二氫卟吩p6醚類光敏劑的合成及光動(dòng)力抗癌活性研究

馬福家，孟 志，張星杰，王 媛，馬志強(qiáng)，姚建忠,（. 海軍軍醫(yī)大學(xué)海軍特色醫(yī)學(xué)中心藥劑科，上海0005；. 海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 004；. 寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，寧夏 銀川 750004）

光動(dòng)力治療（photodynamic therapy，PDT）是一種基于光化學(xué)的腫瘤治療新技術(shù)。PDT通過定向光照攝入光敏劑的腫瘤組織，由光、腫瘤組織中的氧和光敏劑三者聯(lián)合作用產(chǎn)生單線態(tài)氧、超氧陰離子和自由基等活性氧物質(zhì)（reactive oxygen species，ROS），其中，ROS通過啟動(dòng)3種抗腫瘤生物機(jī)制而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[1-3]：①ROS直接殺傷腫瘤細(xì)胞；②腫瘤相關(guān)性血管閉合，導(dǎo)致腫瘤組織發(fā)生大面積缺血性壞死；③激活機(jī)體內(nèi)的抗腫瘤免疫記憶和系統(tǒng)免疫反應(yīng)。

卟啉、二氫卟吩和菌綠素等四吡咯類化合物是目前研究最多的一類光敏劑。第一代卟啉類光敏劑卟吩姆鈉（porfimer sodium）和喜泊芬等最早獲批用于臨床腫瘤PDT，并取得了顯著療效，但存在成分復(fù)雜結(jié)構(gòu)不明確、最大吸收波長短（～630 nm）且摩爾吸收系數(shù)小使630 nm激光對(duì)病灶組織的穿透性差、體內(nèi)代謝慢導(dǎo)致滯留光敏副作用持續(xù)時(shí)間長等缺陷。相比卟啉類光敏劑，二氫卟吩及菌綠素類化合物具有化學(xué)結(jié)構(gòu)明確、最大吸收波長長（＞650 nm）且吸收系數(shù)高一個(gè)數(shù)量級(jí)（該波長激光對(duì)組織穿透更深）、單線態(tài)氧產(chǎn)率高（光敏作用更強(qiáng)）、體內(nèi)清除快（滯留光毒性?。┑葍?yōu)點(diǎn)，已成為新一代光敏劑的研究熱點(diǎn)[4-8]。其中，他拉泊芬（talaporfin）、維替泊芬（verteporfin）、替莫泊芬（temoporfin）和帕利泊芬（padeliporfin）已先后獲批上市[9-10]。

紫紅素-18（4）為二氫卟吩類葉綠素a穩(wěn)定降解產(chǎn)物，具有顯著的PDT抗癌活性[11]，但其內(nèi)酸酐環(huán)化學(xué)性質(zhì)活潑、成藥性差，而其內(nèi)酸酐水解物二氫卟吩p6（3）又極不穩(wěn)定，室溫放置即很快脫水變回4。課題組前期研究表明，二氫卟吩f的3-乙烯基成醚修飾具有更強(qiáng)的體內(nèi)外光敏抗腫瘤活性[12-13]，據(jù)此，本文以蠶沙葉綠素a粗提物（糊狀葉綠素）酸水解產(chǎn)物脫鎂葉綠酸a（5）經(jīng)強(qiáng)堿條件下通空氣氧化降解制得的4[14]為先導(dǎo)，通過堿水解及CH2N2甲基化制得的二氫卟吩p6三甲酯（2）為關(guān)鍵中間體，與33% HBr加成后再和烷氧醇發(fā)生親核取代而設(shè)計(jì)合成化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的二氫卟吩p6醚類衍生物1a-1f，以期篩選獲得高效、低毒的PDT治癌藥物候選化合物，合成路線見圖1。

1 化學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

核磁氫譜（1H NMR）和碳譜（13C NMR）用Bruker MSL-300和600型核磁共振儀測定，TMS為內(nèi)標(biāo)；電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）用API-3000LC-MS型質(zhì)譜儀測定；高分辨質(zhì)譜（ESIHRMS）用Agilent 6538 UHD Accurate-Mass QTOF LC/MS型質(zhì)譜儀測定。紫外譜（UV）用島津UV-160型紫分光光度計(jì)測定。

1.1.2 試劑

柱層析硅膠H（60型）由青島海洋化工集團(tuán)公司出品。糊狀葉綠素由浙江省海寧市天然色素廠生產(chǎn)。脫鎂葉綠酸a（5）和紫紅素-18（4）均按文獻(xiàn)[14]方法制備。其余所用化學(xué)試劑和溶劑均為市售化學(xué)純商品。

1.2 二氫卟吩p6醚類衍生物（1a-1f）的合成

1.2.1 二氫卟吩p6三甲酯（2）的合成

取化合物4（1.0 g，1.77 mmol）溶于四氫呋喃（THF）（25 ml），加甲醇（100 ml）和0.5 M NaOH水溶液（125 ml），室溫?cái)嚢璺磻?yīng)45 min，用稀H2SO4調(diào)節(jié)pH至5～6，乙醚萃?。?0 ml×3），無水Na2SO4干燥，乙醚液于冰鹽浴條件下加入新鮮配制的2.8%（W/V）重氮甲烷乙醚液（CH2N2-Et2O）（10 ml），反應(yīng)5 min，加少量乙酸，水洗，減壓回收溶劑，硅膠H柱色譜分離得黑色粉末2（0.92 g），產(chǎn)率83.2%。UV-vis λmax(THF, nm)：666, 611, 530,501, 402。1H NMR (CDCl3, δ, ppm)：9.96 (s, 1H, 10-H), 9.38 (s, 1H, 5-H), 8.68 (s, 1H, 20-H), 7.92 (dd,1H,J=17.9 and 11.5 Hz, 31-H), 6.28 (d, 1H,J=17.9 Hz,32-HB), 6.10 (d, 1H,J=11.5 Hz, 32-HA), 4.46 (m, 2H,17-H and 18-H), 4.24 (s, 3H, 151-OCH3), 4.20 (s, 3H,131-OCH3), 3.88 (s, 3H, 173-CH3), 3.59 (s, 3H, 12-CH3), 3.38 (s, 3H, 7-CH3), 3.18 (s, 3H, 2-CH3), 3.55(q, 2H,J=7.5 Hz, 81-CH2), 2.51～2.10 (m, 4H, 17-CH2CH2), 1.85 (d, 3H,J=7.2 Hz, 18-Me), 1.62 (t, 3H,J=7.5 Hz, 82-Me)。MS (ESI+)m/z：625.48 [M+H]+(100%)。

1.2.2 3-去乙烯基-3-(1-甲氧基)乙基二氫卟吩p6-13,15-二甲酯（1a）的合成

取化合物2（100 mg, 0.16 mmol），磁力攪拌下用注射器緩慢加入33%氫溴酸冰醋酸溶液（20 ml），避光密封條件下室溫繼續(xù)攪拌反應(yīng)36 h。反應(yīng)完畢，減壓蒸除過量氫溴酸和冰醋酸得黑色固體。所得黑色固體溶于干燥CH2Cl2（50 ml），加入K2CO3（100 mg）和干燥甲醇（2 ml），氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌室溫反應(yīng)2.5 h。反應(yīng)完畢，加3倍量水，分取有機(jī)層，水洗3次，減壓回收CH2Cl2，硅膠H柱色譜分離（洗脫劑：二氯甲烷/甲醇/丙酮/甲酸=100/2/2/0.1），得黑色固體產(chǎn)物1a，34.6 mg，收率32.7%。UV-vis λmax(THF, nm)：662, 608, 525, 497, 397。1H NMR(300 MHz, DMSO-d6, δ, ppm): 12.08 (s, 1H, CO2H),9.79 (s, 2H, 10- and 5-H), 8.98 (s, 1H, 20-H), 5.97(m, 1H, 31-H), 4.99 (m, 1H, 17-H), 4.55 (m, 1H, 18-H), 4.14 (s, 3H, 151-OCH3), 4.10 (s, 3H, 131-OCH3),3.73 (m, 2H, 81-CH2), 3.60 (s, 3H, 12-CH3), 3.47 (s,3H, 31-OCH3), 3.30 (s, 3H, 7-CH3), 3.21 (s, 3H, 2-CH3), 2.35 (m, 2H, 172-CH2), 2.15 (m, 2H, 171-CH2),2.00 (d, 3H, 18-CH3), 1.78 (d, 3H, 32-CH3), 1.61 (t,3H, 82-CH3), -1.16 (s, 1H, NH), -1.30 (s, 1H, NH)。MS (ESI+)m/z: 643.73 [M+H]+(100%)； (ESI-)m/z:641.62 [M-H]-(100%)； HRMS (ESI-)m/z: 642.3059[M]-, calcd for C36H42N4O7642.3053。

1.2.3 3-去乙烯基-3-(1-乙氧基)乙基二氫卟吩p6-13,15-二甲酯（1b）的合成

同1a合成操作，由化合物2（100 mg, 0.16 mmol）和33%氫溴酸冰醋酸溶液（20 ml）反應(yīng)得到的氫溴酸加成物與無水乙醇（2 ml）反應(yīng)制得黑色固體產(chǎn)物1b，收率28.2%。UV-vis λmax(THF, nm)：662,606, 577, 499, 398。MS (ESI+)m/z: 657.50 [M+H]+(100%)。1H NMR [300 MHz, DMSO-d6, δ, ppm]:12.07 (s, 1H, CO2H), 9.62 (s, 1H, 10-H), 9.06 (s, 1H,5-H), 8.82 (s, 1H, 20-H), 5.91 (m, 1H, 31-H), 4.92 (m,1H, 17-H), 4.51 (m, 1H, 18-H), 4.32 (s, 3H, 151-OCH3), 4.15 (s, 3H, 131-OCH3), 3.69 (m, 2H, 81-CH2), 3.58 (s, 3H, 12-CH3), 3.45 (m, 2H, 31-OCH2CH3), 3.33 (s, 3H, 7-CH3), 3.22 (s, 3H, 2-CH3),2.32 (m, 2H, 172-CH2), 2.21 (m, 2H, 171-CH2), 1.96(d, 3H, 18-CH3), 1.83 (d, 3H, 32-CH3), 1.63 (t, 3H, 82-CH3), 0.91 (m, 3H, 31-OCH2CH3), -1.01 (s, 1H, NH),-1.26 (s, 1H, NH)。

1.2.4 3-去乙烯基-3-(1-正丙氧基)乙基二氫卟吩p6-13,15-二甲酯（1c）的合成

同1a合成操作，由化合物2（100 mg, 0.16 mmol）和33%氫溴酸冰醋酸溶液（20 ml）反應(yīng)得到的氫溴酸加成物與無水正丙醇（2 ml）反應(yīng)制得黑色固體產(chǎn)物1c，收率32.1%。UV-vis λmax(THF, nm)：661,578, 543, 499, 400。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6,δ, ppm): 12.06 (s, 1H, CO2H), 9.85 (s, 1H, 10-H),9.72 (s, 1H, 5-H), 8.97 (s, 1H, 20-H), 5.96 (m, 1H, 31-H), 4.99 (m, 1H, 17-H), 4.57 (m, 1H, 18-H), 4.14 (s,3H, 151-OCH3), 4.12 (s, 3H, 131-OCH3), 3.69 (m, 2H,81-CH2), 3.57 (s, 3H, 12-CH3), 3.38 (m, 2H, 31-OCH2C2H5), 3.30 (s, 3H, 7-CH3), 3.16 (s, 3H, 2-CH3), 2.37 (m, 2H, 172-CH2), 2.13 (m, 2H, 171-CH2),1.97 (d, 3H, 18-CH3), 1.80 (d, 3H, 32-CH3), 1.64 (t,3H, 82-CH3), 1.56 (m, 2H, 31-OCH2CH2CH3), 0.89 (t,3H, 31-OCH2CH2CH3), -1.13 (s, 1H,, NH), -1.28 (s,1H,, NH)。MS (ESI+)m/z: 671.46 [M+H]+(100%)；MS (ESI-)m/z: 669.48 [M-H]-(100%)。

1.2.5 3-去乙烯基-3-(1-正丁氧基)乙基二氫卟吩p6-13,15-二甲酯（1d）的合成

同1a合成操作，由化合物2（100 mg, 0.16 mmol）和33%氫溴酸冰醋酸溶液（20 ml）反應(yīng)得到的氫溴酸加成物與無水正丁醇（2 ml）反應(yīng)制得黑色固體產(chǎn)物1d，收率27.8%。UV-vis λmax(THF, nm)：661,579, 545, 498, 400。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6,δ, ppm): 12.02 (s, 1H, CO2H), 9.83 (s, 1H, 10-H),9.66 (s, 1H, 5-H), 8.98 (s, 1H, 20-H), 5.88 (m, 1H, 31-H), 5.05 (m, 1H, 17-H), 4.58 (m, 1H, 18-H), 4.16 (s,3H, 151-OCH3), 4.15 (s, 3H, 131-OCH3), 3.58 (m, 2H,81-CH2), 3.55 (s, 3H, 12-CH3), 3.47 (m, 2H, 31-OCH2C3H7), 3.35 (s, 3H, 7-CH3), 3.10 (s, 3H, 2-CH3), 2.40 (m, 2H, 172-CH2), 2.12 (m, 2H, 171-CH2),1.92 (d, 3H, 18-CH3), 1.83 (d, 3H, 32-CH3), 1.68 (t,3H, 82-CH3), 1.60-1.30 (m, 4H, 31-OCH2(CH2)2CH3),0.72 (t, 3H, 31-OCH2CH2CH2CH3), -1.13 (s, 1H,NH), -1.25 (s, 1H, NH)。13C NMR (600 MHz,DMSO-d6, δ, ppm): 174.91, 174.38, 170.22, 167.59,166.58, 145.46, 141.12, 140.85, 137.70, 136.20,135.17, 134.73, 132.66, 129.09, 112.95, 104.73,103.70, 101.03, 94.46, 72.41, 68.82, 53.24, 52.90,52.73, 48.81, 41.72, 34.11, 32.22, 31.91, 29.23,24.83, 23.89, 21.82, 19.49, 19.09, 17.90, 14.13,12.49, 11.09。MS (ESI+)m/z: 685.49 [M+H]+(100%)； MS (ESI-)m/z: 683.43 [M - H]-(52%),1367.12 [2M - H]-(100%)。

1.2.6 3-去乙烯基-3-(1-正戊氧基)乙基二氫卟吩p6-13,15-二甲酯（1e）的合成

同1a合成操作，由化合物2（100 mg, 0.16 mmol）和33%氫溴酸冰醋酸溶液（20 ml）反應(yīng)得到的氫溴酸加成物與無水正戊醇（2 ml）反應(yīng)制得黑色固體產(chǎn)物1e，收率26.7%。UV-vis λmax(THF, nm)：661,581, 542, 499, 401。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6,δ, ppm): 12.01 (s, 1H, CO2H), 9.87 (s, 1H, 10-H),9.78 (s, 1H, 5-H), 8.97 (s, 1H, 20-H), 5.96 (m, 1H, 31-H), 4.99 (m, 1H, 17-H), 4.56 (m, 1H, 18-H), 4.15 (s,3H, 151-OCH3), 4.12 (s, 3H, 131-OCH3), 3.66 (m, 2H,81-CH2), 3.60 (s, 3H, 12-CH3), 3.49 (m, 2H, 31-OCH2C4H9), 3.38 (s, 3H, 7-CH3), 3.19 (s, 3H, 2-CH3), 2.36 (m, 1H, 172-CH2), 2.06 (m, 2H, 171-CH2),1.99 (d, 3H, 18-CH3), 1.80 (d, 3H, 32-CH3), 1.66 (t,3H, 82-CH3), 1.60-1.28 (m, 6H, 31-OCH2(CH2)3CH3),0.74 (t, 3H, 31-OCH2CH2CH2CH2CH3), -1.14 (s, 1H,NH), -1.27 (s, 1H, NH)。13C NMR (600 MHz,DMSO-d6, δ, ppm): 174.91, 174.34, 170.17, 167.49,166.57, 145.71, 140.90, 137.69, 136.40, 135.20,132.73, 129.02, 12.91, 104.92, 103.60, 101.11, 94.43,72.44, 72.39, 69.14, 53.24, 52.81, 52.72, 48.72,34.16, 31.68, 31.33, 29.84, 29.39, 28.57, 25.61,24.55, 23.47, 22.10, 19.19, 18.06, 14.24, 12.54,11.30, 11.12。MS (ESI+)m/z: 699.52 [M+H]+(100%)； MS (ESI-)m/z: 697.41 [M-H]-(67%),1395.16 [2M-H]-(100%)。

1.2.7 3-去乙烯基-3-(1-正己氧基)乙基二氫卟吩p6-13,15-二甲酯（1f）的合成

同1a合成操作，由化合物2（100 mg, 0.16 mmol）和33%氫溴酸冰醋酸溶液（20 ml）反應(yīng)得到的氫溴酸加成物與無水正己醇（2 ml）反應(yīng)制得黑色固體產(chǎn)物1f，收率36.3%。UV-vis λmax(THF, nm)：660,582, 544, 498, 401。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6,δ, ppm): 12.07 (s, 1H, CO2H), 9.81 (s, 1H, 10-H),9.67 (s, 1H, 5-H), 8.95 (s, 1H, 20-H), 5.87 (m, 1H, 31-H), 5.02 (m, 1H, 17-H), 4.56 (m, 1H, 18-H), 4.15 (s,3H, 151-OCH3), 4.13 (s, 3H, 151-OCH3), 3.55 (s, 3H,12-CH3), 3.51 (m, 2H, 81-CH2), 3.37 (m, 2H, 31-OCH2C5H11), 3.34 (s, 3H, 7-CH3), 3.11 (s, 3H, 2-CH3), 2.40～2.10 (m, 4H, 17-CH2CH2), 1.93 (d, 3H,18-CH3), 1.81 (d, 3H, 32-CH3), 1.68 (t, 3H, 82-CH3),1.52 (m, 3H), 1.52～1.47 (m, 8H, 31-OCH2(CH2)4CH3),0.56 (t, 3H, 31-O(CH2)5CH3), -1.13 (s, 1H, NH), -1.27(s, 1H, NH)。13C NMR (600 MHz, DMSO-d6, δ,ppm): 173.84, 173.48, 169.72, 166.87, 166.10,154.25, 148.25, 145.10, 140.48, 137.06, 135.85,134.65, 134.00, 132.10, 128.50, 122.41, 104.30,103.11, 100.67, 93.80, 71.90, 68.61, 53.24, 52.70,52.38, 48.28, 31.24, 30.95, 29.54, 28.76, 25.44,24.41, 23.36, 21.85, 18.61, 17.45, 13.57, 11.97,10.57。MS (ESI+)m/z: 713.45 [M+H]+(100%)。

2 體外光動(dòng)力抗腫瘤活性測試

2.1 實(shí)驗(yàn)方法

2.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠黑色素B16-F10細(xì)胞（中科院上海細(xì)胞庫）在含2 mg/ml 的碳酸氫鈉、4.5 mg/ml葡萄糖、100 μg/ml鏈霉素硫酸鹽、40 mg/ml慶大霉素、100 U/ml青霉素、10%（V/V）熱滅活胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培養(yǎng)基（Hyclone, Logan, UT, USA）中，置于5%CO2溫度為37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.1.2 細(xì)胞暗毒性

于96孔板上每孔接種5×103個(gè)B16-F10細(xì)胞，按“2.1.1”項(xiàng)條件培養(yǎng)。取待測樣品配成已知濃度的二甲基亞砜待測液，用PBS稀釋成不同濃度后加入細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。將細(xì)胞培養(yǎng)液吸出，加入含10%（V/V）CCK-8（Dojindo Laboratories,Japan）的培養(yǎng)液200 μl，繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h，然后用酶標(biāo)儀（Tecan, Switzerland）與波長450 nm處測定每孔的吸光度值，相應(yīng)測算細(xì)胞存活率，并計(jì)算各待測樣品的半數(shù)抑制腫瘤生長濃度（IC50值）。

2.1.3 細(xì)胞光毒性

于96孔板上每孔接種5×103個(gè)B16-F10細(xì)胞，按“2.1.1”項(xiàng)條件培養(yǎng)，加入已知濃度的待測樣品，培養(yǎng)24 h。然后用678 nm波長的光照射，光劑量10 J/cm2，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。再按“2.1.2”項(xiàng)所述CCK-8法測定細(xì)胞存活率，并計(jì)算各待測樣品的IC50值。

2.2 活性測試結(jié)果

以臨床光敏藥物維替泊芬和他拉泊芬為陽性對(duì)照藥，受試化合物對(duì)小鼠黑色素B16-F10細(xì)胞的PDT抗癌活性結(jié)果見表1。

表1 目標(biāo)化合物對(duì)B16-F10細(xì)胞的PDT抗癌活性

3 結(jié)果與討論

以蠶沙葉綠素a粗提物（糊狀葉綠素）酸堿氧化降解產(chǎn)物紫紅素-18（4）為先導(dǎo)物，經(jīng)氫溴酸加成和烷氧醇取代反應(yīng)成功合成得到了二氫卟吩p6醚類光敏劑1a-1f（圖1），但兩步反應(yīng)總收率偏低，僅為22.2%～30.2%，需要開展后續(xù)合成工藝優(yōu)化研究。

目標(biāo)化合物1a-1f的結(jié)構(gòu)經(jīng)ESI-MS、1H NMR、13C NMR及ESI-HRMS確證。由表1結(jié)果可見，所有目標(biāo)化合物對(duì)小鼠黑色素B16-F10細(xì)胞的光毒性隨醚鍵碳鏈增長而增強(qiáng)（1f≥1e＞1d＞1c≥1b＞1a），相比臨床同類光敏藥物維替泊芬和他拉泊芬分別強(qiáng)4.2～7.2倍和29.3～49.8倍，且均具有更高的暗毒/光毒比，提示二氫卟吩p6醚類光敏劑具有光動(dòng)力抗癌活性強(qiáng)、治療指數(shù)（暗毒/光毒比）高等優(yōu)點(diǎn)，值得開發(fā)研究。