用HPLC法測定人凝血酶制品中甘氨酸的含量

盛鳳仙，張幼捷（上海新興醫(yī)藥股份有限公司，上海 200135）

人纖維蛋白黏合劑是上海新興醫(yī)藥股份有限公司自助研發(fā)的新產(chǎn)品，是由人纖維蛋白原及其滅菌注射用水、人凝血酶及其滅菌氯化鈣溶液4種成分組成，不含防腐劑和抗生素，具有止血、覆蓋、黏合傷口等臨床作用[1-2]。其中主要成分人凝血酶是由健康人的血漿經(jīng)離子交換凝膠法分離純化，并經(jīng)S/D法和納米膜過濾二步滅活和去除病毒、分裝后凍干制成。由于凍干過程是一個復雜的相變過程，在凍結(jié)、凍融、干燥和儲存過程中存在著多種影響因素，而凍干保護劑是影響制品凍干效果的主要因素，甘氨酸在凍干過程中對制品賦型作用顯著，并對制品復溶后的澄清度有一定改善作用，是一種理想的蛋白保護劑[3-4]。公司在生產(chǎn)人血酶制品過程中加入適量甘氨酸作為蛋白保護劑，并且限定其含量為10～30 mg/ml。為了更好地控制產(chǎn)品的質(zhì)量，有必要建立一種甘氨酸的含量檢測方法用于人凝血酶制品的監(jiān)控。筆者參考有關(guān)文獻[5-8]，選用DNFB為柱前衍生劑，利用高效液相色譜法[7]，對人凝血酶制品中甘氨酸的含量測定方法進行探討。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀：安捷倫1260高效液相色譜儀；DNFB（中國醫(yī)藥上?；瘜W試劑公司，分析純）；甘氨酸對照品（國藥集團化學試劑公司，分析純，含量≥99.5%）[7]；丙氨酸對照品（國藥集團化學試劑公司，分析純，含量≥99.0%，）[8]；乙腈（默克公司，色譜純）；人凝血酶（上海新興醫(yī)藥股份有限公司，批號：20150401T、20150402T、20150403T、20150504T；規(guī)格：1 000 IU/瓶）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 甘氨酸對照品溶液

精密稱取甘氨酸對照品約60 mg，置100 ml容量瓶中，用純化水定容，得濃度為0.6 mg/ml的甘氨酸對照品溶液[7]，等待衍生化處理。

2.1.2 供試品溶液

取一瓶待檢人凝血酶供試品，放置于室溫，用配套2 ml（40 mmol/L）氯化鈣溶液溶解，然后輕輕搖動直至完全溶解；精密量取復溶后樣品1.0 ml于試管中，加入4 ml 1.5%磺基水楊酸，混勻，離心，精密量取上清液0.5 ml，置10 ml容量瓶中，用純化水定容，混勻后等待衍生化處理。

2.1.3 陰性對照溶液

精密量取無甘氨酸的人凝血酶樣品溶液1.0 ml，按“2.1.2”項下供試品溶液制備方法操作，即得陰性對照溶液，等待衍生化處理。

2.1.4 內(nèi)標溶液

精密稱取丙氨酸約20 mg，置100 ml容量瓶中，用純化水定容，得濃度為0.2 mg/ml的丙氨酸內(nèi)標溶液，備用[7]。

2.2 衍生化反應(yīng)

精密量取適量體積的甘氨酸對照品溶液或供試品溶液1.0 ml置10 ml容量瓶中，加0.5 ml內(nèi)標溶液，再加0.5 mol/L碳酸氫鈉（pH9.0）溶液1 ml，1%DNFB乙腈溶液0.1 ml，混勻，避光，置60 ℃恒溫水浴中保溫1 h后，取出放冷，用磷酸鹽緩沖液（pH7.0）定容[7]，經(jīng)0.22 μm水溶性膜過濾[8]，濾液備用。

2.3 色譜條件

色譜柱：島津公司Shim-pack CLC-ODS（6.0 mm×150 mm,5 μm）；流動相：50%乙腈溶液-0.05 mol/L醋酸鈉緩沖液（35∶65,）；流速1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；檢測波長360 nm；進樣量20 μl[7]。

2.4 專屬性試驗和系統(tǒng)適用性試驗

精密量取上述制備的陰性對照溶液1.0 ml置10 ml容量瓶中，不加內(nèi)標溶液，另外精密量取按“2.1.1”項下方法制備的對照品溶液0.4 ml、按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液1.0 ml，分別置10 ml容量瓶中，加0.5 ml內(nèi)標溶液，按“2.2”項下方法進行衍生化反應(yīng)，并按“2.3”色譜條件測定，記錄色譜峰。結(jié)果在陰性對照溶液色譜圖1A中僅有衍生化試劑DNFB色譜峰-1[7]；在甘氨酸對照品溶液色譜圖1B和供試品溶液色譜圖1C中，均有衍生化試劑DNFB色譜峰-1（保留時間約為9.9 min）、甘氨酸衍生物峰-2（保留時間約為12.6 min）和丙氨酸衍生物峰-3（保留時間約為19.3 min）3個峰，并且各峰之間完全分離，互不干擾[7]；在圖1B中，甘氨酸衍生物與相鄰兩色譜峰的分離度分別為6.2和12.9，甘氨酸衍生物的拖尾因子為1.11，丙氨酸衍生物的拖尾因子為1.14，均符合《中國藥典》要求，見圖1。

2.5 線性關(guān)系考察

分別精密量取上述制備的甘氨酸對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 ml置10 ml容量瓶中，按“2.2”項下方法進行衍生化反應(yīng)，并按“2.3”項下色譜條件測定，記錄峰面積。以甘氨酸濃度（X，mg/ml）對甘氨酸衍生物峰面積與內(nèi)標丙氨酸衍生物峰面積之比（Y）進行線性回歸，得線性回歸方程為Y=156.794 0X－0.127 2，r=0.999 6。結(jié)果表明甘氨酸濃度在0.006～0.030 mg/ml范圍內(nèi)與峰面積比呈良好線性關(guān)系[7]。

2.6 回收率試驗

精密稱取0.381 9、0.382 3、0.382 3、0.483 8、0.483 0、0.484 4、0.594 4、0.593 6、0.594 1 g甘氨酸對照品，分別置20 ml容量瓶中，用無甘氨酸的人凝血酶樣品溶液定容，配制成19.10、19.12、19.12、24.19、24.15、24.22、29.72、29.68和29.71 mg/ml的甘氨酸對照品溶液，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下方法進行衍生化反應(yīng)，并按“2.3”色譜條件測定，記錄峰面積。結(jié)果平均回收率為100.4%，平均RSD為0.44%，符合要求，詳見表1。

表1 人凝血酶回收率試驗結(jié)果（n=9）

2.7 精密度試驗

精密量取上述制備的甘氨酸對照品溶液0.5 ml置10 ml容量瓶中，按“2.2”項下方法進行衍生化反應(yīng)，并按“2.3”項下色譜條件測定，重復進樣5次，記錄峰面積。結(jié)果甘氨酸衍生物與丙氨酸衍生物峰面積比的RSD為0.19%，表明精密度良好[7]。

2.8 穩(wěn)定性試驗

精密量取按“2.1.2”項下方法配制的供試品溶液1.0 ml（批號：20150504T）置10 ml容量瓶中，按“2.2”項下方法進行衍生化反應(yīng)，分別于0、4、12、13 h按“2.3”色譜條件測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，甘氨酸衍生物與丙氨酸衍生物峰面積比分別為3.960 3、3.960 9、3.961 0、3.961 0，RSD為0.01%，表明衍生化樣品在13 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 重復性試驗

取同一批（批號：20150504T）樣品6份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下方法進行衍生化反應(yīng)，并按“2.3”色譜條件測定，記錄峰面積。結(jié)果制品中甘氨酸含量分別為26.68、26.66、26.66、26.65、26.66、26.64 mg/ml，平均含量為26.66 mg/ml，RSD為0.05%（n=6），表明方法重復性良好[7]。

2.10 樣品含量測定

精密量取按“2.1.2”項下方法制備的供試品溶液1.0 ml（批號：20150401T、20150402T、20150403T），按“2.2”項下方法進行衍生化反應(yīng)，并按“2.3”色譜條件測定，記錄峰面積。結(jié)果符合要求，見表2。

表2 樣品中甘氨酸含量測定結(jié)果（n=2）

3 討論

3.1 系統(tǒng)適用性試驗符合要求

本實驗條件下，在陰性對照溶液色譜圖中僅有衍生劑DNFB色譜峰,無其他雜質(zhì)峰，無干擾，專屬性好；在對照品溶液的典型圖譜中，甘氨酸衍生物與相鄰兩峰完全分離，分離度均大于1.5，甘氨酸和丙氨酸拖尾因子均在0.95～1.40范圍內(nèi)，符合《中國藥典》要求。

3.2 實驗原理

本實驗采用的蛋白質(zhì)沉淀劑為磺基水楊酸，DNFB為柱前衍生劑，在堿性條件下氨基酸與DNFB迅速縮合生成二硝基苯氨基酸（DNP-氨基酸）[7]，該衍生化產(chǎn)物在紫外360 nm處有較強的吸收，且較穩(wěn)定，不易分解，能滿足HPLC法分離和檢測的要求[8]。

3.3 本法特點

本實驗儀器配置要求不高，且操作簡便、結(jié)果準確，可用于人凝血酶制品中甘氨酸的含量測定。