噴霧干燥對德氏乳桿菌代謝酶活與可培養(yǎng)性的影響

蔣艾廷， 李寶坤， 金 丹， 喬傳麗， 楊 婕， 趙利利

（石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子832000）

乳酸菌（lactic acid bacteria）是一類能夠發(fā)酵乳糖生成乳酸的革蘭氏陽性益生菌，對人體健康起著至關(guān)重要的作用[1]。 通常人們通過食用含活菌制品或含菌體組分及代謝產(chǎn)物的死菌制品來維持人體腸道內(nèi)的菌群平衡，發(fā)酵乳制品因其豐富的營養(yǎng)價值與益生作用受到許多消費者的青睞[2-4]，發(fā)酵劑中乳酸菌的細胞活力與細胞數(shù)量是影響發(fā)酵食品質(zhì)量的關(guān)鍵因素[5]。 目前，乳酸菌發(fā)酵劑的生產(chǎn)方式主要為冷凍干燥和噴霧干燥[6]。 噴霧干燥是在干燥室利用熱空氣，將進料溶液霧化，去除水蒸氣得到干粉物質(zhì)。 與冷凍干燥相比，噴霧干燥設(shè)備投入低、操作簡單、容易擴大規(guī)模和連續(xù)生產(chǎn)[7-10]。 但是，高溫、干燥、氧化等環(huán)境使菌體遭受到嚴(yán)重的損傷或大量死亡[11-13]。 多年以來，國內(nèi)外針對噴霧干燥導(dǎo)致乳酸菌活力低下的問題，開展了大量的研究工作。 在乳酸菌噴霧干燥方面，深入研究乳酸菌在噴霧干燥過程中的微生物學(xué)性質(zhì)與存活機理， 結(jié)合添加保護劑、乳酸菌收獲階段、脅迫處理和噴霧干燥工藝參數(shù)選擇等多種手段，提高乳酸菌的活力一直是乳酸菌噴霧干燥研究的重點[14-16]。

目前，我國商業(yè)化發(fā)酵劑生產(chǎn)廠家較少，發(fā)酵劑市場被國外公司壟斷。 作者以德氏乳桿菌（lactobacillus delbrueckii）ATx（KY310724）為研究對象，檢測細胞的亞致死溫度以及分析在噴霧干燥過程中保護劑對細胞存活率、細胞膜ATP 酶、糖代謝關(guān)鍵酶和產(chǎn)酸性能的影響，為乳酸菌噴霧干燥提供理論支持，促進我國發(fā)酵劑的工業(yè)化生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗菌株： 德氏乳桿菌（lactobacillus delbrueckii）ATx（KY310724），從新疆塔城地區(qū)傳統(tǒng)酸奶中分離，由石河子大學(xué)食品學(xué)院保存。

MRS 肉湯：青島海博生物技術(shù)有限公司；考馬斯亮藍G-250：美國Amresco 公司；己糖激酶（HK）、Ca2+Mg2+、Na+K+、總ATP 酶試劑盒：南京建成生物公司；乳酸脫氫酶試劑盒（LDH）：北京索萊寶科技有限公司；保護劑：20%脫脂乳（SM）、12%脫脂乳+8%菊糖（SMS）、12%脫脂乳+8%海藻糖（SMT）、12%脫脂乳+4%菊糖+4%海藻糖（SMST），105 ℃滅菌20 min。

1.2 主要儀器設(shè)備

VCX500 型超聲波細胞破碎儀： 美國Sonics 公司；SD-100 型噴霧干燥機：日本EYELA（東京理化）東京理化器械株式會社；Neoluge 15R 型臺式高速冷凍離心機：香港力康發(fā)展有限公司；752 型紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；DNP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱： 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；LDZX-30KBS 型電熱蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2D 型超凈工作臺：蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 細胞前處理乳酸脫氫酶（LDH）的測定：收集乳酸菌細胞到5 mL 離心管（8 000 r，4 ℃，10 min），倒掉上清液， 加入5 mL 提取液， 冰水浴超聲破碎（功率200 W，超聲3 s，間隔10 s，重復(fù)30 次），在4 ℃下8 000 r 離心10 min，取上清液，置于冰上待測；己糖激酶（HK）的測定：取5mL 菌液在室溫下，1 000 r/min離心10 min，倒掉上清液用PBS 緩沖液（0.1 mol/L，pH 6.8）洗滌2 次后重懸，進行超聲破碎（功率300 W，每次3~5 s，間隔4 次，間隔30 s，冰水?。?；細胞ATP酶的測定：取5 mL 菌液離心（2 500 r，10 min）棄上清液，留下層細胞，用PBS 緩沖液（0.1 mol/L，pH 6.86）重懸超聲，條件同上，破碎好的細胞懸浮液直接用于以上酶活的檢測。

1.3.2 熱處理將培養(yǎng)至對數(shù)末期（16~18 h）的德氏乳桿菌濃縮富集至11 lg CFU/mL 左右，離心（4 ℃，6 000 r，10 min）， 用pH 6.86 的PBS 緩沖液洗滌2次，在相同的條件下離心重懸。 將細胞用漩渦混勻儀混勻， 分別置于46、50、54、58 ℃處理3、6、9、12、15 min，以未經(jīng)過熱處理的細胞作為對照，測定其細胞活菌數(shù)的變化。

1.3.3 噴霧干燥將50 mL 已配好的保護劑加入經(jīng)過熱處理后離心的菌泥中， 同時以添加50 mL PBS 作為對照，進行噴霧干燥。 噴霧干燥條件為：入口溫度150 ℃；出口溫度70～74 ℃；進料流量300 mL/h；熱空氣流量0.5 m3/h；噴霧壓力15×10 kPa。

1.3.4 蛋白質(zhì)的測定采用考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)[17]。

1.3.5 酶活與細胞可培養(yǎng)性的測定己糖激酶（HK）、丙酮酸激酶（PK）、乳酸脫氫酶（LDH）的測定： 采用北京索萊寶科技有限公司的相應(yīng)試劑盒；可培養(yǎng)性的測定： 通過將經(jīng)過噴霧干燥的菌粉，重新溶解于相同體積的PBS 緩沖液中，采用菌落平板計數(shù)法計算活菌數(shù)。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用Oringin 2016 軟件作圖， 利用Minitab 16 軟件中的Fisher 單因子多重比較對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析，置信水平為95%，“*”或不同字母表示差異顯著（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱脅迫對細胞可培養(yǎng)性的影響

收集對數(shù)末期的菌體， 重懸于PBS 緩沖液中，通過不同溫度熱處理后，以未經(jīng)熱處理的菌體作為對照，結(jié)果見圖1。當(dāng)熱脅迫溫度低于50 ℃時，德氏乳桿菌的活菌數(shù)隨著溫度的逐漸升高變化不明顯；當(dāng)熱處理溫度高于50 ℃時， 德氏乳桿菌的活菌數(shù)隨著溫度的升高顯著下降。 當(dāng)?shù)率先闂U菌在46 ℃脅迫0～15 min 時， 活菌數(shù)僅下降0.08 lg CFU/mL，幾乎未發(fā)生死亡。 當(dāng)?shù)率先闂U菌在50 ℃脅迫0～15 min 時，活菌數(shù)下降0.107 lg CFU/mL，與未經(jīng)熱脅迫的對照相比，差異不顯著。 當(dāng)?shù)率先闂U菌在54 ℃處理時，從第3～15 分鐘開始，活菌數(shù)均顯著地下降（P＜0.05），活菌數(shù)從10.57 lg CFU/mL 下降至8.58 lg CFU/mL，降低了1.99 lg CFU/mL。 當(dāng)熱脅迫溫度為58 ℃時，德氏乳桿菌大量的死亡，熱脅迫3 min 時，活菌數(shù)從10.55 lg CFU/mL 下降為8.60 lg CFU/mL，隨后依次顯著的下降（P＜0.05），當(dāng)熱脅迫時間為15 min 時，德氏乳桿菌的活菌數(shù)僅為5.62 lg CFU/mL，降低了4.93 lg CFU/mL。

研究[18]發(fā)現(xiàn)，乳酸菌的最適生長溫度集中在30～37 ℃， 噴霧干燥過程中的過高的溫度導(dǎo)致菌體細胞大量脫水、細胞膜受到損害，從而造成菌體失活[19]。 自然狀態(tài)下的大多數(shù)微生物在生長過程中均受到各種脅迫環(huán)境的影響，微生物在各種脅迫環(huán)境下具有自我調(diào)控能力，并通過各種生理反應(yīng)來適應(yīng)不利環(huán)境[20]。 乳酸菌在高溫條件下通常會發(fā)生熱應(yīng)激。 熱應(yīng)激是生物在高于正常生理溫度環(huán)境下抵御高溫環(huán)境的應(yīng)激反應(yīng)[21]。目前，通過熱脅迫來提高乳酸菌在噴霧干燥中的活菌數(shù)是常用的技術(shù)手段之一。 乳酸菌受到熱脅迫后可以調(diào)控自身的防御系統(tǒng)來調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達和代謝途徑，產(chǎn)生一系列熱激蛋白以降低或消除熱脅迫的傷害。Lavari[22]發(fā)現(xiàn)溫和的熱脅迫能夠有效的減少乳酸菌在噴霧干燥中的死亡，Desmond[23]發(fā)現(xiàn)采用亞致死溫度進行熱脅迫能夠提高乳酸菌對高溫的耐受性。 因此作者選擇46～58 ℃作為熱脅迫的溫度，發(fā)現(xiàn)乳酸菌經(jīng)50 ℃脅迫15 min 后，活菌數(shù)未發(fā)生明顯變化（P≥0.05），選擇其作為熱脅迫的條件，這與Zhang Yun 等[24]的研究結(jié)果相同。

2.2 保護劑對細胞可培養(yǎng)性的影響

噴霧干燥是一個劇烈的、 綜合的脅迫過程，涉及到脫水干燥、高滲脅迫、高溫脅迫等，導(dǎo)致菌體的活菌數(shù)降低。 在發(fā)酵劑的制備過程中，保護劑對生物體或生物大分子具有良好的非特異性保護作用，能有效提高噴霧干燥過程中乳酸菌的活菌數(shù)[25]。 采用20 g/dL 脫脂乳、12 g/dL 脫脂乳+8 g/dL 菊糖、12 g/dL脫脂乳+ 8 g/dL 海藻糖及12 g/dL 脫脂乳+4 g/dL 菊糖+4 g/dL 海藻糖作為保護劑，與不加護劑的菌體為對照，進行噴霧干燥。 由圖2 可以看出，添加保護劑能夠有效提高德氏乳桿菌的細胞活菌數(shù)，不同的保護劑對德氏乳桿菌的保護效果是有差異的。 未添加保護劑的菌液經(jīng)過噴霧干燥后的活菌數(shù)明顯的降低（P＜0.05），降低了2.29 lg CFU/mL，SMS 對德氏乳桿菌的保護效果最好，經(jīng)過噴霧干燥后，活菌數(shù)降低較小，與對照組相比，無明顯差異。 其次對德氏乳桿菌保護較好的是SMST 與SMT，經(jīng)過噴霧干燥后活菌數(shù)分別降低了0.21 lg CFU/mL 與0.36 lg CFU/mL，與對照組相比具有顯著差異（P＜0.05）。SM 對的德氏乳桿菌的保護效果相對弱于前三種， 經(jīng)噴霧干燥后，活菌數(shù)下降了0.92 lg CFU/mL。

圖2 保護劑對細胞可培養(yǎng)性的影響Fig. 2 Influence of protective agent on cell culturability

研究表明，脫脂乳粉是制備發(fā)酵劑時運用最廣泛的保護劑之一[26]，其中的乳糖和乳清蛋白能對菌種產(chǎn)生較好的保護作用，通常以“包埋”的形式將菌體與外界不利環(huán)境隔離，減少因細胞壁損傷而引起的胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，起到保護菌體的作用。 此外，一些糖類物質(zhì)也能夠提高干燥過程中菌體細胞膜和蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，從而提高細胞的活力[27]。以功能性低聚糖作為益生菌的保護劑能夠促進動物機體健康和調(diào)節(jié)腸道微生物體系平衡等保健作用[28]。 本研究選取的四種保護劑均能夠提高乳酸菌在噴霧干燥過程中細胞膜的穩(wěn)定性，減少高溫、脫水等不利環(huán)境對細胞膜的損傷，從而達到保護細胞的作用。

2.3 保護劑對細胞己糖激酶與乳酸脫氫酶的影響

己糖激酶（HK）與乳酸脫氫酶（LDH）是糖代謝途徑中的關(guān)鍵酶，廣泛的存在于各種動物、植物、微生物與培養(yǎng)細胞中，己糖激酶是糖代謝途徑中的第一個酶，其活性大小與糖代謝速率相關(guān)，乳酸脫氫酶是糖代謝途徑的末端酶，催化丙酮酸與乳酸之間的可逆反應(yīng)， 其活性大小與微生物的產(chǎn)酸能力有關(guān)。 作者測定保護劑對德氏乳桿菌噴霧干燥菌粉的己糖激酶與乳酸脫氫酶活力的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 保護劑對細胞己糖激酶與乳酸脫氫酶的影響Fig. 3 Influence of protective agent on cell hexokinase and lactate dehydrogenase

由圖3 可以看出，保護劑對德氏乳桿菌乳酸脫氫酶活力的影響為：SMS＞SMST ＞SMT ＞SM＞PBS。對己糖激酶活力的影響為：SMS＞SMST＞SMT＞SM＞PBS。經(jīng)過PBS 處理的菌液噴霧干燥后，乳酸脫氫酶與己糖激酶的活力分別由6.039 4 U/mg 與8.137 8 U/g 下降為1.524 9 U/mg 與2.454 6 U/g， 大約降低了4 倍。通過添加SMS 的德氏乳桿菌乳酸脫氫酶與己糖激酶活力分別由6.039 4 U/mg 與8.137 8 U/g下降為4.967 5 U/mg 與6.971 6 U/g，下降了1.21 與1.17 倍， 其余三種保護劑的保護效果均弱于SMS。經(jīng)過噴霧干燥后，已糖激酶與乳酸脫氫酶的活性均有不同程度的下降。 但也可以看出，未添加保護劑的噴霧干燥菌粉的兩種酶，活力最低，說明保護劑能夠減小己糖激酶與乳酸脫氫酶活力的損失。 此外，保護劑的成分對酶活的損失也有一定的影響。

2.4 保護劑對細胞Ca2+Mg2+、Na+K+與總ATP 酶的影響

ATP 酶廣泛存在于組織細胞及細胞器的膜上，是生物膜上的一種蛋白酶，它在物質(zhì)運送、能量轉(zhuǎn)換以及信息遺傳方面具有重要的作用，細胞在缺氧或者一些其他脅迫狀態(tài)下， 此酶活力會發(fā)生改變。作者測定保護劑對德氏乳桿菌噴霧干燥菌粉的Ca2+Mg2+、Na+K+與總ATP 酶活力的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4 可知， 在噴霧干燥過程中SM、SMS、SMT、SMST 能夠?qū)Φ率先闂U菌提供一定的保護效果。 添加四種保護劑的乳酸菌經(jīng)過噴霧干燥后細胞膜的Ca2+Mg2-ATPase 與Na+K+-ATPase 活力均明顯（P＜0.05）高于PBS 組，但四種保護劑之間無明顯差異。 添加四種保護劑的乳酸菌經(jīng)過噴霧干燥后細胞膜的總ATP 酶活力也均高于PBS 組（P＜0.05），但四種保護劑對總ATP 酶活力的影響有顯著的差異，其中，SMS 對細胞膜總ATP 酶活力影響最大，與噴霧前的菌體酶活相比，僅下降了0.059 53 U/mg，與對PBS組相比，酶活提高了0.206 07 U/mg。 SM 與SMST 對細胞膜總ATP 酶的影響差異不明顯， 與噴霧前的菌體酶活相比分別下降了0.144 43、0.134 07 U/mg，與對PBS 組相比， 酶活分別提高了0.121 17、0.131 53 U/mg。SMT 對細胞膜總ATP 酶活力的保護效果明顯弱于（P＜0.05）前三種保護劑，但與PBS 組相比也具有明顯（P＜0.05）的效果。

圖4 保護劑對細胞膜ATP 酶的影響Fig. 4 Influence of protective agent on cell membrane ATPase

2.5 保護劑對乳酸菌產(chǎn)酸性能的影響

在發(fā)酵乳制品的加工與制造的過程中，乳酸菌能將原料乳中的乳糖分解成葡萄糖與半乳糖，葡萄糖進一步分解成乳酸， 使pH 逐漸降低達到酪蛋白的等電點4.6 左右時，牛乳開始凝固。乳酸菌的產(chǎn)酸特性能夠直接關(guān)系到產(chǎn)品的最終質(zhì)量，本研究測定了在42 ℃的條件下經(jīng)不同保護劑處理的德氏乳桿菌在12%的脫脂乳中的產(chǎn)酸情況，見圖5。

由圖5 可知，經(jīng)過四種保護劑處理的德氏乳桿菌在12 g/dL 的脫脂乳中生長良好， 經(jīng)過發(fā)酵16 h后，脫脂乳的pH 值由6.37 下降至4.0 以下，凝乳時間在8～10 h 之間。 在0～2 h 時，脫脂乳的pH 幾乎未發(fā)生改變，pH 值僅下降0.08； 發(fā)酵2 h 后脫脂乳的pH 開始逐漸的下降，當(dāng)發(fā)酵時間為4～6 h 時，脫脂乳pH 下降的速率最大；當(dāng)發(fā)酵時間至8 h 時，脫脂乳開始凝固，凝乳時間：SMS＜SMST＜SMT＜SM。 隨后脫脂乳的pH 下降速率逐漸變緩，發(fā)酵16 h 后脫脂乳的pH 基本不再改變。

圖5 保護劑對乳酸菌產(chǎn)酸性能的影響Fig. 5 Influence of protective agent on acid-producing?ability of lactic acid bacteria

3 結(jié) 語

在噴霧干燥過程中，不同保護劑對德氏乳桿菌ATx 的保護效果不同， 四種保護劑對噴霧干燥活菌數(shù)的保護效果為：SMS＞SMST＞SMT＞SM， 說明SMS可以有效降低（P＜0.05）德氏乳桿菌ATx 的死亡。 也可以看出，在12 g/dL 脫脂乳的基礎(chǔ)上，8 g/dL 菊糖的保護效果優(yōu)于8 g/dL 海藻糖。 同時測定了噴霧干燥對細胞膜ATP 酶活力的影響，四種保護劑對細胞膜ATP 酶的保護效果均為：SMS＞SMST＞SMT＞SM。與其它三種保護劑相比，SMS 能夠有效的保護細胞膜，提高細胞膜的穩(wěn)定性，同時也說明噴霧干燥中德氏乳桿菌細胞的死亡與細胞膜ATP 酶有密切的關(guān)系。 四種噴霧干燥菌粉在脫脂乳中均能正常生長，凝乳時間為8～10 h。 由于真空冷凍干燥制備乳酸菌發(fā)酵劑價格昂貴、操作復(fù)雜[29]，而噴霧干燥具有低成本、產(chǎn)品保存時間長、運輸方便等優(yōu)點[30]，因此利用噴霧干燥制備乳酸菌發(fā)酵劑很有前景。 本研究為乳酸菌的噴霧干燥技術(shù)提供理論支持，但針對乳酸菌噴霧干燥的工藝與發(fā)酵劑貯藏條件還需要后續(xù)深入研究。