啤酒中4-乙烯基丁香酚的研究進展

杜俊杰，崔云前*，吉春暉，孟 飛，周長生

（1.齊魯工業(yè)大學（山東省科學院）生物工程學院山東省微生物工程重點實驗室，山東濟南 250353；2.菏澤巨鑫源食品有限公司，山東菏澤 274400）

在啤酒的活性風味物質(zhì)中，已檢測出了揮發(fā)性酚、愈創(chuàng)木酚、苯酚、香草醛、乙酰香草酮、丁香酚、4-乙烯基丁香酚（4-vinylsyringol，4-VS）、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚（4-vinylguaiacol，4-VG）、4-乙烯基苯酚（4-vinylphenol，4-VP）等。大多簡單的酚類化合物來源于釀造過程中的原料或受污染的發(fā)酵液（如氯酚），僅有某幾種是酵母代謝產(chǎn)生的。“酚的不良風味（phenolic off-flavour，POF）”術(shù)語常用于描述啤酒具有強烈的藥味和丁香花味。4-乙烯基丁香酚（4-VS）是一種具有“煙熏味”和“煙草味”類似于老化啤酒風味的酚類物質(zhì)，主要由芥子酸（sinapic acid，SA）脫羧生成。在下面發(fā)酵啤酒中，4-VS被稱之為“異酚味”，不受消費者所喜歡，但在比利時白啤酒、德國小麥啤酒和煙熏啤酒等上面發(fā)酵啤酒中，4-VS卻是一種對啤酒酒體全面評價必不可少的風味物質(zhì)。因此，對啤酒中4-VS的研究就尤為重要。目前國內(nèi)外對4-VS的研究不多，因此本文對4-VS近幾年來主要的幾個研究成果進行綜述，重點介紹4-VS的形成途徑，老化風味的鑒定以及抗氧化活性，為以后啤酒中4-VS的深入研究提出一些建議。

1 4-乙烯基丁香酚在啤酒中的形成途徑

酚類在啤酒中多以單體或者是聚合物的形式存在。酚酸則是啤酒中單酚的一種，酚酸是一類簡單的單環(huán)酸，包括苯甲酸和肉桂酸的羥基衍生物等。從啤酒中可以檢測出來大約有20種不同的肉桂酸（如p-香豆酸、阿魏酸、芥子酸、咖啡酸）和苯甲酸（如香草酸、沒食子酸、丁香酸）的羥基衍物[2]。尤其是羥基肉桂酸（hydroxycinnamic acids，HCA）如p-香豆酸、阿魏酸以及芥子酸與植物細胞壁中的多聚糖有關(guān)。在谷物中，這些羥基肉桂酸主要與阿拉伯木聚糖（arabinoxylans，AX）發(fā)生酯化作用。谷物谷皮、果皮、糊粉層和胚乳細胞中阿拉伯木聚糖是其形成碳水化合物的重要結(jié)構(gòu)，AX由β-（1-4）-木聚糖組成，木糖殘基在C2/C3位上被樹膠醛醣取代。肉桂（3-苯基丙稀酰）基團會吸附在阿糖呋喃殘基的O5位上。AX是一種高分子質(zhì)量部分水溶性聚合物。在釀造過程中，這些羥基肉桂酸均會被AX水解酶從麥芽中萃取和溶解進入麥汁中[3]。

4-VS的前體物質(zhì)芥子酸是一種小分子天然存在的羥基肉桂酸，羥基肉桂酸屬具有生物活性的酚酸類，主要包括咖啡酸、阿魏酸、芥子酸等，這些化合物的氧基氫原子與人體內(nèi)有害的氧自由基中和[4]。芥子酸是4種最常見的羥基肉桂酸之一，許多研究者認為芥子酸是一種有效的抗氧化劑，其功效被認為優(yōu)于阿魏酸。而阿魏酸是一種已被用作食品、飲料和化妝品中天然抗氧化劑（3甲氧基-4-羥基肉桂酸），可與咖啡酸媲美[5]。近年來，芥子酸及其衍生物因其具有多種生物活性而引起人們的廣泛關(guān)注。芥子酸具有抗菌、抗炎、抗癌和抗焦慮的作用。芥子酸的脫羧產(chǎn)物4-VS在清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化、抗菌、抗癌和消炎方面都有一定的功效，此外4-VS還是效的抗突變藥物，是一種乙酰膽堿酯酶抑制劑，可用于老年癡呆癥、共濟失調(diào)、重癥肌無力和帕金森病的治療[6]。

在啤酒釀造過程中，芥子酸主要來自一些原料和輔料當中。BONDIA-PONS I等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在黑麥中，芥子酸可以占所有酚酸的9%～10%；HUDSON E A等[8]研究報道，在釀造輔料大米中，芥子酸的含量為1.05（μg/g干質(zhì)量）；MATTILLA P等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在另一種釀造輔料燕麥中，芥子酸的含量為56.05（μg/g干質(zhì)量）。OSORIO C等[10]還提到當啤酒中添加薩茲酒花時，芥子酸的含量會有所提升。與p-香豆酸和阿魏酸相同，在啤酒釀造過程中芥子酸先是通過阿糖呋喃酯酶的作用釋放出游離酸，通過不同的途徑脫羧進而形成風味活性揮發(fā)性物質(zhì)酚類4-VS。類似與p-香豆酸和阿魏酸脫羧形成4-VP和4-VG的途徑，芥子酸脫羧形成4-VS的途徑主要有兩種：①通過啤酒釀造過程的高溫熱反應產(chǎn)生（如麥汁煮沸、旋渦沉淀和巴氏殺菌等）；②通過發(fā)酵過程中酶的脫羧反應，主要是通過上面發(fā)酵酵母菌株苯基丙烯酸脫羧酶（phenylacrylic acid decarboxylase，PAD）l的作用以及一些其他的芥子酸脫羧酶，或污染了微生物（如大腸桿菌、乳酸菌、醋酸菌和一些酒香酵母、德克酵母等野生酵母）[11]。除此之外，揮發(fā)性4-VS會在貯藏啤酒老化過程中增加，很可能來自于配糖類化合物的酸水解或是芥子酸的熱脫羧反應[12]。

2 自然老化啤酒中4-乙烯基丁香酚的鑒定

到目前為止，對于4-VS的研究大都聚焦在啤酒老化方面。長期以來，啤酒老化一直是啤酒廠研究的重點。最近幾年，許多研究者在自然老化啤酒中鑒定出來4-VS這種揮發(fā)性酚類物質(zhì)。CHEVANCE F等[13]利用自然老化啤酒的香氣提取稀釋分析（aroma extract dilution analysis，AEDA），通過氣相色譜分析，在不同的固定相中的保留指數(shù)（retention index，RI）（二甲基聚硅氧烷氣相色譜柱保留指數(shù)）=1 532和聚乙二醇氣相色譜柱保留指數(shù)=2 809處發(fā)現(xiàn)了一種類似老化啤酒的氣味，其熒光檢測（fluorescence detection，F(xiàn)D）值接近反式-2-壬烯醛（反式-2-壬烯醛，老化啤酒中常見的硬紙板異味）。并利用特定的酚萃取、氣相色譜冷阱和質(zhì)譜分析（電子沖擊和化學電離）最終確定是4-乙烯基丁香酚（4-VS）。LERMUSIEAU G等[14]為了人為地提高XAD-2啤酒提取物中未知物的水平，首次在40 ℃條件下將拉格啤酒加速老化10 d，用氣相色譜方法進一步濃縮該化合物。洗脫液從氣相色譜保留指數(shù)RI=1 509至RI=1 563轉(zhuǎn)移到冷阱中，經(jīng)過30次氣相色譜注射后，利用二乙醚洗脫這一冷阱，回收一種具有很“酚醛-煙草-老化啤酒”氣味的萃取物。在極性聚乙二醇色譜柱上測定該化合物的保留指數(shù)RI為2 809。通過對酚類化合物應用特定的提取程序來回收未知物，表明其酸度系數(shù)（pKa）值在9～13范圍內(nèi)。通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析，進一步證實了酚結(jié)構(gòu)，通過化學電離甲烷（CH4）-一氧化二氮（N2O）（75∶25，V/V），獲得分子質(zhì)量為181的假分子離子，穩(wěn)定的分子離子（180 m/z）與芳香環(huán)一致，然而，未知的特征還包括失去甲基自由基（165 m/z），而不是的酚醛甲基酮。因此，最終確定所得到的未知物的結(jié)構(gòu)為3,5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯。商品化的3,5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸（芥子酸）的脫羧反應進一步鑒定了3,5-二甲氧基-4-羥基苯乙烯是4-乙烯丁香酚（4-VS）。ULLRICH F等[15]為了確定啤酒老化的潛在關(guān)鍵風味，使用比利時商業(yè)啤酒在20 ℃條件下自然貯藏3月或6月。在氣相色譜-嗅聞（gaschromatographyolfactometric，GC-O）技術(shù)分析之前，用AmberliteXAD-2樹脂提取啤酒，以這種方式獲得的最具代表性的樣品被進一步用香氣提取物稀釋分析（AEDA）。通過用AEDA方法老化啤酒進行檢測，4-乙烯基丁香酚被鑒定為一種強烈的牙醫(yī)味、煙熏味的老化啤酒酚醛味（FD值與反式-2-壬烯醛一樣高，導致老化啤酒中的紙板異味）[16]。因此，4-乙烯基丁香酚這樣的低分子質(zhì)量酚類物質(zhì)能使老化啤酒產(chǎn)生異味。

3 4-乙烯基丁香酚的最新研究

芥子酸及其衍生物，特別是4-VS都有很強的抗氧化活性的特性[17]。甚至4-VS的抗氧化活性比芥子酸還要高，且具有抗誘變等生理活性[18]。4-VS除了是一種強效的抗氧化劑之外還是一種抗誘變劑，同時也有抑制癌變和炎性細胞因子的誘導的作用[19]。因此，國內(nèi)外對4-VS的抗氧化能力與生理活性進行了許多研究。HARBAUM-PIAYDA B等[20]研究發(fā)現(xiàn)，4-VS特別是芥子酸可顯著抑制乳狀液的氧化；WAKAMATSU D等[21]研究發(fā)現(xiàn)，4-VS要比已知的抗氧化劑α-生育酚、維生素C、β-胡蘿卜素、槲皮等相比抗烷基過氧自由基（ROO·）更強。TERPINC P等[22]較為系統(tǒng)地評價了4種羥基肉桂酸，包括阿魏酸、p-香豆酸、咖啡酸和芥子酸及其芥子酸的脫羧衍生物4-VS的還原能力與過氧自由基（ROO·）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、超氧陰離子自由基的清除能力，結(jié)果表明，在均勻的極性介質(zhì)中，上述羥基肉桂酸脫羧衍生物4-VS的抗氧化活性低于它們本身，而在乳液體系中，脫羧衍生物4-VS則表現(xiàn)出了更高的抗氧化活性。除具有強的抗氧化活性外，4-VS還具有抗誘變、消炎、抗癌等生理活性。KUWAHARAH等[23]研究表明，4-VS對內(nèi)源性誘變劑過氧化亞硝酸鹽表現(xiàn)出有效的抗誘變能力，甚至比α-生育酚、黃酮類化合物還要好，與Ebselen（中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥，具有解熱鎮(zhèn)痛及抗痛風的功效）相當。GALANO A等[24]給蒙古沙鼠飼喂4-VS，結(jié)果表明，4-VS具有顯著抑制幽門螺桿菌以及由此引起的胃炎和胃癌的發(fā)生。JIANG J等[25]研究表明，4-VS具有顯著保護人體視網(wǎng)膜色素上皮細胞免受過氧化氫誘導氧化損傷的作用，從而可能對與年齡相關(guān)的黃斑變性和其他氧化應激相關(guān)的視網(wǎng)膜疾病有治療作用。由于氧化應激與多種疾病如癌癥、心血管疾病、機能失調(diào)、動脈粥樣硬化、阿爾茨海默病等有關(guān)，因此，4-VS所具有的能對抗氧化應激的功能將使其成為一種極有希望的化學藥物。

其次，在尋找可以使芥子酸脫羧生成4-VS的脫羧酶方面，也有大量的研究報道。有報道稱[26]，當采用一株高苯基丙烯酸脫羧酶（PAD）l活性的上面酵母菌株時，芥子酸也能成為啤酒中含量最豐富的酚酸；為了深入了解酵母PADl活性的分類情況，篩選了75株上面發(fā)酵愛爾啤酒酵母來進行酚酸脫羧的轉(zhuǎn)化試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上面發(fā)酵酵母菌株的PADl陽性表現(xiàn)率較高；進一步在兼性厭氧篩選過程中，11株上面發(fā)酵酵母菌株表現(xiàn)出不同的PADl活性；11株上面發(fā)酵酵母菌株的基質(zhì)特性通過向酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基中補加1 mmol/L的p-香豆酸、阿魏酸和芥子酸來進行評價，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沒有一株酵母菌能夠使芥子酸發(fā)生脫羧反應，說明一般的上面發(fā)酵酵母菌株間PAD1對芥子酸脫羧生成4-VS的作用可能不夠明顯。HU H F等[27]克隆了地衣芽孢桿菌酚酸脫羧酶（Bacillus licheniformisphenolic acid decarboxylase，BLPAD）基因，然后在大腸桿菌中過表達，最終發(fā)現(xiàn)這個酶具有廣泛的底物特異性，在100∶74.59∶34.41∶0.29的比活性下，可以使p-香豆酸、阿魏酸、咖啡酸和芥子酸脫羧。和其他的酚酸脫羧酶相比，BLPAD具有非常好的有機溶劑耐受性和熱穩(wěn)定性，是一種理想的生物催化劑，可用于在兩相有機/水反應體系中，將羥基肉桂酸轉(zhuǎn)化為乙烯基酚衍生物，能有效地將p-香豆酸和阿魏酸轉(zhuǎn)化為4-乙烯基苯酚和4-乙烯基愈創(chuàng)木酚。低產(chǎn)率和低產(chǎn)品濃度不利于酚酸脫羧酶生產(chǎn)乙烯基酚衍生物。GU W等[28]報道稱來自不同細菌的酚酸脫羧酶很可能是從一個共同的祖先進化而來，并被分離成不同的類群。這些脫羧酶具有高度的序列同源性，在不同的微生物中可能具有共同的催化機制。然而，不同細菌的酚酸脫羧酶在催化性能上存在較大差異。從枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、短鏈芽孢桿菌（Bacillus pumilus）和解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）等菌株中提取的酚酸脫羧酶，主要對阿魏酸、p-香豆酸和咖啡酸脫羧[29]。與此形成對照的是，植物乳桿菌酚酸脫羧酶（Lactobacillus plantarumphenolic acid de carboxylase，LPPAD）和戊糖片球菌酚酸脫羧酶（Pediococcus pentosaceusphenolic acid decarboxylase，PPPAD）對阿魏酸和咖啡酸的活性大約是對香豆酸的100～1 000倍[30]。這表明BLPAD與芽孢桿菌酚酸脫羧酶（phenolic acid decarboxylase，PAD）具有相似的催化性能。然而，BLPAD比以前報道的PAD具有更廣泛的底物特異性。除能使芥子酸脫羧，它具有額外甲氧基基團的酚酸分子，可以使芥子酸的脫羧生成4-VS。該酶具有獨特的底物特異性，具有很強的吸引力，是生產(chǎn)4-VS潛在的生物催化劑[31]。

4 總結(jié)

啤酒中可以檢測到的酚酸大都來自于麥芽（大約70%）和酒花（大約30%）當中，原材料的種類和數(shù)量、質(zhì)量以及不同的釀造工藝都會影響酚酸的含量。芥子酸作為酚酸中羥基肉桂酸的一種，廣泛存在于啤酒中。而4-VS作為芥子酸的脫羧產(chǎn)物在啤酒中重要的作用。因此，在兩個方面還有必要繼續(xù)深入研究：①4-VS的結(jié)構(gòu)和成分復雜，對于這種物質(zhì)在啤酒中的分離、純化，還沒有標準方法。未來應采用高效液相色譜技術(shù)進行分離、純化，并制備高純度的多酚單體，再采用質(zhì)譜和核磁共振技術(shù)進行結(jié)構(gòu)鑒定，將進一步明確多酚結(jié)構(gòu)、含量和分布。②目前普遍采用化學評價法研究4-VS的抗氧化活性，脫離了有機體獨特的生理環(huán)境，不能反映多酚真實的抗氧化活性及其作用機理。將來應該著重研究4-VS的抗氧化活性對于啤酒質(zhì)量的影響，以及啤酒中4-VS的抑菌作用和對人體健康的影響。