Dfg5 在釀酒酵母細(xì)胞壁合成中的功能分析

田貴花， 王 寧， 高曉冬， 藤田盛久*， 喜多島敏彥

（1. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122； 2. 江南大學(xué) 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫214122）

釀酒酵母細(xì)胞壁由β-葡聚糖、甘露糖蛋白以及少量幾丁質(zhì)組成[1]。 葡萄糖通過(guò)β-1，3/1，6 糖苷鍵的方式結(jié)合形成葡聚糖構(gòu)成細(xì)胞壁的內(nèi)層，細(xì)胞壁外層則主要由甘露糖蛋白構(gòu)成[2-3]。 細(xì)胞壁外層甘露聚糖蛋白與細(xì)胞壁內(nèi)層葡聚糖的連接方式主要分為兩類(lèi)：一類(lèi)甘露糖蛋白通過(guò)非共價(jià)鍵與細(xì)胞壁內(nèi)層葡聚糖相連接，可以用SDS 抽提；另一類(lèi)甘露糖蛋白通過(guò)共價(jià)鍵與細(xì)胞壁內(nèi)層葡聚糖相連，不能用SDS 抽提， 但可以通過(guò)β-1，3-或β-1，6-葡聚糖苷酶處理釋放出來(lái)[4]。 根據(jù)與葡聚糖相連的羧基端結(jié)構(gòu)和連接鍵類(lèi)型，甘露糖蛋白可被分為兩類(lèi)，即糖基磷脂酰肌醇錨定的細(xì)胞壁蛋白質(zhì)（glycosylphosphatidylinositol anchored cell wall proteins，GPI-CWPs）和含有內(nèi)部氨基酸重復(fù)序列的細(xì)胞壁蛋白質(zhì) （CWPs crosslinked by protein with internal repeats，PIR-CWPs）。 PIR 型細(xì)胞壁蛋白質(zhì)由內(nèi)部重復(fù)氨基酸序列直接與細(xì)胞壁β-1，3 葡聚糖相連，此類(lèi)蛋白質(zhì)可用溫和堿（30 mmol/L NaOH，12 h，4 ℃）提取[5-6]。GPI-CWPs 型的細(xì)胞壁蛋白質(zhì)則先連接在β-1，6-葡聚糖上， 再通過(guò)β-1，6-葡聚糖與β-1，3-葡聚糖相連。GPI-CWPs 在許多細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中均發(fā)揮重要作用， 如參與細(xì)胞壁的合成、維持細(xì)胞形態(tài)、參與細(xì)胞與外界信號(hào)傳遞、介導(dǎo)細(xì)胞之間的黏附[7]。

酵母中GPI 錨首先在ER 中合成并連接到GPI前體蛋白質(zhì)上， 隨后預(yù)裝的GPI 錨定蛋白質(zhì)（glycosylphosphatidylinositol anchored proteins，GPIAPs）在ER 和高爾基體中進(jìn)行包括糖基化修飾在內(nèi)的進(jìn)一步改造，經(jīng)過(guò)囊泡運(yùn)輸至細(xì)胞質(zhì)膜外層。 當(dāng)GPI-APs 到達(dá)細(xì)胞質(zhì)膜后，大一部分GPI-APs 會(huì)進(jìn)一步轉(zhuǎn)移到細(xì)胞壁[5]。 通常認(rèn)為GPI 錨的N-乙酰葡萄糖胺和第一個(gè)甘露糖之間被割開(kāi)，脂質(zhì)部分被移除，含有甘露糖殘基的GPI 蛋白質(zhì)被共價(jià)連接至胞外β-1，6-葡聚糖上， 形成GPI 錨定的細(xì)胞壁蛋白質(zhì)（GPI-CWPs）[7-8]。 但是目前仍不清楚GPI 被切割和轉(zhuǎn)移至細(xì)胞壁是由一步轉(zhuǎn)糖苷作用完成還是由多個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)完成， 也不知道哪種形式的GPIAps 會(huì)被轉(zhuǎn)移至細(xì)胞壁上。 由于GPI-CWPs 廣泛存在于真菌中，其結(jié)構(gòu)和生物合成可作為抗真菌藥物的又一靶點(diǎn)。 通過(guò)阻礙GPI-CWPs 的生物合成，就可以阻止和破壞真菌的細(xì)胞壁合成，也就能達(dá)到抑制真菌生長(zhǎng)的目的。

Dfg5 和Dcw1 都屬于糖苷水解酶76 家族（GH76） 并且與α-1，6 甘露聚糖酶具有同源性，推測(cè)可能具有甘露聚糖酶活性，參與GPI-Aps 錨定至細(xì)胞壁的過(guò)程。 同時(shí)Dfg5 和Dcw1 是一對(duì)同源GPI錨定蛋白，dcw1Δ 和dfg5Δ 單突變株均可正常生長(zhǎng)，同時(shí)敲除DFG5 和DCW1 基因的雙突變菌株生長(zhǎng)致死。 當(dāng)Dfg5 和Dcw1 表達(dá)都受到抑制時(shí)，細(xì)胞形態(tài)變得又圓又大，幾丁質(zhì)不再以點(diǎn)狀形式集中在牙痕， 而是均勻遍布整個(gè)細(xì)胞表面， 表明共價(jià)連接GPI-CWPs 到葡聚糖上對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)至關(guān)重要[9-12]。

迄今為止，還不確定GPI 錨被切割并轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞壁是由轉(zhuǎn)糖苷酶催化一步完成還是由多個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)協(xié)同完成，以及何種形式的GPI-Aps 會(huì)被轉(zhuǎn)移至細(xì)胞壁上。 Dcw1 和Dfg5 作為協(xié)助GPI-Aps 交聯(lián)至細(xì)胞壁的必需蛋白質(zhì)，其作用機(jī)制可能是：1）Dfg5和Dcw1 發(fā)揮著轉(zhuǎn)糖苷酶的作用， 同時(shí)承擔(dān)著GPI錨的切割和轉(zhuǎn)移；2）Dfg5 和Dcw1 是只扮演糖苷酶的角色參與GPI 錨的切割， 存在其它蛋白質(zhì)負(fù)責(zé)GPI-Aps 轉(zhuǎn)移。 由于Dcw1 和Dfg5 是同源蛋白質(zhì)，其功能有重疊。因此作者擬選取Dfg5 為研究對(duì)象在釀酒酵母中對(duì)其功能和酶活特性進(jìn)行分析，其次擬構(gòu)建具有活性的分泌型Dfg5，未來(lái)可用于體外研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 質(zhì)粒構(gòu)建釀酒酵母出發(fā)菌株W303-1A，質(zhì)粒pRS315、pRS316、YEp352GAPⅡ、YEp352GAPⅡ-sDFG5：均由作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏和提供。研究中使用PCR 引物見(jiàn)表1，質(zhì)粒見(jiàn)表2。 引物合成和質(zhì)粒測(cè)序在華大基因完成。

表1 本研究中使用的引物Table 1 Primers used in this study

表2 本研究中使用的質(zhì)粒Table 2 Plasmids used in this study

1.1.2 主要試劑和儀器DNA 連接酶、限制性?xún)?nèi)切酶： 購(gòu)于TaKaRa 公司；PCR 引物、PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠電泳膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒：購(gòu)置于上海生物工程公司；β-1，3-glucose：購(gòu)置于Sigma 公司；相關(guān)抗體：購(gòu)置于上海生工生物工程公司；SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒、ClarityTMWestern ECL Substrate 顯色劑： 購(gòu)置于碧云天生物技術(shù)研究所。

1.1.3 培養(yǎng)基和溶液配制YPAD 培養(yǎng)基（1 L）：酵母浸出粉10 g， 蛋白胨20 g， 腺嘌呤30 mg，加ddH2O 至900 μL，121 ℃高壓滅菌15 min，培養(yǎng)基冷卻至55 ℃，加入100 mL 單獨(dú)滅菌的20 g/dL 葡萄糖。SD 缺陷型培養(yǎng)基 （1 L）： 無(wú)氨基酵母氮源（YNB）6.7 g，加水至900 mL，121 ℃高壓滅菌15 min，培養(yǎng)基冷卻至55 ℃，加入100 mL 單獨(dú)滅菌的20 g/dL的葡萄糖和2 g 缺少相應(yīng)氨基酸的氨基酸混合物。

1.1.4 菌株構(gòu)建基因敲除的具體方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[13]。質(zhì)粒pFA6a-trp 為敲除DCW1 和DFG5 的模板，質(zhì)粒pFA6a-his3MX-PMET3 為構(gòu)建dfg5△PMET3DCW1菌株的模板，PCR 引物見(jiàn)表1。 在釀酒酵母中MET3基因編碼ATP 硫酸化酶，能有效激活無(wú)機(jī)硫同時(shí)并入有機(jī)分子中，是蛋氨酸代謝中的關(guān)鍵步驟。 在外源甲硫氨酸作用下，MET3 啟動(dòng)子調(diào)控下的目的基因表達(dá)受到抑制。 在缺少甲硫氨酸的選擇性培養(yǎng)基中，MET3 啟動(dòng)子變?yōu)樵鰪?qiáng)型啟動(dòng)子，使其調(diào)控下的目的基因高效表達(dá)[14-17]。 本研究中使用菌的菌株見(jiàn)表3。

表3 本研究中所用的菌株Table 3 Strains used in this study

1.2 菌株表型驗(yàn)證

將W303-1A、dfg5△和dfg5△PMET3DCW1 在甲硫氨酸缺陷型葡萄糖選擇性培養(yǎng)基（SD-Met）中30 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，至OD660=1.0，取相同細(xì)胞數(shù)連續(xù)做4 次10 倍梯度稀釋?zhuān)赟D-Met 和含1 mmol/L 甲硫氨酸的葡萄糖選擇性培養(yǎng)基（SD+Met）上點(diǎn)板，分別在30、41 ℃培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

1.3 蛋白質(zhì)提取

1.3.1 細(xì)胞膜蛋白質(zhì)提取在相應(yīng)培養(yǎng)中30 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，離心收集10 mL OD660的酵母細(xì)胞，用1 mL預(yù)冷的2 mmol/L 苯基甲磺酰氟（Phenylmethanesulfonyl fluoride）洗滌2 次。重懸于150 μL 1×SDS-PAGE 上樣緩沖液中，加入100 μL 玻璃珠（0.4～0.6 mm），65 ℃孵育5 min，振蕩2 min。再次65 ℃孵育5 min，振蕩2 min。 加入150 μL 1×SDS-PAGE 上樣緩沖液，65 ℃孵育5 min。 20 000g離心5 min 除去細(xì)胞碎片和細(xì)胞壁雜質(zhì)，收集100 μL 上清液，即可得到膜蛋白[18-19]。

1.3.2 細(xì)胞壁GPI-CWP1 蛋白質(zhì)提取在相應(yīng)培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)過(guò)夜， 離心收集10 mL OD660的酵母細(xì)胞， 用1 mL 預(yù)冷的10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5） 洗滌2 次。 重懸于100 μL 裂解緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5），1 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF，SIGMAFSTTM Protease Inhibitor Cocktail Tablets）中，加入適量的玻璃珠。 振蕩1 min 后冰浴1 min，重復(fù)上述振蕩及冰浴5 次。 4 ℃、100g離心30 s，分離玻璃珠，收集細(xì)胞裂解液。加入100 μL 萃取緩沖液（4% SDS，100 mmol/L NaCl，40 mmol/L β-巰基乙醇）后充分混勻，100 ℃孵育10 min，16 000g離心5 min，去除上清液。 再次重懸于100 μL 萃取緩沖液中，100 ℃孵育2 min，16 000g離心5 min，去除上清液，重復(fù)上述循環(huán)3 次。 用1 mL ddH2O 洗滌3 次，16 000g離心5 min 去除上清液[19]。 沉淀所得粗細(xì)胞壁碎片重懸于100 μL、150 mmol/L 醋酸鈉反應(yīng)液，加入2 mg β-1，3-葡聚糖酶，充分混勻，37 ℃反應(yīng)12 h 以上，即可得到細(xì)胞壁的GPI-CWPs[20]。

1.3.3 細(xì)胞外蛋白質(zhì)提取在相應(yīng)培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)過(guò)夜， 離心收集10 mL OD660的酵母細(xì)胞培養(yǎng)液，4 ℃、5 000 g離心5 min，去除細(xì)胞沉淀并收集上清液。將上清液于4 ℃、15 000 r/min 離心5 min，進(jìn)一步除去細(xì)胞碎片。 收集的上清液中加入終濃度10%的三氯乙酸，振蕩混勻，冰浴30 min 以上。離心去除上清液，沉淀用預(yù)冷的丙酮洗滌3 次后，溶解于1×SDSPAGE 上樣緩沖液，95 ℃孵育5 min，-20 ℃保存。

1.4 蛋白質(zhì)免疫印跡電泳

取100 μg 蛋白質(zhì)樣品上樣跑電泳， 濃縮膠電壓80 V，30 min；分離膠電壓120 V，90 min；轉(zhuǎn)膜：采用半干式轉(zhuǎn)膜方式，電壓25 V，電流1.0 A，時(shí)間30 min；封閉：5%的脫脂奶粉封閉1 h；孵育抗體：一抗1∶5 000，室溫1.5 h 或4 ℃過(guò)夜；二抗1∶5 000，室溫1 h；顯色：ECL 顯色液A 和B 混勻，涂于膜上，用ImageQuant LAS4000mini 顯色。

1.5 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

從平板挑取單菌落接種于5 mL 葡萄糖型甲硫氨酸和尿嘧啶缺陷培養(yǎng)基（SD-Met-Ura）中預(yù)培養(yǎng)，離心收集等量對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，并將其分別轉(zhuǎn)接至50 mL SD-Met-Ura 和含1 mmol/L 甲硫氨酸的葡萄糖型尿嘧啶缺陷2 培養(yǎng)基 （SD+Met-Ura）。 每12 小時(shí)取1 次樣品，在OD660下測(cè)定菌濃，培養(yǎng)至第72 h 停止測(cè)定。 以測(cè)定的OD660數(shù)值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，得到不同菌株的生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 MET3 啟動(dòng)子調(diào)控下的突變株表型驗(yàn)證

考慮到dcw1△和dfg5△雙突變株存在嚴(yán)重的細(xì)胞壁缺陷使其生長(zhǎng)致死[11，17]。 為便于研究這兩個(gè)基因的功能，作者構(gòu)建了dfg5△PMET3DCW1 條件突變株菌株， 即在dfg5△菌株中用MET3 啟動(dòng)子調(diào)控DCW1 基因的表達(dá)。 如圖1 所示，dfg5△菌株能在41 ℃環(huán)境中正常生長(zhǎng)， 具有耐高溫的特性，與Nasution[21]等研究相符。 在甲硫氨酸培養(yǎng)基上dfg5△PMET3DCW1 菌株不生長(zhǎng)，表明外源添加甲硫氨酸可誘導(dǎo)MET3 啟動(dòng)子抑制DCW1 表達(dá)。 此時(shí)由于Dfg5 缺失且Dcw1 表達(dá)受抑制， 從而引起細(xì)胞壁合成受損，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。 在缺少甲硫氨誘導(dǎo)的情況下，MET3 啟 動(dòng) 子 調(diào) 控DCW1 高 表 達(dá)， 此 時(shí)dfg5△PMET3DCW1 菌株表型與dfg5△相似，無(wú)論是在30 ℃還是41 ℃條件下，菌株均可正常生長(zhǎng)。 上述結(jié)果說(shuō)明， 在釀酒酵母中Dfg5 和Dcw1 功能重疊，單突變株在平板上表型差異小， 雙突變株致死。 與Kitagaki[11]等研究結(jié)果相同。 本研究使用的MET3 啟動(dòng)子可在甲硫氨酸誘導(dǎo)下有效調(diào)節(jié)DCW1 表達(dá)，為下一步分析這兩個(gè)基因的作用機(jī)制創(chuàng)造條件。

圖1 突變菌株表型Fig. 1 Phenotype of mutant strains

2.2 Dcw1 和Dfg5 對(duì)細(xì)胞壁蛋白質(zhì)合成的影響

為了研究Dcw1 和Dfg5 蛋白質(zhì)在細(xì)胞壁合成途徑中的功能， 作者選取Cwp1 作為一種典型的GPI 錨定細(xì)胞壁蛋白質(zhì)[11，19]，在W303-1A、dcw1△、dfg5△、dfg5△PMET3DCW1 菌株中分別表達(dá)His-Flag標(biāo)記的Cwp1 蛋白質(zhì)，同時(shí)用W303-1A 原始菌株作為空白對(duì)照。 蛋白質(zhì)印記結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在含甲硫氨酸培養(yǎng)基中培養(yǎng)的dfg5△PMET3DCW1 雙缺陷菌株細(xì)胞壁的Cwp1 蛋白質(zhì)量明顯減少（圖2（b）），細(xì)胞膜上則可檢測(cè)到大量Cwp1（圖2（a）），所有菌株的培養(yǎng)基中均檢測(cè)不到Cwp1。表明引起細(xì)胞壁中Cwp1 缺失的主要原因是細(xì)胞膜上GPI 蛋白質(zhì)不能被有效的切割進(jìn)而無(wú)法共價(jià)連接到細(xì)胞壁上。 由此推測(cè)Dcw1和Dfg5 在GPI 型細(xì)胞壁蛋白質(zhì)合成中只扮演糖苷酶的功能， 負(fù)責(zé)識(shí)別和切割細(xì)胞膜上的GPI 蛋白質(zhì)，同時(shí)酵母中可能存在另一種蛋白質(zhì)可將切割下來(lái)的GPI 蛋白質(zhì)連接至細(xì)胞壁β-1，6-葡聚糖上形成細(xì)胞壁蛋白質(zhì)；或者Dcw1 和Dfg5 扮演糖苷轉(zhuǎn)移酶的功能，可將切割后GPI 蛋白質(zhì)連接至細(xì)胞壁上[10-11]。 總之，Dcw1 和Dfg5 的缺失使Cwp1 不能成功的從細(xì)胞膜的GPI 錨上釋放，說(shuō)明這兩個(gè)蛋白質(zhì)至少具有類(lèi)似糖苷酶的作用。 單突變菌株細(xì)胞膜和細(xì)胞壁中Cwp1 蛋白質(zhì)量只有少量的變化 （圖2（a），（b）），可能因?yàn)镈CW1 和DFG5 是同源基因，其編碼的蛋白質(zhì)是同工酶， 當(dāng)其中一種蛋白質(zhì)缺失時(shí)，另一種蛋白質(zhì)仍可正常工作，但是Dcw1 或Dfg5 單獨(dú)作用時(shí)效率下降，造成單突變株中細(xì)胞膜上積累少量Cwp1，細(xì)胞壁中Cwp1 蛋白質(zhì)含量減少。

2.3 Dfg5 活性位點(diǎn)分析和保守氨基酸突變

普遍認(rèn)為糖苷水解酶76 家族（GH76）成員具有α-甘露糖苷酶活性，但是只有少數(shù)蛋白結(jié)構(gòu)和功能被解析清楚。 腸寄居多形擬桿菌基因組編碼的BT2849 蛋白質(zhì)是該家族中惟一被發(fā)表的已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。 盡管BT2949 與GH76 家族其他成員氨基酸序列的相似性?xún)H16%～25%， 但其蛋白質(zhì)整體結(jié)構(gòu)是相對(duì)高度保守的。 與根據(jù)其蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)解析和序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)， 聚集在蛋白質(zhì)中心位置的5個(gè) 氨 基 酸 位 點(diǎn)W82、D143、E144、D249、Y265 可 能是催化活性中心相關(guān)位點(diǎn)。 目前沒(méi)有Dfg5 和Dcw1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和活性中心的報(bào)道。 本研究對(duì)包括Dfg5、Dcw1 和BT2949 在內(nèi)的7 個(gè)GH76 家族成員假定的催化域進(jìn)行序列比對(duì)， 發(fā)現(xiàn)BT2849 中除D249 外的其它四個(gè)氨基酸位點(diǎn)W82、D143、E144、Y265 在GH76 家族中高度保守[12]， 由此推測(cè)Dfg5中對(duì)應(yīng)四個(gè)氨基酸位點(diǎn)也可能是潛在的活性中心。

圖2 模式蛋白質(zhì)Cwp1 在突變菌株中的表達(dá)情況Fig. 2 Expression of Cwp1 in mutant strains

為了進(jìn)一步探究釀酒酵母細(xì)胞壁合成過(guò)程中Dcw1 和Dfg5 是否承擔(dān)著糖苷酶的功能及其活性中心的位置， 本研究選取Dfg5 蛋白質(zhì)中對(duì)應(yīng)的四個(gè)保守位點(diǎn)W71A、D122、D123、Y256 進(jìn)行定點(diǎn)突變，成功構(gòu)建突變子DFG5W71A、DFG5D122A、DFG5D123A、DFG5Y256A。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在甲硫氨酸培養(yǎng)基中表達(dá)野生型DFG5 和突變DFG5Y256A 基因的菌株可回補(bǔ)dfg5ΔPMET3DCW1 條件突變株菌株的生長(zhǎng)缺陷，而表達(dá)突變DFG5W71A、DFG5D122A、DFG5D123A基因的菌株不能回補(bǔ)其生長(zhǎng)（圖3（a）），說(shuō)明突變后的Dfg5W71A、Dfg5D122A、Dfg5D123A 蛋白質(zhì)失活。為進(jìn)一步證明這些突變蛋白質(zhì)失活是由于蛋白質(zhì)降解還是催化活性消失引起的， 作者在dfg5Δ 株中表達(dá)了含有HA 標(biāo)記的野生型DFG5 基因。 蛋白質(zhì)印跡法分析細(xì)胞膜蛋白質(zhì)和培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)，突變后的Dfg5W71A、Dfg5D122A、Dfg5D123A 蛋白質(zhì)大小、表達(dá)水平和穩(wěn)定性均無(wú)變化（圖3（b））。 說(shuō)明突變后Dfg5 沒(méi)有降解，突變蛋白質(zhì)失活極有可能是因蛋白質(zhì)催化活性中心被破壞。 以上結(jié)果可推測(cè)W71、D122、D123 這三個(gè)氨基酸可能凝聚構(gòu)成了Dfg5 的催化活性中心，Dfg5 可能具有甘露糖苷酶的活性。

圖3 Dfg5 活性位點(diǎn)分析Fig.3 Analysis of the putative catalytic active sites of Dfg5

2.4 過(guò)表達(dá)可溶性Dfg5 蛋白質(zhì)對(duì)dfg5△PMET3DCW1生長(zhǎng)的影響

本研究從野生型菌株基因組中擴(kuò)增出不含前導(dǎo)肽序列的DFG5基因片段（sDFG5），用于編碼可溶性Dfg5（sDfg5）。在野生型和dfg5△PMET3DCW1菌株中表達(dá)sDfg5 后，用Flag 抗體可在培養(yǎng)基中檢測(cè)到可溶性Dfg5， 其中野生型菌株的sDfg5 分泌量更少（圖4（a））。 研究表明，去除前導(dǎo)肽序列的DFG5 基因片可段編碼不含GPI 錨的可溶性Dfg5，并能成功分泌至培養(yǎng)基中。為了進(jìn)一步檢測(cè)sDfg5 的活性，研究選取dfg5△PMET3DCW1 菌株研究對(duì)象，在不同選擇性培養(yǎng)基中檢測(cè)其生長(zhǎng)水平。 在未加甲硫氨酸的培養(yǎng)基中，MET3啟動(dòng)子誘導(dǎo)下的DCW1基因可高表達(dá)，突變株和野生型都正常生長(zhǎng)（圖4（b））。 用含有甲硫氨酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，MET3 啟動(dòng)子調(diào)控下的DCW1 基因無(wú)法正常表達(dá)， 不表達(dá)sDfg5 的dg5△PMET3DCW1菌株生長(zhǎng)始終受到抑制， 但過(guò)量表達(dá)sDfg5的dfg5△PMET3DCW1菌株在培養(yǎng)40 h 后生長(zhǎng)得以回補(bǔ)（圖4（c））。 這說(shuō)明sDfg5 仍具有活性，GPI 錨的修飾不影響Dfg5 的功能。

圖4 可溶性Dfg5 在條件突變株中的表達(dá)情況Fig. 4 Expression of Soluble Dfg5 in condition mutant strain

3 結(jié) 語(yǔ)

Dcw1 和Dfg5 是一對(duì)同源的GPI 錨定膜蛋白質(zhì)，據(jù)推測(cè)可能有糖苷酶活性，參與真菌細(xì)胞壁蛋白質(zhì)合成，但其分子作用機(jī)制尚不清楚，也沒(méi)有表征酶活的數(shù)據(jù)。作者通過(guò)在dfg5△PMET3DCW1條件突變株中表達(dá)模式蛋白質(zhì)Cwp1， 證實(shí)在GPI-APs 錨定至細(xì)胞壁的過(guò)程中，Dcw1 和Dfg5 參與GPI 的切割。對(duì)Dfg5 中與甘露糖糖苷酶催化活性相關(guān)的四個(gè)保守氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行突變， 其中W71、D122、D123這三個(gè)位點(diǎn)的單突變蛋白質(zhì)無(wú)法回補(bǔ)致死突變菌株的生長(zhǎng)， 說(shuō)明這三個(gè)位點(diǎn)對(duì)Dfg5 的活性至關(guān)重要，可以推測(cè)它可能具有α-甘露糖苷酶的活性。 去除GPI 錨的可溶性Dfg5 可成功從細(xì)胞膜分泌至培養(yǎng)中。 體內(nèi)研究表明，在液體培養(yǎng)基中可溶性Dfg5可回補(bǔ)dfg5△PMET3DCW1條件突變株的生長(zhǎng)，說(shuō)明定位于細(xì)胞膜對(duì)Dfg5 活性不重要。從培養(yǎng)基中純化出來(lái)的可溶性Dfg5 可進(jìn)一步用于體外研究，作為篩選抗真菌藥物的靶蛋白質(zhì)。