的非特異性反應(yīng)、易于改造且表達產(chǎn)量高而獲得了研究學(xué)者們的廣泛關(guān)注。 scFv 中的VH 和VL 來源于不同的雜交瘤細胞， 構(gòu)建成的scFv 的靈敏度、特異性等生物活性也有所不同。

作者所在實驗室通過大量篩選，最后得到幾株能穩(wěn)定分泌抗黃曲霉毒素單克隆抗體的三株雜交瘤細胞株（2C10、2E6 和2H1），在這些細胞中，2C10雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體表現(xiàn)有最高的靈敏度，2E6 次之，2H1 再次之。 分別提取雜交瘤細胞的總RNA，設(shè)計通用引物，采用分子生物學(xué)技術(shù)分別克隆其相應(yīng)的重鏈可變區(qū) （heavy chain variable region，VH） 和 輕 鏈 可 變 區(qū) （light chain variable region，VL）基因，以一段連接肽（Linker）將VH 和VL 連接起來，組裝成三種不同的scFv 基因。將通過融合PCR 構(gòu)建的scFvs 在大腸桿菌表達系統(tǒng)中進行蛋白質(zhì)表達，純化蛋白質(zhì)后通過競爭ELISA 法展現(xiàn)不同的單克隆抗體與所對應(yīng)的單鏈抗體靈敏度之間的關(guān)系；另外分別對編碼單鏈抗體的3 種可變區(qū)基因（VH/VL）進行克隆和測序，并對此做核酸同源性分析和氨基酸同源性分析。 通過可變區(qū)基因序列的比對， 比較VH 和VL 來源的不同對scFv 生物活性的影響，初步探究具有高靈敏度蛋白質(zhì)的堿基結(jié)構(gòu)組成， 以便后續(xù)改善和提高重組抗體的靈敏度，并獲得更高靈敏度的重組抗體。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

AFB1： 購于瑞士Alexis 公司； 雜交瘤細胞株2C10、2E6、2H1 和E.coli菌株Trans5α、表達菌株E.coliBL21（DE3）及表達載體pET-30a：為作者所在實驗室常規(guī)保存；Easy Taq 酶、 Trans2K Plus DNA Marker、Trans5K Plus DNA Marker：購于中國北京全式金生物技術(shù)有限公司； 限制性內(nèi)切酶、DNA 連接酶、PMD19-T Simple Vector： 購自TaKaRa 公司；質(zhì)粒小提、DNA 凝膠回收試劑盒： 購自杭州AxyGen；引物：南京金斯瑞生物科技有限公司合成；羊抗小鼠IgG-HRP 酶標二抗： 購于中國華美生物工程公司；質(zhì)粒提取試劑盒：購于中國北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；Ni-NTA 親和層析填料、ECL 顯色液、Page RulerPrestained Protein Ladder： 購于美國Thermo 公司；DNA 凝膠回收純化試劑盒：購于中國北京莊盟國際生物基因科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設(shè)計與目的基因擴增活化并亞克隆實驗室篩選保存的靈敏度分別為 9.54、85.76、203.00 ng/mL[22]的 三 株 雜 交 瘤 細 胞 株2C10、2E6 和2H1， 收集8×106雜交瘤細胞， 采用TRIzol 試劑（Invitrogen，USA） 分 別 進 行 總RNA 的 提 取。 以oligo-dT18 為引物，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）獲得三種不同的單鏈cDNA。 RT-PCR 反應(yīng)體系為25 μL：5 μL 的5×primescript buffer，1 μL 的50 mmol/L oligo-dT18，2 μL 的2.5 mmol/L dNTP 溶液，0.5 μL的RNase inhibitor，5 μL 的總RNA，以及0.5 μL 的primescript RTase（200 U/μL），11 μL 的DEPC 處理過的ddH2O。RT-PCR 反應(yīng)程序為：25 ℃10 min，42℃1 h，70 ℃15 min。

分別以已經(jīng)獲得的cDNA 為模板， 以VHFOR、VH-Back、VL-FOR 和VL-Back 為引物[23-24]，PCR 擴增VH 和VL 基因，見表1。 將獲得的VH 和VL 基因片段分別連接到載體pMD19-T 上，將獲得的重組載體pMD19-T-VH 和pMD19-T-VL 轉(zhuǎn)化到E. coliTrans5a 細胞中，以便基因測序。

以已經(jīng)測序成功的重組質(zhì)粒pMD19-T-VH-2C10/2E6/2H1 和pMD19-T-VL-2C10/2E6/2H1 分別為模板， 設(shè)計相應(yīng)的引物， 采用重疊延伸PCR（gene splicing by overlap extension PCR，SOE-PCR）擴增scFv-2C10/2E6/2H1 基因片段[25]，并在目的基因兩端分別引入NcoⅠ和XhoⅠ酶切位點。

首先，以引物1 和引物2 為引物，PCR 擴增出3種帶有部分Linker 的VH-Linker 片段；以引物3 和引物4 為引物，PCR 擴增出3 種帶有部分Linker 的Linker-VL 片段。 PCR 擴增條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min，（94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），28 個循環(huán)，72 ℃延伸8 min。每輪PCR 后，將3 μL PCR 產(chǎn)物與1 μL 6 × Loading buffer 混勻，采用0.8 g/dL 的瓊脂糖凝膠電泳分析并借助凝膠回收試劑盒分別純化回收不同的PCR 產(chǎn)物VHLinker 和Linker-VL。 然后， 通過SOE-PCR 構(gòu)建scFv-2C10/2E6/2H1 基因。 SOE-PCR 分兩步：第一步， 以上述回收的產(chǎn)物VH-Linker 和Linker-VL 為模板進行PCR 擴增反應(yīng)，將VH 和VL 通過Linker連接合成一條單鏈。 PCR 擴增條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min；（94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），10 個循環(huán)；72 ℃延伸8 min。經(jīng)0.8 g/dL 的瓊脂糖凝膠電泳分析并純化回收PCR 產(chǎn)物。 第二步， 以第一步純化產(chǎn)物為模板， 以引物1 和引物4為引物， 分別PCR 擴增scFv-2C10/2E6/2H1 基因。PCR 擴增條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min；（94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min），30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。 經(jīng)0.8 g/dL 的瓊脂糖凝膠電泳分析并分別純化回收PCR 產(chǎn)物。 根據(jù)基因來源的不同， 最后獲得3 種不同的PCR 產(chǎn)物， 即為NcoⅠ-scFv-XhoⅠ-2C10、NcoⅠ-scFv-XhoⅠ-2E6 和NcoⅠ-scFv-XhoⅠ-2H1。

表1 VH、VL 和scFv 基因PCR 擴增、克隆所用的引物序列Table 1 Nucleotide sequences and primers used for VH,VL and scFv amplification, cloning, and subcloning

1.2.2 重組質(zhì)粒pET-30a-pelB-scFv-2C10/2E6/2H1 的構(gòu)建和鑒定PelB 信號肽可以引導(dǎo)蛋白質(zhì)產(chǎn)物在細胞周質(zhì)表達，為了方便后續(xù)的蛋白質(zhì)純化工作， 現(xiàn)將pET-22b 載體上的pelB 信號肽序列克隆到最終使用載體pET-30a 上，方法分為兩步。 首先將 “1.2.1” 中第二步獲得的PCR 產(chǎn)物NcoⅠ-scFv-XhoⅠ-2C10、NcoⅠ-scFv-XhoⅠ-2E6、NcoⅠ-scFv-XhoⅠ-2H1 和質(zhì)粒pET-22b 均采用限制性內(nèi)切核酸酶NcoⅠ和XhoⅠ進行雙酶切， 純化回收產(chǎn)物后，采用DNA 連接酶將scFv-2C10/2E6/2H1 和pET-22b 進行連接獲得重組質(zhì)粒pET-22b-scFv-2C10/2E6/2H1，并轉(zhuǎn)化E. coliTrans5α 細胞。挑取單克隆進行菌落PCR 驗證。

然后提取上述陽性克隆子pET-22b-scFv-2C10/2E6/2H1 的質(zhì)粒， 純化后將重組質(zhì)粒pET-22b-scFv-2C10/2E6/2H1 和質(zhì)粒pET-30a 分別用NdeⅠ和XhoⅠ進行雙酶切，純化回收產(chǎn)物后，采用DNA 連接酶將pelB-scFv-2C10 和pET-30a 進行連接， 獲得重組質(zhì)粒pET-30a-pelB-scFv-2C10/2E6/2H1 并轉(zhuǎn)化E. coliTrans5α 細胞。 挑取單克隆進行菌落PCR 驗證，選取陽性轉(zhuǎn)化子送至南京金思瑞生物科技有限公司測序。

測序正確的陽性轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)并提取質(zhì)粒后，將空載體pET-30a 和所提取質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，挑取菌落轉(zhuǎn)化子進行PCR 驗證， 陽性轉(zhuǎn)化子分別命名為BL21 （DE3）-pET-30a和BL21（DE3）-pET-30a-pelB-scFv-2C10/2E6/2H1。

1.2.3 重組質(zhì)粒pET-30a-pelB-scFv 的表達及鑒定無菌條件下挑取1.2.2 中轉(zhuǎn)化成功的單菌落轉(zhuǎn)化子BL21 （DE3）-pET-30a 和BL21 （DE3）- pET-30apelB-scFv-2C10/2E6/2H1，分別培養(yǎng)于100 mL 液體LB 培養(yǎng)基中（含有100 μL 的50 mg/mL 的kana），于200 r/min、37 ℃條件下培養(yǎng)至OD600nm為0.8 左右時， 加入誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），并使其終濃度為1 mmol/L，16 ℃誘導(dǎo)表達20 h。多次試驗發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)時間為20 h 時蛋白質(zhì)表達量達到最高。 收集菌體，進行蛋白質(zhì)預(yù)表達分析實驗。

由于pelB 信號肽的存在， 所以基本確定目的蛋白質(zhì)主要存在于細胞周質(zhì)內(nèi)。 又由于只有當新生肽鏈的合成速率大于蛋白質(zhì)折疊速率時，蛋白質(zhì)才會以包涵體的形式存在，而肽鏈的合成速率又與溫度有著直接的關(guān)系， 選擇16 ℃低溫誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的表達可以有效地避免包涵體形式的形成，且實驗證明的確如此。

采用SDS-PAGE 對scFv-2C10/2E6/2H1 的預(yù)表達情況進行驗證分析， 將破碎后的菌體細胞于4℃低溫離心， 可溶性蛋白質(zhì)經(jīng)鎳柱親和層析法進行蛋白質(zhì)純化，純化后的蛋白質(zhì)與上樣緩沖液混勻后煮沸6 min 直接上樣，經(jīng)SDS-PAGE 驗證后，接著轉(zhuǎn)印PVDF 膜，再以5%牛奶封阻PVDF 膜，最后采用羊抗小鼠IgG-HRP 酶標二抗孵育后， 利用ECL顯色液顯色，觀察結(jié)果。

1.2.4 抗AFB1 scFvs-2C10/2E6/2H1 的性質(zhì)分析以20 mL PBS 緩沖溶液懸浮，在冰浴條件下將細胞超聲破碎（30 min，功率105 W，2 s 開啟，2 s 關(guān)閉），4 ℃下10 000 r/min 離心10 min，取上清液，采用鎳柱親和層析純化上清液，純化后所得到的蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE 初步驗證后，再以間接競爭ELISA 檢測上述兩種表達載體所表達的目的蛋白質(zhì)抗AFB1 scFv-2C10/2E6/2H1 的靈敏度， 試驗中以pET-30a空載體的表達為陰性對照。

用CBS 緩沖液稀釋AFB1O-OVA 為1 μg/mL，包被96 孔板過夜，PBST 洗滌甩干。 每孔加入200 μL 封阻液，37 ℃靜置2 h， 甩干封阻液，PBST 洗滌甩干。 每孔加入90 μL 用PBST 稀釋的抗AFB1 scFv-2C10/2E6/2H1 和10 μL 以PBS 稀釋的不同質(zhì)量濃度的AFB1 溶液（質(zhì)量濃度分別為2、8、20、40、60 μg/mL），37 ℃靜置1 h， 甩干液體，PBST 洗滌甩干。 每孔加入100 μL 的羊抗鼠IgG-HRP 酶標二抗（以PBST 4 000 倍稀釋），37 ℃靜置1 h，甩干液體，PBST 洗滌甩干。 每孔加底物緩沖液100 μL，37 ℃靜置15 min， 每孔加入50 μL、2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，492 nm 測吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因scFv-2C10/2E6/2H1 擴增

以 質(zhì) 粒 pMD19 -T -VH -2C10/2E6/2H1 和pMD19-T-VL-2C10/2E6/2H1 分別為模板，經(jīng)SOEPCR 第一步擴增產(chǎn)物為模板， 進行第二步PCR，獲得兩端帶有酶切位點的產(chǎn)物scFv-2C10/2E6/2H1 基因。 經(jīng)0.8 g/dL 瓊脂糖凝膠電泳檢測， 大小約為750 bp， 與理論值一致， 見圖1。 回收試劑盒回收scFv-2C10/2E6/2H1 基因片段。

2.2 株間氨基酸序列同源性比較

由于三種VH 氨基酸和VL 氨基酸均來自于雜交瘤細胞， 且單克隆抗體的靈敏度高低順序為2C10＞2E6＞2H1， 因此使用NCBI Blast 分析比對各株間VH、VL 氨基酸序列的同源性， 比對分析結(jié)果分別見表2～3。

圖1 scFv-2C10/2E6/2H1 基因的PCR 擴增結(jié)果Fig. 1 PCR results of amplification scFv-2C10/2E6/2H1

表2 不同VH 氨基酸序列比較分析Table 2 Homology analysis of different VH amino acid sequence

表3 不同VL 氨基酸序列比較分析Table 3 Homology analysis of different VL amino acid sequence

由表2~3 可知， 菌株2C10 和2E6 之間的重鏈可變區(qū)氨基酸序列的同源性是100%， 與2H1 的同源性只有42.74%；2H1 和2C10、2E6 和2C10 之間的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列的同源性分別為42%和43%， 而2E6 和2H1 之間的同源性可以達到59%。相同的重鏈，不同的輕鏈對單鏈抗體的生物活性也有一定的影響。

2.3 重組質(zhì)粒pET-30a-pelB-scFv 的構(gòu)建及鑒定將pET-30a 質(zhì)粒和回收產(chǎn)物pelB-scFv-2C10/

2E6/2H1 分別進行NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切反應(yīng)和連接反應(yīng)，獲得重組質(zhì)粒pET-30a-pelB-scFv。 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliTrans5α 細胞，挑取轉(zhuǎn)化子，以引物1 和引物4 對其進行菌落PCR 驗證，見圖2（a）。PCR 產(chǎn)物大小約為750 bp，與理論預(yù)期值一致。 測序結(jié)果進一步驗證了重組質(zhì)粒構(gòu)的建成功。

將測序成功的陽性轉(zhuǎn)化子pET-30a-pelB-scFv和空質(zhì)粒pET-30a 分別轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，轉(zhuǎn)化子進行PCR 驗證，見圖2（b），PCR 產(chǎn)物大小約為750 bp，與理論值一致。

圖2 含目的基因的轉(zhuǎn)化子PCR 驗證結(jié)果Fig. 2 PCR results of transformants containing target gene

2.4 重組質(zhì)粒pET-30a-pelB-scFv 的表達及鑒定

挑取固體LB 平板上生長的陽性菌落進行誘導(dǎo)表達， 鎳柱親和法純化表達蛋白質(zhì)， 采用SDSPAGE 和Western blot 對 抗AFB1 scFv-2C10/2E6/2H1 蛋白質(zhì)進行驗證， 結(jié)果見圖3。 由圖3 可知，SDS-PAGE 和Western blot 鑒定結(jié)果表明已成功誘導(dǎo)表達了目的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量約為29 000，與目的蛋白質(zhì)理論值一致。 BCA 法測定誘導(dǎo)20 h 純化后目的蛋白質(zhì)的產(chǎn)率約為34 mg/L。

2.5 抗AFB1scFv-2C10/2E6/2H1 的性質(zhì)分析

分別以間接非競爭ELISA 和間接競爭ELISA純化后的scFv-2C10/2E6/2H1 進行分析。 間接非競爭ELISA 表明，AFB1O-OVA 包被質(zhì)量濃度為1 μg/mL，抗AFB1 scFv-2C10/2E6/2H1 的質(zhì)量濃度約為0.17 mg/mL 時，OD492nm約為1.0。 在此條件下，以AFB1 為競爭抗原， 進行間接競爭ELISA 檢測不同表達系統(tǒng)表達的目的蛋白質(zhì)的靈敏度，并取五點以繪制scFv-2C10/2E6/2H1 的間接競爭抑制曲線，由圖4 可知， 目的蛋白質(zhì)scFv-2C10/2E6/2H1 的檢測靈敏度分別約為40、50 μg/mL 和大于50 μg/mL。可以看出，隨著單克隆抗體靈敏度的下降，它所對應(yīng)的單鏈抗體的靈敏度也隨之降低。這表明scFv 的靈敏度與其本身的VH 和VL 的基因組成相關(guān)， 要想改變scFv 的靈敏度，可以考慮改變其基因組成。

圖3 抗AFB1 scFv-2C10/2E6/2H1 表達的SDS-PAGE 和Western-blot 分析Fig. 3 SDS -PAGE and Western -blot analysis for expression of anti-AFB1 scFv-2C10/2E6/2H1

圖4 scFv-2C10/2E6/2H1 的間接競爭ELISA 抑制曲線Fig. 4 IC-ELISA inhibition curves of pET-30a-pelBscFv-2C10/2E6/2H1

3 結(jié) 語

基于AFB1 的毒性，其檢測極限顯得尤為重要。目前的檢測分析方法中使用較廣的是酶聯(lián)免疫吸附法，該法以檢測快速、靈敏、樣品制備簡單等優(yōu)點而廣受關(guān)注。 在該檢測方法中，抗體是核心試劑，以實驗室保存的抗AFB1 單克隆雜交瘤細胞株為原料構(gòu)建不同的scFv 基因。

目前，對于外源蛋白質(zhì)的表達，E. coli表達系統(tǒng)是應(yīng)用較多、 研究較多的， 也最具有代表性的，E.coli作為AFB1scFv 的表達系統(tǒng)，E. coli具有操作方便快速、實驗周期不長、生產(chǎn)成本小等優(yōu)點。

pelB 信號肽可以引導(dǎo)目的蛋白質(zhì)在細胞周質(zhì)內(nèi)表達，并且采取一定的手段可以避免包涵體的形成，增加可溶蛋白質(zhì)的表達，提高純化效率[26]。 基于此，實驗先將目的基因克隆到帶有pelB 信號肽的載體pET-22b 上， 再將pET-22b 上的pelB 信號肽序列和目的基因序列一同克隆到載體pET-30a 上，這樣是為了充分利用pelB 信號肽的上述特性。 基于此，實驗將三種目的基因分別轉(zhuǎn)化E. coli表達體系進行蛋白質(zhì)表達。 最終本研究成功構(gòu)建了三種重組載體pET-30a-pelB-scFv-2C10/2E6/2H1，并將其轉(zhuǎn)化到相應(yīng)的表達細胞中進行蛋白質(zhì)表達， 以分析scFv 的親和力是否與其對應(yīng)的單克隆抗體有關(guān)。 實驗結(jié)果顯示， 蛋白質(zhì)最高表達量約為34 mg/L。 經(jīng)ELISA 實驗結(jié)果表明， 三種目的蛋白質(zhì)scFv-2C10/2E6/2H1 均顯示出活性， 檢測靈敏度分別約為40、50 μg/mL 和大于50 μg/mL。 這說明隨著單克隆抗體靈敏度的升高，其所對應(yīng)的單鏈抗體的靈敏度也隨之升高，原因可能是scFv 的靈敏度與其堿基組成息息相關(guān)。其次，由于2C10 和2E6 的重鏈可變區(qū)的堿基組成是相同的，而二者的靈敏度卻有一定的差距，這充分說明單鏈抗體與抗原的結(jié)合位點不僅存在于重鏈，輕鏈的影響也很大。 所以，接下來的實驗要想調(diào)高其靈敏度， 還需要大量的實驗分析和改進，分析其原因最終可能是因為scFv 的自身編碼基因的親和力不夠高，所以在未來的實驗中，可能會采取基因工程技術(shù)手段，如基因定點突變或隨機突變等對scFv 的親和力進行提高。