鐵釘菜水提醇沉上清液部分的抗氧化、抗酪氨酸酶活性及其沖劑的降糖作用

黃曉冬， 黃世英， 蔡建秀， 王玲平， 孫 波， 謝秋燕

（1. 泉州師范學(xué)院 海洋與食品學(xué)院， 福建 泉州362000；2. 華僑大學(xué) 福建省分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 福建 廈門361021；3. 福建省海洋藻類活性物質(zhì)制備與功能開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 泉州362000）

大型海藻資源豐富，自古以來(lái)是沿海居民藥食兩用的食材。 分布在我國(guó)東南沿海中、高潮帶巖礁的褐藻鐵釘菜（Ishige okamuraiYendo）系北太平洋西部特有的可食海藻，其甲醇提取物具有較高的多酚含量，甲醇提取物的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水等5 個(gè)萃取部分均具有一定的抗氧化活性與α-葡萄糖苷酶抑制活性[1-2]，80%甲醇提取物可通過(guò)改變肝葡萄糖代謝酶活性、改善胰島素抵抗起到降血糖的作用[3]。 考慮提取成本與應(yīng)用安全性的因素，結(jié)合前期鐵釘菜甲醇提取物水部位有抗氧化與α-葡萄糖苷酶抑制活性的基礎(chǔ)上，作者設(shè)計(jì)以水提醇沉法提取獲得鐵釘菜水提醇沉物與水提醇沉上清液部分，在初步比較兩者相關(guān)活性的前提下，選取水提醇沉上清液部分進(jìn)行抗氧化、抗酪氨酸酶活性研究，并進(jìn)行沖劑制備與體內(nèi)外降糖活性檢測(cè)，旨為鐵釘菜水提醇沉上清液部分的開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 鐵釘菜水提醇沉上清液部分的制備

新鮮鐵釘菜藻體采自福建泉州圍頭半島海域中、高潮帶巖礁，藻體剔除異物，清潔海水洗除雜質(zhì)，組織粉碎機(jī)粉碎后，按料液比（1 g∶30 mL）加蒸餾水，90～100 ℃水浴提取兩次，每次2 h，抽濾后取濾液減壓濃縮（-0.09 MPa，65 ℃）至一定體積，加入無(wú)水乙醇使體系中乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%，4 ℃醇沉24 h 后，4 000 r/min 離心5 min 得上清液與醇沉物。上清液減壓濃縮（-0.09 MPa，65 ℃），凍干后制得鐵釘菜水提醇沉上清液部分 （supernatants from water extracting-alcohol precipitation of Ishige okamurai，以下簡(jiǎn)稱SWEAPI）。

1.2 SWEAPI 的抗氧化活性測(cè)定

參照劉冬冬等[4]的方法測(cè)定DPPH 自由基清除活性，以維生素C 作為陽(yáng)性對(duì)照；參照黃曉冬等[5]的方法測(cè)定羥基自由基清除活性，以2，6-二叔丁基對(duì)甲酚BHT 為陽(yáng)性對(duì)照。以樣液濃度對(duì)清除率擬合回歸方程，求得半數(shù)效應(yīng)質(zhì)量濃度EC50。

1.3 SWEAPI 的抗酪氨酸酶活性測(cè)定

參照石嘉懌[6]的方法略加修改。 具體步驟為：取1.0 mL 樣 液，0.4 mL 100 U/mL 酪 氨 酸 酶 溶 液（50 mmol/L pH 6.8 磷 酸 鹽 緩 沖 液PBS 配 制），2.8 mL 0.5 mmol/L 多巴（L-DOPA）底物溶液，充分混勻后37 ℃水浴保溫10 min， 測(cè)波長(zhǎng)475 nm 處的吸光度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

酶活性抑制率的公式：

式中：As為樣液組的吸光度值；A0為空白對(duì)照組（以PBS 代替樣液） 的吸光度值；A1為空白對(duì)照組背景吸光度值（以PBS 代替樣液與酪氨酸酶溶液）；Ab為樣液背景吸光度值（以PBS 代替酪氨酸酶溶液）。

以樣液質(zhì)量濃度對(duì)抑制率擬合回歸方程，求得半數(shù)抑制質(zhì)量濃度IC50。

1.4 鐵釘菜沖劑的制備工藝條件優(yōu)選與質(zhì)量評(píng)價(jià)

1.4.1 制備工藝SWEAPI 與一定比例的可溶性淀粉、 甜蜜素、β-環(huán)狀糊精混合后， 稍加適量95%乙醇，制成捏可成團(tuán)、壓可散開的軟材，過(guò)40 目藥篩制粒，制粒后80 ℃干燥、整粒、紫外滅菌、密封包裝。

1.4.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)以SWEAPI 與可溶性淀粉、甜蜜素、β-環(huán)狀糊精的比例用量為因子， 設(shè)置三個(gè)水平進(jìn)行按L9（34）正交設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)，因子水平見表1。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果參考全山叢等[7]的評(píng)分方法進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，根據(jù)制粒難易程度、溶化性、溶化后固形物殘留量、味覺(jué)、感官性狀等分別等級(jí)評(píng)分，各項(xiàng)評(píng)分按權(quán)重折算求總分， 以此作為正交優(yōu)選的考察指標(biāo)，各項(xiàng)評(píng)分指標(biāo)與等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表1 制粒工藝試驗(yàn)因子水平表Table 1 Granulating process test factors and levels of orthogonal experiment

表2 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)與權(quán)重Table 2 Grading standard and proportion

1.4.3 鐵釘菜沖劑產(chǎn)品質(zhì)量的評(píng)價(jià)稱取0.25 g樣品置于盛有250 mL 生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)杯中，8 000~10 000 r/min 均質(zhì)2 min， 制成1∶1 000 的樣品勻液，按GB 4789.2-2010 的方法[8]進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)檢查， 微生物限量按保健 （功能） 食品通用標(biāo)準(zhǔn)GB 16740-1997[9]進(jìn)行描述；直接干燥法測(cè)定水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)[10]；苯酚-硫酸法測(cè)定總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)[11]，結(jié)果以葡萄糖計(jì)；凱式定氮法[12]測(cè)定沖劑蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)（考馬斯亮藍(lán)法[13]測(cè)上清液部分蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)）；福林酚法測(cè)定多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果以沒(méi)食子酸計(jì)[14]。

1.5 鐵釘菜沖劑對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制的測(cè)定

α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定參照Li T 等[15]的方法。在96 孔酶標(biāo)板上依次加入112 μL 0.1 mol/L PBS （pH 6.8），20 μL 0.2 U/mL α-glucosidase，8 μL樣液 （以二甲亞砜DMSO 配制），37 ℃恒溫15 min后加入2.5 mmol/L 4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷PNPG 20 μL，經(jīng)反應(yīng)15 min 后加入80 μL 0.2 mol/L的Na2CO3溶液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀405 nm 波長(zhǎng)下測(cè)吸光度值，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次，取平均值。

酶活性抑制率的公式：

式中：A1為樣液組的吸光度值；A2為以PBS 代替酶溶液測(cè)得的樣液組背景吸光度值；A3為以DMSO 代替樣液測(cè)得的空白對(duì)照組吸光度值；A4為以DMSO代替樣液與PBS 代替酶溶液測(cè)得的空白對(duì)照組背景吸光度值。

1.6 鐵釘菜沖劑對(duì)四氧嘧啶致糖尿病小鼠模型的的降糖作用

雄性、體質(zhì)量（22±1） g 的SPF 級(jí)健康KM 小鼠（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供， 許可證號(hào)為SCXK（滬）2012-0002）于鼠房適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，食量適當(dāng)，飲水充足，保持鼠房溫度18～20 ℃。 3 d后禁食不禁水12 h，按200 mg/kg 劑量腹腔注射2%四氧嘧啶溶液（無(wú)菌生理鹽水配制）， 隨機(jī)選取10只小鼠作為正常組（NC）腹腔注射等體積的生理鹽水。1 h 后恢復(fù)正常飲食，3 d 后斷尾取血（取血前小鼠禁食不禁水12 h）， 血糖儀 （三諾安穩(wěn)YZBI 湘004-2012， 長(zhǎng)沙三諾生物傳感技術(shù)股份有限公司）測(cè)血糖值，隔天再測(cè)一次血糖，以血糖值穩(wěn)定并且大于11.1 mmol/L 且出現(xiàn)多飲、多食、多尿現(xiàn)象的小鼠視為造模成功。

將建模成功的糖尿病小鼠按體質(zhì)量、血糖值分為5 組，各組動(dòng)物血糖平均差值不大于0.5 mmol/L，每組10 只，分別記為糖尿病模型對(duì)照組（MC）、陽(yáng)性對(duì)照鹽酸二甲雙胍組（MH，500 mg/kg）、鐵釘菜沖劑低劑量組 （LI，350 mg/kg）、 鐵釘菜沖劑中劑量組（MI，700 mg/kg）、 鐵釘菜沖劑高劑量組（HI，1400 mg/kg）。給藥組每天下午5 時(shí)按劑量灌胃給藥一次，正常組和模型組每天給予等量的生理鹽水， 連續(xù)14 d。每7 天測(cè)一次空腹血糖 （晚餐后禁食不禁水12 h，次日早晨7～8 時(shí)測(cè)定血糖值）。 實(shí)驗(yàn)?zāi)?，參考陳玲玲等[16]的方法測(cè)定糖耐量，即測(cè)空腹血糖值后按劑量灌胃1 次，20 min 后灌胃葡萄糖2.0 g/kg，測(cè)定給葡萄糖后0.5、1、2 h 的血糖值。

2 結(jié)果與分析

2.1 SWEAPI 的抗氧化活性

2.1.1 SWEAPI 對(duì)DPPH 自由基的清除作用不同質(zhì)量濃度的SWEAPI 樣液對(duì)DPPH 自由基的清除作用見圖1。 在質(zhì)量濃度0～2.0 mg/mL 范圍內(nèi)，SWEAPI 對(duì)DPPH 自由基清除的量效關(guān)系均隨樣液質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，2.0 mg/mL 時(shí)DPPH 自由基清除率可達(dá)（73.66±1.53）%，劑量-效應(yīng)呈現(xiàn)極顯著的正相關(guān) （P＜0.01）， 滿足線性回歸方程y=36.218x+7.230（R2=0.952 6，P＜0.01）。 由此方程可計(jì)算出SWEAPI 清除DPPH 自由基的半效應(yīng)質(zhì)量濃度為EC501.18 mg/mL，與本實(shí)驗(yàn)測(cè)得的0.054 mg/mL VC具有等效作用。

圖1 鐵釘菜水提醇沉上清液部分對(duì)DPPH 自由基的清除作用Fig. 1 DPPH radical scavenging effect of SWEAPI

2.1.2 SWEAPI 對(duì)羥基自由基的清除作用在質(zhì)量濃度0～8.0 mg/mL 范圍內(nèi)，SWEAPI 對(duì)羥基自由基的清除能力隨樣液質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，見圖2。量效關(guān)系滿足logistic 方程，經(jīng)擬合并計(jì)算出其EC50為5.08 mg/mL，與3.04 mg/mL 的人工合成抗氧化劑2，6-二叔丁基對(duì)甲酚BHT 等效。

圖2 鐵釘菜水提醇沉上清液部分對(duì)羥基自由基的清除作用Fig. 2 Hydroxy radical scavenging effect of SWEAPI

2.2 SWEAPI 的抗酪氨酸酶活性

SWEAPI 對(duì)酪氨酸酶活性的影響見圖3。 圖3顯示，SWEAPI 具有較強(qiáng)的酪氨酸酶活性抑制作用，在質(zhì)量濃度為0.25～6.0 mg/mL 范圍內(nèi)，酶活抑制率為（24.51±2.04）%～（88.37±5.43）%，酶活抑制率隨樣液質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)， 呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)的量效關(guān)系（P＜0.01），經(jīng)非線性方程擬合并計(jì)算出其對(duì)酪氨酸酶活性的半抑制質(zhì)量濃度IC50為1.27 mg/mL。

2.3 鐵釘菜沖劑的制備工藝與產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.3.1 鐵釘菜沖劑的制備工藝優(yōu)化以SWEAPI與可溶性淀粉、 甜蜜素、β-環(huán)狀糊精的比例用量為因子，設(shè)置三個(gè)水平進(jìn)行按L9（34）正交設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與綜合評(píng)分見表3，方差分析見表4。

圖3 鐵釘菜水提醇沉上清液部分對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用Fig. 3 Tyrosinase inhibiting effect of SWEAPI

表3 鐵釘菜沖劑制粒工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Orthogonal experiment design and results of granulation process of Ishige okamurai granules

表4 方差分析表Table 4 Analysis of variance

由表3～4 可以看出， 可溶性淀粉， 甜蜜素與SWEAPI 比例以及β-環(huán)狀糊精的使用量對(duì)沖劑制備均有顯著影響，影響大小依次為A＞B＞C，優(yōu)化的工藝條件為A1B1C2，即SWEAPI 與可溶性淀粉比例為1∶2，SWEAPI 與甜蜜素比例為30∶1，β-環(huán)狀糊精∶SWEAPI 比例為25∶100， 也就是SWEAPI∶可溶性淀粉∶甜蜜素∶β-環(huán)狀糊精為30∶60∶1∶7.5 的質(zhì)量配比。按此工藝條件鐵釘菜沖劑制粒容易、 溶化性較好、腥味少、甜味適中，具海藻類特有的氣味。

2.3.2 鐵釘菜沖劑的產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)實(shí)驗(yàn)測(cè)得鐵釘菜沖劑的含水量約為6.3 %，水分要求符合GB/T 29602-2013[17]固體飲料不高于7 %的規(guī)定；細(xì)菌總數(shù)≤1 000 cfu/mL，符合保?。üδ埽┦称吠ㄓ脴?biāo)準(zhǔn)GB 16740-1997 規(guī)定的衛(wèi)生要求； 總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為18.74%； 凱式定氮法測(cè)得蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)16.60%（考馬斯亮藍(lán)法測(cè)得SWEAPI 蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為21.68%）；多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.53%（SWEAPI 多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.30%）。

2.4 鐵釘菜沖劑的α-葡萄糖苷酶抑制活性

鐵釘菜沖劑對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響結(jié)果見圖4。 由圖4 可知，鐵釘菜沖劑對(duì)α-葡萄糖苷酶活性表現(xiàn)為較強(qiáng)的抑制作用，樣液質(zhì)量濃度0.50 mg/mL時(shí)，酶活抑制率可達(dá)87.95 %，在0.17～0.50 mg/mL的測(cè)量質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，量效滿足線性回歸方程y= 269.04x－50.185（R2-0.977，P＜0.01），呈現(xiàn)極顯著的正相關(guān)（P＜0.01），半抑制質(zhì)量濃度IC50為0.37 mg/mL。

圖4 鐵釘菜沖劑對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制Fig. 4 Inhibitory activity of Ishige okamurai granules against α-glucosidase

2.5 鐵釘菜沖劑對(duì)四氧嘧啶致糖尿病小鼠的的降糖作用

以四氧嘧啶致糖尿病小鼠模型研究鐵釘菜沖劑的降糖作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。 由表5 可知，與模型組比較， 釘釘菜沖劑各劑量組在觀測(cè)時(shí)程7 d 與14 d 內(nèi)均有一定的降血糖作用，差異具有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），并且各劑量組降糖作用與鹽酸二甲雙胍組的降糖作用差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），14 d 時(shí)各劑量組間降糖作用差異也不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明鐵釘菜沖劑350 mg/kg的使用劑量已能有效發(fā)揮降血糖效果。

表5 鐵釘菜沖劑對(duì)四氧嘧啶致糖尿病小鼠模型血糖值的影響（n=10）Table 5 Effect of Ishige okamurai granules on blood glucose value in alloxan-induced diabetic mice

一般來(lái)講， 在口服葡萄糖后，0.5～1 h 時(shí)血清葡萄糖水平升高達(dá)峰值，2 h 后恢復(fù)至空腹血糖值。 由表6 可看出，鐵釘菜沖劑各劑量組小鼠在口服葡萄糖后的血糖值在每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著低于模型對(duì)照組（MC）血糖值（P＜0.01），說(shuō)明鐵釘菜沖劑可以在短時(shí)間內(nèi)降低餐后血糖，并且其降糖效果與陽(yáng)性藥物二甲雙胍相近（P＞0.05）。

表6 鐵釘菜沖劑對(duì)四氧嘧啶致糖尿病小鼠模型糖耐量的影響（n=10）Table 6 Effect of Ishige okamurai granules on glucose tolerance in alloxan-induced diabetic mice

3 結(jié) 語(yǔ)

水提醇沉法（水醇法）系指在樣品的水提濃縮液中加入乙醇使達(dá)不同含醇量， 使得某些化學(xué)成分在醇溶液中溶解度降低而析出沉淀， 固液分離后分別獲得水提醇沉物與水提醇沉上清液部分， 該法可避免毒性較大有機(jī)溶劑的應(yīng)用，降低后續(xù)處理的成本，是精制水提液的簡(jiǎn)單方法。 作者采用水醇法制得鐵釘菜水提醇沉物（EWEAPI） 與水提醇沉上清液部分（SWEAPI）， 經(jīng)DPPH 自由基清除反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，SWEAPI較之EWEAPI 具有較強(qiáng)的DPPH 自由基清除能力，半效應(yīng)質(zhì)量濃度EC50為1.19 mg/mL； 清除羥基自由基的EC50為5.08 mg/mL，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性。研究指出，海藻由于生境的特殊性使其具有與陸岸植物差異較大的化學(xué)組成，存在著多糖、多酚等各種抗氧化活性成分， 是天然抗氧化劑開發(fā)的潛在資源[18]。SWEAPI 的抗氧化活性可能與其較高的多酚含量（8.30%）有關(guān)。 多酚的酚羥基結(jié)構(gòu)往往使其具有較強(qiáng)的還原性和自由基捕捉活性，這種活性以及絡(luò)合酪氨酸酶分子中Cu2+的可能性還可使之具有抑制該酶活力的作用[19]。 我們的前期研究已經(jīng)證實(shí)鐵釘菜甲醇提取物具有較高的多酚含量與明顯的酪氨酸酶抑制作用[1]，本實(shí)驗(yàn)中SWEAPI 亦表現(xiàn)出較強(qiáng)的酪氨酸酶抑制活性，半抑制質(zhì)量濃度IC50為1.27 mg/mL。酪氨酸酶過(guò)量表達(dá)與人體雀斑、黃褐斑與老年班等色素沉著性疾病有關(guān)，SWEAPI 的抗氧化、 抗酪氨酸酶活性有望使之成為開發(fā)海藻源抗氧化型、美白護(hù)膚品的良好基料。

海藻在降血糖方面亦有獨(dú)特的功效，羊棲菜多糖[20]、多管藻總酚[21]、海帶多糖[22]、泡葉藻多糖與多酚組分[23]等均表現(xiàn)出降血糖活性。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SWEAPI具有較強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制活性， 提示其作為α-葡萄糖苷酶抑制劑開發(fā)的可行性。 研究指出α-葡萄糖苷酶抑制劑可延緩或阻礙碳水化合物的消化，延遲葡萄糖的吸收，其作用過(guò)程溫和持久、毒副作用小，為降餐后血糖的首選藥物[2]。 因此，我們選擇SWEAPI 與可溶性淀粉、 甜蜜素以及β-環(huán)狀糊精按比例進(jìn)行沖劑制備，經(jīng)正交設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)優(yōu)化出SWEAPI∶可溶性淀粉∶甜蜜素∶β-環(huán)狀糊精為質(zhì)量比30∶60∶1∶7.5 的鐵釘菜沖劑制備工藝， 按此工藝條件制粒容易、溶化性較好、腥味降低、甜味適中。 該沖劑的體外α-葡萄糖苷酶半抑制質(zhì)量濃度IC50為0.37 mg/mL，350 mg/kg 灌胃給藥14 d 對(duì)四氧嘧啶致糖尿病小鼠模型的降糖作用與鹽酸二甲雙胍組（500 mg/kg）的降糖作用差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），并且能短時(shí)間內(nèi)降低餐后血糖，這說(shuō)明鐵釘菜沖劑在長(zhǎng)時(shí)間和短時(shí)間內(nèi)均能發(fā)揮一定的降血糖效果，其原因是否與α-葡萄糖苷酶抑制、清除自由基、激活胰島素分泌相關(guān)仍需深入的研究。