納濾脫鹽在ε-聚賴氨酸分離提取中的應用

李芳良， 何洪剛， 馬 玉， 毛忠貴， 陳旭升*

（1. 江南大學 工業(yè)與生物技術教育部重點實驗室， 江蘇 無錫214122；2. 江南大學 生物工程學院， 江蘇 無錫214122）

ε-聚賴氨酸（ε-poly-L-lysine，簡寫ε-PL）是以25~35 個L-賴氨酸為惟一單體聚合而成的一種同型氨基酸聚合物， 相對分子質量一般為3 200~4 500。它具有水溶性好、熱穩(wěn)定性強、抑菌譜廣和生物安全性高等特點，從而成為一種優(yōu)良的生物食品防腐劑，被廣泛應用于日本、韓國、歐美等國家食品工業(yè)中[1]。 2014 年，我國衛(wèi)計委將ε-PL 及其鹽酸鹽批準成為我國新型食品防腐劑并被納入到國標GB2760-2014[2]。此外，ε-PL 還在醫(yī)藥、電子、材料等方面有著非常廣泛的應用[3]。

微生物發(fā)酵法是目前大量獲得ε-PL 的惟一生產方法。 然而，發(fā)酵液成分復雜，除了含有大量菌體細胞和未被消耗的培養(yǎng)基成分， 還含有菌體裂解物、代謝副產物、色素和膠體等。 作者所在研究團隊前期研究發(fā)現(xiàn)， 經(jīng)過簡單固液分離后，ε-PL 質量分數(shù)僅為20%左右[4]。 但是作為食品添加劑，GB2760-2014 要求ε-PL 及其鹽酸鹽的純度至少在質量分數(shù)95%以上[2]。 因此，如何從復雜的發(fā)酵液體系中低成本、 高效率地分離純化ε-PL 及其鹽酸鹽就成為限制ε-PL 產業(yè)化的關鍵。 目前，離子交換法被普遍應用于ε-PL 的分離提取[5-7]，它具有除雜能力強、產品回收率高等優(yōu)勢，是一種非常有效的提取方法。 但是， 用于離子交換解吸附的洗脫劑主要是0.1~0.2 mol/L 鹽酸、氫氧化鈉或氨水，這就為后續(xù)ε-PL 精制步驟引入了大量的鹽分（主要是酸堿中和反應產生的NaCl）。 然而，目前關于如何去除ε-PL 提取過程中的鹽分卻很少被報道。 周斌等[8]利用截留相對分子質量為4 000 的超濾膜對脫色后的洗脫液進行濃縮和脫鹽，但并未給出此步驟的脫鹽效率和產品回收率等指標。

作者所在研究團隊前期通過對發(fā)酵液中雜蛋白質去除方法[9]、脫色方法[10]、離子交換樹脂選型[5]等方面的研究，提出了一種從發(fā)酵液中分離提取ε-PL的方法[11]。 但是該工藝所用的截留相對分子質量為1 000 納濾膜為板式膜， 而工業(yè)生產應用的多為性價比更高的卷式膜，因此有必要篩選出合適的卷式膜來進行ε-PL 離子交換提取液的脫鹽研究。

納濾（Nanofiltration）是介于反滲透和超濾之間的一種膜分離技術，它是基于道南效應（電荷）和篩分（孔徑）原理，用于低相對分子質量產物濃縮和脫鹽，被廣泛應用于水處理、食品加工[12]和生物分離[13]等行業(yè)。 作者以ε-PL 和NaCl 制成的模擬料液為研究對象，通過納濾膜篩選、操作方式和操作條件優(yōu)化， 確定了適合ε-PL 料液脫鹽的納濾膜和操作條件，并考察了納濾膜應用于真實物料（離交洗脫液）情況下的脫鹽效果。該研究是首次嘗試納濾用于ε-PL 分離和提取過程的脫鹽，對ε-PL 產業(yè)化生產具有一定的指導意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗選用的納濾膜元件均為卷式膜，相關技術參數(shù)見表1。ε-PL 購買于鄭州拜納佛生物工程有限公司， 該樣品的ε-PL 純度為質量分數(shù)98%。 NaCl和膜清洗用亞硫酸氫鈉為分析純，購買于國藥集團化學試劑有限公司。

表1 膜性質Table 1 Membrane properties

1.2 實驗設備

膜分離系統(tǒng)由安徽普朗膜技術有限公司提供，型號為PL-D3-1812，見圖1。 三種納濾膜面積均為0.27 m2，操作溫度控制在（25.0±1.0） ℃并由循環(huán)水實現(xiàn)。 實驗過程中通過控制循環(huán)液節(jié)流閥，保持進口壓力恒定在1.0 MPa。 循環(huán)液流量和滲透通量通過轉子流量計讀取。電導率儀DDSJ-308A（上海儀電科學儀器股份有限公司）和pH 計（瑞士Mettler Toledo公司）分別用于透過液電導率和料液pH 值的測定。

圖1 PL-D3-1812 膜分離系統(tǒng)設備及示意圖Fig. 1 PL-D3-1812 membrane system and its schematic diagram

1.3 實驗過程

1.3.1 膜的篩選影響膜分離性能的主要參數(shù)有料液狀況（溶質濃度、pH 值、離子強度）、操作條件（跨膜壓差、溫度、循環(huán)流速）和膜結構及其表面特性等。 這些參數(shù)的選擇和優(yōu)化對實際膜分離過程十分重要[14]。膜選型一般是將備選膜用于待分離體系，在不同操作條件下進行透過通量和溶質收率測試，選擇較高透過通量和滿意收率的膜用于后續(xù)實驗。

為了模擬真實物料，配置體積為10 L，ε-PL 和NaCl 質量濃度分別為10 g/L 和5 g/L 的溶液作為料液模擬液。 在恒定的進口壓力下（1.0 MPa），對三種納濾膜在pH 5.0、7.0、9.0 和11.0 條件下采用間歇變容滲濾方式進行脫鹽， 具體過程見圖2。 先將V0=10 L 模擬料液濃縮至6 L（Vr，6 L 為設備的運行死體積，低于6 L 無法保持穩(wěn)定的壓力），隨后加去離子水至料液初始體積V0，如此重復5 次。 收集透過液，測定ε-PL 質量濃度和Cl-質量濃度，計算ε-PL 損失率和脫鹽率。

圖2 間歇變容滲濾操作流程示意圖Fig. 2 Process of desalination experiments at batch constant volume diafiltration condition

1.3.2 操作模式的優(yōu)化一般情況下，納濾脫鹽的操作模式包括兩個步驟：濃縮、滲濾[15-17]。 在濃縮階段，隨著產物質量濃度增加和溶液粘度上升，納濾膜的濃差極化和膜污染會變得越來越嚴重，通量也會隨之不斷下降。 因此，濃縮階段將目標產品濃縮到何種質量濃度將影響到納濾后續(xù)操作。 以往納濾脫鹽研究，一般是通過考察不同濃縮倍數(shù)對脫鹽效果的影響[18]。然而，由于工業(yè)生產中每批料液性質均會存在波動（如產物質量濃度和鹽質量濃度），因此以固定產品質量濃度代替濃縮倍數(shù)來考察脫鹽效果將更具有現(xiàn)實意義。 作者通過將100 L 的ε-PL模擬料液（ε-PL 和NaCl 質量濃度分別為10 g/L 和5 g/L）分別濃縮到不同質量濃度（60、80、100 g/L），以考察不同ε-PL 質量濃度對脫鹽的影響。 滲濾階段是整個過程中脫鹽最多的階段，而此階段需要加入大量透析水使得鹽分隨著透過液不斷透過。 為了減少滲濾時的耗水量，作者比較了間歇變容滲濾和連續(xù)恒容滲濾以及一次性添加三種不同的加水方式對脫鹽效率的影響， 具體操作過程見圖3。 圖3（a）為間歇變容滲濾，即當料液濃縮至10 L 時，一次性加5 L 去離子水進行脫鹽， 當透過液體積為5 L時再加5 L 去離子水，如此反復直至脫鹽結束；圖3（b）為連續(xù)恒容滲濾，即當料液濃縮至10 L 時，用連續(xù)流加去離子水，使去離子水的加入流量和透過液的流量保持一致，使儲罐料液體積始終保持在10 L左右，直至脫鹽結束；圖3（c）為一次性添加，當體積濃縮至10 L 時，直接一次性加入90 L 去離子水，待濃縮至10 L 體積時脫鹽結束。

圖3 三種操作模式下脫鹽過程示意圖Fig. 3 Diagram of three diafiltration methods

1.3.3 離交洗脫液納濾脫鹽由于之前所用料液均為ε-PL 模擬料液， 為了考察真實料液的脫鹽情況， 將1 000 L 離子交換洗脫液 （ε-PL：9.09 g/L、NaCl：4.45 g/L） 進 行 納 濾 脫 鹽 實 驗。 納 濾 膜 為SP800， 膜面積為26.5 m2， 進口壓力保持為1.0 MPa，脫鹽模式為先濃縮后滲濾，由于每次離子交換后料液質量濃度不一，將料液濃縮至所需的質量濃度， 隨后根據(jù)優(yōu)化出來的最優(yōu)滲濾方法進行脫鹽，直至透過液電導率低于300 μS/cm 為止。 收集透過液，截留液分析數(shù)據(jù)。

1.4 分析方法

ε-PL 質量濃度的測定： 采用甲基橙法測定[20]；灰分：根據(jù)國標GB 5009.4-2010 測定[21]；Cl-濃度：通過硝酸銀滴定方法測得[22]。

1.5 計算公式

膜通量J的計算方程為：

式中， 膜通量J的單位為L/（m2·h）；Vp代表透過體積（L）；A代表膜面積（m2）；t代表時間（h）。

ε-PL 收率的計算公式為：

式中，cp、cf分別為透過液和儲料罐中的ε-PL 質量濃度（g/L），Vp、Vf分別為透過液體積和儲料罐中料液的體積（L）。

NaCl 的去除率的計算公式為：

式中，cp、cf分別為透過液和儲料罐中的Cl-的質量濃度（g/L）；Vp、Vf分別為透過液體積和儲料罐中料液的體積（L）。

2 結果與討論

2.1 不同操作壓力下納濾膜的純水通量

圖4 顯示的是，納濾膜SP800、M8-29 和GE1K在不同操作壓力下的純水通量。 由圖4 可知，隨著操作壓力的增加，三種納濾膜的純水透過通量均呈線性增加。 在0.1~1.0 MPa 范圍內，納濾膜純水通量大小排序為：SP800＞M8-29＞GE1K。 其中，GE1K 純水通量是同等壓力下其他兩種納濾膜的10%左右。一般而言，膜的純水透過通量越大，相同壓力下單位膜面積的生產效率就越高，也就越適用于實際的工業(yè)生產過程。 由此可見，GE1K 不適用于ε-PL 的脫鹽。

圖4 不同壓力下納濾膜的純水通量Fig. 4 Flux of membranes under different pressures

2.2 pH 值對ε-PL 收率和NaCl 去除率的影響

由于聚酰胺材質的納濾膜一般荷負電荷，而ε-PL 則依據(jù)溶液pH 值不同可以表現(xiàn)出帶正電荷（pH＜9.0）、 負電荷（pH＞9.0） 和凈電荷為零（pH=9.0）。 因此，有必要考察ε-PL 在不同荷電情況下納濾膜SP800 和M8-29 的脫鹽狀況，結果見圖5。

由圖5（a）可知，在pH 5.0~11.0 范圍內，兩種納濾膜對ε-PL 均保持了較高的收率， 達到91%~95%。 由于ε-PL 相對分子質量存在一定的分布范圍（3 200~4 500），且納濾膜有效截留相對分子質量為其自身截留相對分子質量的5~8 倍，這就造成了ε-PL 收率達不到100%。 然而，兩種納濾膜的最大ε-PL 收率所對應的pH 值卻不一致。 納濾膜SP800在pH 9.0 時達到最大ε-PL 收率（94.4%），納濾膜M8-29 在pH 7.0 時達到最大ε-PL 收率 （92.9%）。造成這種差異的原因可能和不同廠家生產制造納濾膜的工藝不同有關。在NaCl 去除方面（圖5（b）），SP800 和M8-29 保持了較高的一致性，均在pH 9.0時實現(xiàn)了最大的NaCl 去除率， 分別達到88.6%和82.3%。 由于ε-PL 等電點是9.0，此時ε-PL 結合鈉離子和氯離子的能力最弱，這可能是造成pH 9.0 是最適脫鹽pH 的根本原因。 宋奇等[23]在研究乳清蛋白的納濾脫鹽過程中， 也發(fā)現(xiàn)了當pH 為乳清蛋白的等電點時脫鹽效果最好。 圖5（c）顯示，SP800 和M8-29 在pH 5.0~11.0 范圍內的膜通量分別穩(wěn)定在50、45 L/（m2·h），表明pH 值對兩種納濾膜的膜通量影響不明顯。 綜上所述， 納濾膜SP800 在ε-PL 收率、NaCl 去除率和膜通量上均優(yōu)于M8-29。 在pH 9.0 時，SP800 納濾膜能夠實現(xiàn)ε-PL 收率94.4%，NaCl 去除率92.84%和膜通量50 L/（m2·h）。因此，確定SP800 納濾膜用于后續(xù)實驗。

圖5 不同pH 值對納濾膜ε-PL 收率、NaCl 去除率和透過通量的影響Fig. 5 Effect of pH on nanofiltration membrane’s ε-PL rejection ratio，NaCl removal ratio and permeate flux

2.3 ε-PL 質量濃度對納濾膜SP800 滲濾脫鹽過程的影響

納濾操作一般包括濃縮和滲濾脫鹽兩個過程。在濃縮階段，具體將產品濃縮到多少質量濃度比較合適，將影響到滲濾脫鹽階段的透析水用量和脫鹽效率。 因此，有必要考察不同質量濃度ε-PL 在相同操作條件下的脫鹽效果。如表2 所示，將含有10 g/L ε-PL 和5 g/L NaCl 模擬料液分別濃縮至ε-PL 質量濃度為60、80、100 g/L（對應的濃縮倍數(shù)分別為6倍、8 倍和10 倍），考察其納濾過程的用水量、用時、脫鹽率和ε-PL 回收率。 由表2 可知，隨著濃縮倍數(shù)的升高，獲得相同的脫鹽效果所消耗的透析水量和用時均呈現(xiàn)顯著下降趨勢。 當濃縮倍數(shù)達到10 倍（即ε-PL 質量濃度達到100 g/L）時，透析水用量只有濃縮6 倍時的61.5%，用時也只有58.0%。 由此可見，濃縮倍數(shù)越高，脫鹽效率就越高。 圖6 顯示的是，不同濃縮倍數(shù)條件下，恒容滲濾脫鹽過程的滲透速率變化趨勢。 可以看出，濃縮倍數(shù)越低，滲透速率越高。 當濃縮倍數(shù)達到10 倍時，滲透速率最低，平均通量僅為24 L/（m2·h）。 值得注意的是，當濃縮倍數(shù)達到10 倍時， 膜通量衰減速率變慢且中后期基本趨于穩(wěn)定。 這是因為料液濃縮時，膜表面被截留的溶質質量濃度不斷增加， 濃差極化不斷加強，特別是當料液質量濃度為100 g/L 時， 濃差極化比其他兩個質量濃度更為明顯，表現(xiàn)在滲濾時膜通量衰減更顯著，但是隨著滲濾的進行，濃差極化趨于穩(wěn)定，從而使得膜通量維持在較低的水平。 因此，在納濾濃縮階段，ε-PL 最高濃縮質量濃度為100 g/L左右。

表2 不同ε-PL 質量濃度下連續(xù)恒容滲濾脫鹽參數(shù)Table 2 Desalination parameters of continuous constant volume diafiltration at different concentrations of ε-PL

圖6 不同ε-PL 質量濃度下連續(xù)恒容滲濾膜通量的變化Fig. 6 Changes of permeate flux in continuous constant volume diafiltrationat at different concentrations of ε-PL

2.4 透析水添加方式對納濾膜SP800 滲濾脫鹽過程的影響

為了降低濃差極化現(xiàn)象和提高滲透速率，在納濾的脫鹽過程中向濃縮液中添加去離子水是一種十分有效的方法[24]。 表3 列出了三種透析水添加方式（間歇添加、連續(xù)流加和一次性添加）對脫鹽效率的影響。 可以看出，在基本相同的脫鹽效果下，連續(xù)恒容滲濾所消耗的去離子水量最少，操作時間最短且ε-PL 回收率要好于其他操作。 因此，連續(xù)恒容滲濾被確定為納濾脫鹽階段去離子的最佳添加方式。

表3 ε-PL 質量濃度為100 g/L 時不同操作模式脫鹽的比較Table 3 Comparison of desalination parameters at different operation methods under the ε-PL concentration of 100 g/L

2.5 納濾膜SP800 在ε-PL 分離提取工藝中的應用

表4 離交洗脫液納濾脫鹽實驗結果Table 4 Results of desalination experiment with the ε-PL eluent of from ion exchange step

為了評價納濾膜SP800 和脫鹽方式對真實物料的脫鹽效果， 我們將納濾膜面積放大到26.5 m2，并用于處理1 000 L 離子交換洗脫液， 結果見表4和圖7。 由圖7 可知，在納濾濃縮階段，隨著料液的濃縮倍數(shù)增大，透過液電導率逐漸增加，由起始6 mS/cm 上升到12 mS/cm； 但滲透速率卻迅速下降，由35 L/（m2·h）下降到18 L/（m2·h）。 在納濾脫鹽階段， 透過液電導率由最高值12 mS/cm 迅速下降至1 mS/cm，隨后緩慢下降；滲透通量由18 L/（m2·h）快速下降并穩(wěn)定在12 L/（m2·h）左右。 由表4 可知，納濾脫鹽過程中ε-PL 損失率僅為0.77%， 脫鹽率達到96.43%。 脫鹽后的樣品ε-PL 純度達到質量分數(shù)98.21%， 較脫鹽前提升了31.3%； 干燥樣品灰分為1.02%，低于國標GB2760-2014 灰分≤2.0%的要求。

圖7 納濾脫鹽過程中電導率和透過通量變化Fig. 7 Changes of conductivity and flux of permeate in the process of nanofiltration

3 結 語

作者建立了利用納濾膜對ε-PL 分離提取過程中離子交換洗脫液進行脫鹽的工藝。 通過考察純水透過通量、ε-PL 收率和脫鹽率， 確定了納濾膜SP800 用于ε-PL 脫鹽研究；基于單因素實驗優(yōu)化，以模擬料液為研究對象，確定了納濾膜SP800 脫鹽條件為：料液pH 值為9.0，最大濃縮倍數(shù)對應ε-PL濃度為100 g/L 左右， 再加入去離子水以恒容滲濾方式脫鹽， 直到透過液電導率低于300 μS/cm 為止。 最后，將該脫鹽工藝應用到1 000 L 真實物料，實現(xiàn)脫鹽率達到96.43%，ε-PL 損失率0.77%；冷凍干燥后的ε-PL 樣品純度達到98.21%， 灰分為1.02%，完全滿足國標GB2760-2014 對樣品中ε-PL純度和灰分的要求。