用于丁酸香葉酯合成的褶皺假絲酵母脂肪酶固定化

王 璐， 馮 骉

（江南大學 食品學院，江蘇 無錫214122）

脂肪酶（Lipase，EC3.1.1.3）甘油三酰酯水解酶是一類重要的工業(yè)酶，可以在油水界面上催化甘油三酯水解生成脂肪酸和甘油以及甘油一酯和甘油二酯，廣泛存在于動物、植物各種組織及微生物中，是最早研究的酶類之一[1]，在有機溶劑中，它還可以催化轉(zhuǎn)酯化、酯類逆向合成、聚合物合成、生物活性劑合成以及藥物合成等反應(yīng)。 利用一些脂肪酶的立體專一性，催化旋光異構(gòu)體的拆分[2]和手性藥物的合成[3]已成為酶工程領(lǐng)域新的研究熱點。 脂肪酶及其改性制劑在食品、化工、造紙、油脂以及制藥等行業(yè)已得到廣泛應(yīng)用。

丁酸香葉酯天然存在于薰衣草油等精油中，主要用作玫瑰、金合歡、天竺葵、鈴蘭、香葉、薰衣草等香精的調(diào)和香料，也用于食品香精的調(diào)配中，如冰淇淋、口香糖、糕點、糖果等。 其用途雖廣，但天然來源有限[4]，目前主要依靠工業(yè)合成。 傳統(tǒng)的合成方法是化學合成，得到的是混合物，后續(xù)分離的成本較高；且由于使用濃硫酸作催化劑，存在嚴重腐蝕設(shè)備及需要三廢處理等缺點[5]。 酶法因反應(yīng)條件溫和、轉(zhuǎn)化率高和無副反應(yīng)等優(yōu)勢受到研究者的青睞。 在國內(nèi)，肖彬曾報道使用酶法合成丁酸香葉酯，酯化率達到92%[6]， 但未具體說明實驗方法以及所用的酶，且沒有后續(xù)報道。 國外對脂肪酶催化合成丁酸香葉酯的研究多一些，隨著合成方法以及選用酶的不同，酯化率差異較大。 Chwen-Jen Shieh 利用脂肪酶AY 催化三丁酸甘油酯與香葉醇進行轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)生成丁酸香葉酯，并通過響應(yīng)面法和五水平五變量中心復(fù)合旋轉(zhuǎn)設(shè)計法，確定最佳反應(yīng)條件，最終摩爾酯化率為96.8%[7]。 Sylviane Pulvin 利用毛霉酯酶催化合成丁酸香葉酯，研究水分活度與酶活性的的關(guān)系，最高酯化率可達到75%[8]。

褶皺假絲酵母脂肪酶 （Candida rugosalipase，CRL）對人類和其他生物都是安全和無副作用的，并且已實現(xiàn)商品化， 廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、 油脂加工、食品、日化等工業(yè)，是目前為止全世界工業(yè)中應(yīng)用最廣泛的商品化脂肪酶之一。 然而，游離態(tài)酶在應(yīng)用過程中存在易結(jié)塊、易失活、不易回收、難以重復(fù)利用等問題，而且脂肪酶的價格較高，不利于推廣應(yīng)用。 為了降低脂肪酶的使用成本，提高其穩(wěn)定性和活力，實現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)，許多研究者開展了固定化脂肪酶的研究，Jasmina J. Damnjanovic 利用Sepabeads?EC-EP 樹脂對CRL 固定化， 反應(yīng)48 h酯化率為99%[9]。 對于脂肪酶的固定化，國內(nèi)外的研究重點主要集中在固定化載體的選擇與固定化條件的優(yōu)化上[10]，而載體大多為多孔和大孔材料[11]。 其中大孔離子交換樹脂和吸附樹脂吸附脂肪酶，具有吸附容量大、機械強度高、再生處理方便等優(yōu)點，且吸附法處理條件溫和，酶活損失少[12-13]。 本研究選用不同規(guī)格的大孔樹脂為載體，以酶的固定化率和固定化酶催化丁酸香葉酯合成的酯化率為目標，選出最佳載體，然后考察酶液濃度、pH 和溫度對固定化的影響，從而優(yōu)化固定化過程。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 實驗試劑褶皺假絲酵母脂肪酶、 香葉醇（≥98%）及正己醇（色譜純）：購于Sigma 公司；大孔吸附樹脂DA201-V、 大孔離子交換樹脂D151、D152、D311：均購于勤實科技公司；牛血清蛋白：生化試劑；Na2HPO4、NaH2PO4、3? 型分子篩、 丁酸、正庚烷等：分析純試劑，均購自國藥集團上海化學試劑公司。

1.1.2 實驗設(shè)備DKZ-450B 型電熱恒溫振蕩水槽；真空干燥箱：上海森信實驗儀器有限公司；磁力攪拌器：德國IKA 公司；pH 計：XS204 精密天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；Anke TGL-16C 離心機： 上海安亭科學儀器廠；UV-1800 紫外可見分光光度計：GC-2014，日本島津公司；高效液相色譜-半制備：沃特世科技（上海）有限公司；FTIR-iS50 型傅里葉紅外光譜儀： 美國Nicolet 公司；AduanceⅢ400MHz 型全數(shù)字化核磁共振波譜儀： 德國布魯克AXS 有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樹脂的預(yù)處理大孔吸附樹脂：將樹脂用去離子水清洗，去雜，采用乙醇浸泡過夜，最后用去離子水沖洗至中性備用。

陽離子交換樹脂： 將樹脂用去離子水浸泡脹潤，去雜，用2%~4%NaOH 浸泡4~8 h 后用去離子水洗至中性，再用4%鹽酸浸泡4~8 h，用去離子水洗至pH 6，備用。

陰離子交換樹脂： 將樹脂用水洗至流出清水后，用4%鹽酸浸泡4~8 h，用去離子水洗至pH 6，再用2%~4%NaOH 浸泡4~8 h，用去離子水洗至pH 7~9，備用。

1.2.2 脂肪酶的固定化稱取一定量的CRL，溶解于設(shè)定pH 值的0.05 mol/L 磷酸緩沖液中， 低速攪拌30 min，并在2 400 r/min 下離心3 min，移取一定量上清液于具塞三角燒瓶中，再加入預(yù)處理后經(jīng)真空抽濾過的濕樹脂，放在恒溫振蕩水槽中，在150 r/min下振蕩8 h；取上清液測定酶蛋白含量，并用一定量0.05 mol/L 磷酸鹽緩沖液清洗三次， 抽濾分離固定化酶，真空干燥，收集后于4 ℃條件下保存待用。

1.2.3 固定化脂肪酶催化合成丁酸香葉酯將3 ?分子篩置于500 ℃馬弗爐中活化6 h， 慢慢冷卻后加入正庚烷中過夜。

將丁酸與香葉醇按1∶1.5 比例加入到預(yù)先裝有10 mL 溶劑的棕色瓶中，加入100 mg 分子篩，在溫度為40 ℃的恒溫振蕩水槽中振蕩10 min。 加入固定化脂肪酶，在200 r/min 振蕩速度下反應(yīng)，于不同的時間點取100 μL 反應(yīng)液，吸取100 μL 的正己醇溶液作為內(nèi)標，加入溶劑稀釋至1 mL，取1 μL 進行氣相色譜檢測。

1.2.4 丁酸香葉酯的分離鑒定反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)0.22 μm 有機膜過濾，每次取200 μL 進行液相色譜分離制備。 取得少量純品進行紅外以及核磁檢測。

液相色譜條件： 色譜柱XBridge TM Prep C18（10 mm×250 mm，5 μm），流動相80%乙腈-20%水，流速3 mL/min，柱溫25 ℃，紫外檢測波長220 nm，進樣量200 μL。

傅里葉紅外光譜分析：采用美國Nicolet 公司的FTIR-iS50 型傅里葉紅外光譜儀， 將丁酸香葉酯和溶劑分別滴于溴化鉀晶體上壓制成片，在室溫下測定樣品的吸收光譜， 掃描光譜范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為2.0 cm-1。

核磁共振檢測： 溶劑為CDCl3， 觀測頻率為100.625 MHz，采用Waltz 去偶技術(shù)，觀測譜寬24 038 Hz。

1.2.5 蛋白質(zhì)含量的測定蛋白質(zhì)含量分析采用Bradford 法[14]，以牛血清蛋白為標準蛋白質(zhì)。 按下式計算酶的固定化率：

固定化率=（初始酶液總蛋白質(zhì)質(zhì)量-殘液總蛋白質(zhì)質(zhì)量） /初始酶液總蛋白質(zhì)質(zhì)量×100%

1.2.6 氣相色譜定量檢測丁酸香葉酯采用內(nèi)標法進行樣品的定量分析，內(nèi)標物為正己醇。

校正因子的測定： 分別配置0.03、0.04、0.05、0.06、0.07 mol/L 的正己醇與丁酸香葉酯溶液， 采用GC 準確測量正己醇與丁酸香葉酯的峰面積， 以進樣量對峰面積進行線性回歸， 求得兩條標準曲線，兩曲線斜率之比即為校正因子。 校正因子計算公式如下：

式中：mi為丁酸香葉酯質(zhì)量；ms為正己醇質(zhì)量；Ai為丁酸香葉酯峰面積；As為正己醇峰面積。

標準樣品的配置：吸取30 μL 正己醇加入有機溶劑中，總體積為5 mL，混勻。

樣品溶液的配置：吸取100 μL 標樣，100 μL 反應(yīng)樣液，加入800 μL 溶劑中，混勻后經(jīng)0.22 μm 有機膜過濾，取1 μL 進行檢測。

氣相檢測條件：島津GC-2014 色譜儀，色譜柱DB-Wax（30 m×0.25 mm），載氣為N2，程序升溫條件為100 ℃保留1 min，10 ℃/min 升溫至220 ℃保留10 min。柱流量1.15 mL/min，分流比30∶1，檢測器溫度260 ℃。

丁酸香葉酯酯化率定義為產(chǎn)物中丁酸香葉酯量與理論上完全酯化時丁酸香葉酯量之比。

2 結(jié)果與討論

2.1 樹脂載體對固定化脂肪酶的影響

各種樹脂對酶固定化的適應(yīng)性不同，各種酶又具有不同的肽段和不同的極性，從而對樹脂載體的結(jié)合性有特定的要求。 工業(yè)上常用離子交換樹脂和大孔吸附樹脂作為固定化酶的載體，作者選取了具有代表性的幾種吸附樹脂和離子交換樹脂，比較固定化作用效果，篩選出適合褶皺假絲酵母脂肪酶固定化的樹脂載體。

在下述條件下進行固定化：取1 g 樹脂，酶液濃度10 mg/mL，緩沖液pH 6.0，溫度30 ℃，吸附8 h，固定化后的酶用于丁酸香葉酯的合成反應(yīng)。 考察不同樹脂的固定化率和固定化后酶催化丁酸香葉酯合成的酯化率， 結(jié)果分別見表1 和圖1。 從表1 可知，這幾種樹脂都有固定化效果，效果最好的D151樹脂固定化率達到83%，而D311 和DA201-V 兩種樹脂的固定化率都比較低，說明大孔弱堿性丙烯酸系陰離子交換樹脂和弱極性大孔苯乙烯型吸附樹脂均不適于CRL 的固定化。

另一方面，固定化率這一指標僅表示蛋白質(zhì)被固定化的程度， 并不等價于酶活力的固定化效果，因此將固定化酶用于催化丁酸香葉酯的合成，從酯化率的角度進一步作比較。 從圖1 的結(jié)果看，陽離子交換樹脂D151 和D152 不僅蛋白質(zhì)固定化率高，酯化率也比其余兩種樹脂高。 吸附樹脂與陰離子交換樹脂相比，固定化率接近，但陰離子交換樹脂的酯化率明顯低于吸附樹脂。 陽離子交換樹脂固定化率和酯化率高的原因可能是：因為離子交換樹脂依靠表面功能基團與脂肪酶作用，形成化學鍵，其結(jié)合力較強，與吸附結(jié)合力相比，使酶不易脫落，還可以使酶更好地暴露在載體外面，增加酶分子與底物分子的作用幾率，最大限度地降低酶分子的作用位阻[15]。 而吸附樹脂為弱極性樹脂，無功能基團，對于脂肪酶的吸附僅靠其較大的表面積， 作用力比較弱，導(dǎo)致固定化率較低，且酶在內(nèi)表面的吸附使酶分子被包埋在載體里面，就增加了空間位阻。 陰離子交換樹脂固定化率和酯化率都低的原因可能是褶皺假絲酵母脂肪酶是一種堿性蛋白質(zhì)，而陰離子交換樹脂適于選擇性地作用于酸性物質(zhì)。 總之，大孔陽離子交換樹脂D151 固定化效果最好。

表1 各種樹脂的固定化率Table 1 Immobilization ratio of different resins

圖1 各種樹脂固定化后的酶催化丁酸香葉酯合成的酯化率Fig. 1 Esterification ratios of geranyl butyrate catalyzed by enzyme immobilized with different resins

2.2 酶液質(zhì)量濃度對固定化的影響

每一種固定化酶載體的固載量是一定的，如果在固定化的過程中加入的酶量超過載體固載量，造成載體分子表面吸附酶量過多，就會使酶分子相互聚集成團，酶的活性中心有可能被遮蓋，盡管吸附酶量較多，但酶的催化活性仍較低[16]。

取1 g D151 樹脂，酶液質(zhì)量濃度分別為10、15、20、25 mg/mL，緩沖液pH 6.0，在30 ℃下吸附8 h。酶固定化后即用于催化丁酸香葉酯的合成。 考察酶液質(zhì)量濃度對固定化率和丁酸香葉酯合成效果的影響，結(jié)果見表2 和圖2。隨著酶液質(zhì)量濃度的增加，固定化率先增大后減少， 在酶液質(zhì)量濃度20 mg/mL 時達到最大值，說明此時大孔樹脂集團的結(jié)合位點已趨于飽和?？傮w而言，固定化率的數(shù)值都比較高。而從酯化率角度看， 雖然酶液質(zhì)量濃度20 mg/mL 時的固定化率最高，但給酶量已經(jīng)過多，空間位阻效應(yīng)顯著，導(dǎo)致酶的活性中心被掩蓋，酯化率低于酶液質(zhì)量濃度10 mg/mL 和15 mg/mL 時的酯化率。 兩項指標綜合考慮， 選擇15 mg/mL 為最適酶液質(zhì)量濃度。

表2 不同酶液濃度下的固定化率Table 2 Immobilization ratiosat different enzyme concentrations

圖2 固定化時酶液質(zhì)量濃度對酯化率的影響Fig. 2 Effect of enzyme concentration during immobilization on esterification ratio

2.3 pH 對固定化的影響

酶分子能夠“記憶”進入固定化前所在緩沖液的pH 狀態(tài)，這種“記憶”pH 改變了酶分子所處的微環(huán)境，影響到酶分子相關(guān)功能基的解離，從而影響酶的酯化活性[17]，因此應(yīng)選擇合適的固定化pH。

取1 g D151 樹脂，酶液質(zhì)量濃度15 mg/mL，緩沖液pH 分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，在30 ℃下吸附8 h， 然后將固定化酶用于催化丁酸香葉酯的合成。研究不同pH 對丁酸香葉酯固定化效果的影響，結(jié)果見表3 和圖3。 由表3 可知，當pH 低于6.5 時，固定化率較高， 說明弱酸條件下褶皺假絲酵母脂肪酶與載體的親和吸附作用較強。 觀察酯化率，在pH 6.5下固定化時酯化率最高， 因為只有在特定pH 值下，酶分子上的活性基團才能處于最佳離子狀態(tài)，所以選擇6.5 為最適的固定化pH。CRL 在弱酸環(huán)境下固定時具有更高的酯化活性，反映了該酶作為弱堿性脂肪酶的特點。

表3 不同pH 下的固定化率Table 3 Immobilization ratios at different pH

圖3 pH 對酯化率的影響Fig. 3 Effect of pH on esterification ratio

2.4 溫度對固定化脂肪酶的影響

取1 g D151 樹脂，酶液質(zhì)量濃度15 mg/mL，緩沖液pH 6.5，分別在溫度30、35、40、45、50、55 ℃下吸附8 h，固定化后酶用于催化丁酸香葉酯的合成。表4 和圖4 表示了不同固定化溫度對固定化效果的影響。 表4 表明，從30～45 ℃，固定化率隨溫度的升高而增加，而從45～60 ℃，則隨溫度的升高，逐漸降低。 這歸因于蛋白質(zhì)的吸附是一個吸熱過程，在溫度較低時，酶不容易吸附到樹脂上，隨著固定化溫度的升高，分子運動逐漸加劇，載體對酶的吸附量有所提高。 然而，高溫又容易使蛋白質(zhì)變性失活，所以繼續(xù)升高溫度，固定化率反而下降。 45 ℃下進行固定化的效果最好。 從圖4 看，也是45 ℃下固定化的酶的酯化率最高，其原因一方面是在一定的范圍內(nèi)， 溫度的升高能提高酶與底物的反應(yīng)速度；而另一方面，溫度較高時蛋白質(zhì)構(gòu)象改變，酶分子發(fā)生不可逆失活，導(dǎo)致酯化率降低。 兩方面因素拮抗的結(jié)果，45 ℃為固定化的最適溫度。

表4 不同溫度下的固定化率Table 4 Immobilization ratios at different temperatures

圖4 固定化溫度對酯化率的影響Fig. 4 Effect of immobilization temperature on esterification ratio

2.5 驗證試驗

根據(jù)以上單因素考察的結(jié)果，得到以下條件：1 g D151 樹脂，酶液質(zhì)量濃度15 mg/mL，緩沖液pH 6.5，溫度45 ℃，吸附8 h。在這些條件下進行驗證實驗，結(jié)果見圖5。 實驗結(jié)果表明，在上述優(yōu)化后的反應(yīng)條件下，酯化率可達84%。

2.6 定性分析

2.6.1 丁酸香葉酯的紅外光譜表征圖6 所示為丁酸香葉酯的紅外光譜圖， 在1 735 cm-1處出現(xiàn)中等寬度的強吸收峰，代表了酯（-COO-）上的C=O 伸縮振動，1 173 cm-1處代表酯鍵中C-O 的振動吸收峰，1 670 cm-1處的弱吸收峰代表-C=C-的的伸縮動，3 000 cm-1附近的吸收峰為C-H 鍵振動， 丁酸香葉酯的官能團在此光譜圖上已全部顯示。

2.6.2 丁酸香葉酯的核磁表征圖7 為丁酸香葉酯的碳譜譜圖， 共有14 個有效峰， 其中4 個伯碳峰、5 個仲碳峰、4 個烯碳峰和一個羰碳峰。 歸屬δ13.68、16.46、17.69、25.67 分別為1 位、8 位、13 位、14 位甲基伯碳。δ18.51、36.29、61.17、39.55、26.32 分別 為2 位、3 位、5 位、9 位、10 位 亞 甲 基 仲 碳。δ118.48、123.79 分 別 為6 位、11 位 一 取 代 烯 碳。δ142.09、131.81 分 別7 位、12 位 二 取 代 烯 碳。δ173.73 為4 位羰碳，77 處的三個 峰為CDCl3溶劑峰。

綜合兩種定性方法的結(jié)果，可確定產(chǎn)物確為丁酸香葉酯。

圖5 最適固定化條件下的酯化率驗證Fig. 5 Verification of esterification ratio with optimal immobilization conditions

圖6 丁酸香葉酯的紅外光譜Fig. 6 FT-IR spectrum of geranyl butyrate

圖7 丁酸香葉酯核磁共振圖譜Fig. 7 13C- NMR spectrum of geranyl butyrate

3 結(jié) 語

大孔陰陽離子交換樹脂和吸附樹脂都對CRL有一定的固定化作用，但陽離子交換樹脂的固定化性能最好，符合陽離子交換樹脂作用于堿性物質(zhì)的原則。 樹脂的固定化性能與功能基團的含量等多種因素有關(guān)，并非固定化率越高，酶的活性越高。 CRL適宜在弱酸環(huán)境下固定， 可顯示更高的酯化活性。在45 ℃下固定化的CRL 能得到高的酯化率。

以D151 離子交換樹脂為載體， 固定化的最佳條件為：每克預(yù)處理過的樹脂加酶15 mg/mL，在pH 6.5 緩沖液下，溫度為45 ℃，吸附8 h 得到的固定化酶催化合成丁酸香葉酯，最高酯化率達到84%。