鉛（Pb2+）和鎘（Cd2+）對火炬樹種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

曲同寶，楊塍希，馬文育，王 影

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，吉林 長春 130118）

土壤重金屬污染不僅影響到土壤生態(tài)功能，也威脅到人類健康與社會發(fā)展，因此一直受到人們廣泛關(guān)注[1]。引起土壤環(huán)境污染的常見重金屬有汞（Hg）、鉛（Pb）、鎘（Cd）、砷（As）、銀（Ag）等具有生物毒性元素，以及過量則具有毒性的鋅（Zn）、銅（Cu)、鎳（Ni）、鉻（Cr）等微量元素[2]，其中鉛、鎘已成為我國城市地表土壤中含量超標(biāo)最多的重金屬，且富集情況嚴(yán)重[3-4]。近年來，大量電子垃圾混入生活垃圾后被堆埋至城郊、鄉(xiāng)鎮(zhèn)等簡易垃圾場，致使垃圾場及其周圍土壤環(huán)境鉛、鎘大量積累，加劇了城市土壤重金屬污染問題[5]。以往鉛、鎘對植物的毒害作用和植物對這兩種重金屬的解毒機(jī)理的研究，多集中在生物量小且生長緩慢的草本超富集植物方面[6-8]，找尋生物量大、生長速度快的木本耐重金屬污染植物顯得尤為重要。植物種子萌發(fā)時(shí)期對外界環(huán)境極為敏感，通過研究重金屬脅迫條件下種子萌發(fā)能力與幼苗生長特性，可一定程度反映植物對重金屬的耐受性[9]。研究發(fā)現(xiàn)，隨著重金屬鉛和鎘濃度的增加，許多林木種子的發(fā)芽率呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，但是不同的植物表現(xiàn)不同[10]。

火炬樹Rhus typhina是漆樹科Anacardiaceae鹽膚木屬Rhus落葉灌木或亞喬木，有一定入侵性，但因其具有繁殖速度快、生態(tài)位廣闊、抗旱保水、耐鹽堿、適應(yīng)性極強(qiáng)等特點(diǎn)，現(xiàn)被廣泛應(yīng)用于荒山造林與城市園林建設(shè)[11-12]。Bache 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，火炬樹葉片中存在鎘的積累；陳穎等[14-15]研究表明火炬樹根孽苗也可用于尾礦地水土的保持，這表明火炬樹對鉛、鎘2 種重金屬表現(xiàn)出一定的抗性與富集能力，具備作為植物修復(fù)的前提條件，但目前火炬樹對重金屬鉛、鎘脅迫的耐受程度及抗性機(jī)理仍不清楚。本研究以火炬樹種子為試驗(yàn)材料，測定不同程度重金屬鉛、鎘脅迫對火炬樹種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、幼苗生長形態(tài)指標(biāo)的影響，探討其耐重金屬鉛和鎘的相關(guān)機(jī)理，以期為工礦業(yè)廢棄地、垃圾填埋場等重金屬污染嚴(yán)重土壤選用植物修復(fù)材料提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

火炬樹種子采自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)，千粒重為10.46 g（采用砂紙?zhí)幚砣コt色絨毛狀蠟質(zhì)外種皮）。

1.2 種子處理與萌發(fā)

首先用90 ℃開水進(jìn)行浸種，待開水自然冷卻后浸泡24 h，再用蒸餾水浸泡2 h，無菌濾紙吸干待用[16]。根據(jù)城市垃圾填埋場重金屬污染程度設(shè)定Pb2+、Cd2+濃度[17]。Pb(NO3)2和CdCl2作為供源，均為分析純試劑。Pb2+溶液濃度設(shè)定為0（以去離子水為對照）、300、600、900、1 200、1 500 mmol/L；Cd2+溶液濃度設(shè)定為0（以去離子水為對照）、140、280、420、560、700 mmol/L。

將兩張濾紙平鋪于直徑9 cm 玻璃培養(yǎng)皿中，進(jìn)行高溫滅菌處理。滅菌后分別加入以上處理液 3 mL，并保證濾紙充分浸濕且無氣泡。每個(gè)培養(yǎng)皿中放入經(jīng)催芽后大小均一、籽粒飽滿、結(jié)構(gòu)完整的火炬樹種子30 粒，每個(gè)處理重復(fù)3 次。最后將培養(yǎng)皿置于人工氣候培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，相對濕度為60%。光照培養(yǎng)條件：溫度25±1℃，光強(qiáng)3 500 lx，時(shí)間14 h。黑暗培養(yǎng)條件：溫度20±1℃，時(shí)間10 h。依據(jù)濾紙濕度情況，1～2 d補(bǔ)充相應(yīng)濃度的處理液1 mL，每24 h 觀察并記錄種子萌發(fā)情況。

1.3 發(fā)芽指標(biāo)與形態(tài)學(xué)指標(biāo)的測定

以胚根突破種皮2 mm 為種子萌發(fā)標(biāo)志，待發(fā)芽末期連續(xù)2 d 無萌發(fā)時(shí)視為發(fā)芽結(jié)束，共計(jì)7 d。統(tǒng)計(jì)植物發(fā)芽數(shù)，計(jì)算發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)；測量不同處理下幼苗的胚根長和莖長，計(jì)算根伸長抑制率、芽伸長抑制率。

（1）式中：GR為發(fā)芽率；A為發(fā)芽種子數(shù)；B為供試種子數(shù)。

式中：GI為發(fā)芽指數(shù)；Gt為種子在第t日的發(fā)芽數(shù)；Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)。

式中：Ir為根伸長抑制率；Cr為對照組根長；Tr為處理組根長。

式中：Is為芽伸長抑制率；Cs為對照組芽長；Ts為處理組芽長。

1.4 生理指標(biāo)的測定

火炬樹出苗10 d 后測定相關(guān)生理指標(biāo)。硫代巴比妥酸（TBARS）含量的測定采用比色法[18]；可溶性蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)G-250 染色法；超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定采用氮藍(lán)四唑光還原法；過氧化物酶（POD）活性的測定采用愈創(chuàng)木酚顯色法[19]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2016 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，用Sigmaplot 14.0 作圖。用SPSS17.0 進(jìn)行單因素方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pb2+、Cd2+脅迫對火炬樹種子萌發(fā)的影響

研究結(jié)果顯示，不同濃度的Pb2+、Cd2+溶液均可對火炬樹種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)產(chǎn)生顯著影響（P＜0.05）。隨著2 種重金屬濃度的升高，發(fā)芽率均顯著降低。當(dāng)Pb2+濃度為1 500 mmol/L和Cd2+濃度為700 mmol/L 時(shí)，抑制作用最強(qiáng)，發(fā)芽率分別為72.22%和64.45%，比對照降低了21.05%、29.55%；發(fā)芽指數(shù)分別為5.55 和4.17，比對照降低了22.49%、41.76%（表1）。

表1 重金屬對火炬樹種子萌發(fā)的影響?Table 1 Effects of heavy metal on seed germination of R. typhina

2.2 Pb2+、Cd2+ 脅迫對火炬樹幼苗根及芽伸長的抑制效果

火炬樹幼苗生長對重金屬Pb2+、Cd2+脅迫表現(xiàn)出不同的響應(yīng)（P＜0.05）（圖1）。Pb2+處理對火炬樹幼苗根伸長、芽伸長產(chǎn)生低濃度促進(jìn)而高濃度抑制的效應(yīng)：當(dāng)Pb2+濃度為300 mmol/L 時(shí)，與對照相比，根長和芽長伸長得到促進(jìn)；當(dāng)Pb2+濃度為1 500 mmol/L 時(shí)，抑制作用顯著，根伸長抑制率為65.68%，芽抑制率為25.74%。Cd2+脅迫下，隨著濃度的增加抑制作用更加明顯，根長、芽長均顯著低于對照組，Cd2+濃度與抑制率呈正相關(guān)。重金屬對火炬樹幼苗根的伸長抑制效果均大于對芽的抑制效果（表2）。

2.3 Pb2+、Cd2+脅迫對火炬樹幼苗生理活性的影響

2.3.1 對TBARS 含量的影響

隨著溶液濃度的增加，TBARS 含量先減少后增加。當(dāng)重金屬Pb2+濃度小于600 mmol/L、Cd2+濃度小于140 mmol/L 時(shí)，火炬樹幼苗體內(nèi)TBARS 含量呈降低趨勢，但是當(dāng)Pb2+濃度為 300 mmol/L 時(shí)，TBARS 含量與對照相比差異不顯著。當(dāng)Pb2+濃度為1 500 mmol/L 和Cd2+濃度為700 mmol/L 時(shí)，TBARS 含量分別較對照增加了77.96%和107.45%，與對照呈顯著差異（P＜0.05）（表3）。TBARS 含量不斷積累，表明植物葉片細(xì)胞膜損傷程度逐漸增強(qiáng)。

2.3.2 對可溶性蛋白含量的影響

隨著2 種重金屬濃度的增加，可溶性蛋白含量均呈先升高后降低的趨勢，各處理組均高于對照組，且差異顯著（P＜0.05）（表3）。當(dāng)Pb2+濃度為600 mmol/L、Cd2+濃度為280 mmol/L 時(shí)，對可溶性蛋白含量的促進(jìn)效果最強(qiáng)，分別比對照高了347.67%和152.71%（P＜0.05），可通過火炬樹幼苗體內(nèi)可溶性蛋白含量的高低變化間接表明其總代謝能力的強(qiáng)弱。

圖1 重金屬Pb2+、Cd2+對火炬樹幼苗形態(tài)特征的影響Fig.1 Seedling morphology characteristics of R.typhina under Pb2+ and Cd2+ stress

表2 根長與芽長抑制率的回歸方程?Table 2 The inhibition regression equation of root and shoot

2.3.3 對SOD 酶活性的影響

2 種重金屬對火炬樹幼苗葉片SOD 活性均表現(xiàn)出低濃度促進(jìn)而高濃度抑制的作用（P＜0.05）（表3）。當(dāng)Pb2+濃度為900 mmol/L 時(shí)，火炬樹幼苗SOD 活性的產(chǎn)生能力最強(qiáng)，比對照提高了60.98%，與對照呈顯著差異（P＜0.05）。當(dāng)Pb2+濃度為900 mmol/L、Cd2+濃度為280 mmol/L 時(shí)，SOD 酶活性開始降低；在Pb2+濃度為 1 500 mmol/L 與Cd2+濃度為700 mmol/L 下，酶活性水平顯著降低并達(dá)到最小值，分別比對照降低了34.53%、56.54%，與對照呈顯著差異（P＜0.05）。

2.3.4 對POD 活性的影響

火炬樹幼苗體內(nèi)POD 活性隨著2 種重金屬溶液濃度梯度的升高大致呈遞增趨勢（表3）。隨著Pb2+濃度的升高，POD 活性迅速提高，當(dāng)濃度為1 500 mmol/L 時(shí)，POD 活性達(dá)到最大值，比對照提高了149.44%，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的促進(jìn)作用。在Cd2+處理下，酶活性僅在濃度為420 mmol/L 時(shí)較對照降低了1.68%，而后隨處理濃度增大呈急劇增大的趨勢，并均顯著高于對照，在濃度為700 mmol/L時(shí)，比對照增加了107.87%（P＜0.05）。

表3 重金屬對火炬樹生理指標(biāo)的影響?Table 3 Effects of heavy metal on physiological indexes of R.typhina

3 結(jié)論與討論

1）Pb2+、Cd2+作為植物非必需元素，對植物的毒害深遠(yuǎn)，從植物種子萌發(fā)、幼苗生長和成熟植株開花結(jié)實(shí)等都會有很強(qiáng)的毒害作用，可抑制植物呼吸作用、固氮作用和光合作用等代謝活動，使植物的生長發(fā)育受到影響[20-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度重金屬Pb2+、Cd2+脅迫均抑制火炬樹種子萌發(fā)，這與2 種重金屬對毛竹Phyllostachys pubescens[10]和黑麥草Lolium perenne[20]種子脅迫的研究結(jié)果一致。火炬樹幼苗期根和芽伸長抑制率隨Cd2+濃度增加而增大，但Pb2+脅迫時(shí)則表現(xiàn)出低濃度促進(jìn)而高濃度抑制的效果。低濃度Pb2+可能誘導(dǎo)產(chǎn)生了少量活性氧（ROS），如羥基自由基（-OH），能促使植物根細(xì)胞壁變疏松，從而促進(jìn)根伸長生長；隨著處理濃度的增大或時(shí)間的增加，ROS 過度積累，導(dǎo)致植物細(xì)胞質(zhì)膜中不飽和脂肪酸氧化，膜結(jié)構(gòu)受損而功能失調(diào)，進(jìn)而影響植物生長[23]。本研究中，2 種重金屬對幼苗根系產(chǎn)生的毒害作用比對芽更為顯著，這與毛竹[10]、楓香Liquidambar formosana[24]的結(jié)果一致，可能是因?yàn)楦考?xì)胞壁大量固定的Pb2+會影響Ca2+跨膜運(yùn)輸，使Ca-ATP 酶與鈣調(diào)素CAM 無法激活，影響根尖細(xì)胞的有絲分裂，減少植物根系對其他營養(yǎng)成分的吸收，最終抑制植株地上部分的生長[25]。

2）TBARS 表示植物質(zhì)膜過氧化水平及細(xì)胞膜受傷害程度，TBARS 含量越高，膜質(zhì)過氧化水平越高，過量的TBARS 能夠降低和改變質(zhì)膜的流動性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，最終破壞質(zhì)膜的完整性[26]。本試驗(yàn)中，隨著重金屬濃度的增加，火炬樹幼苗葉片中TBARS 含量呈逐漸上升趨勢，這與水稻Oryza sativa[27]和小麥Typha angustifolia[28]在重金屬脅迫下研究結(jié)果一致。研究表明，TBARS 的增長在一定程度上反映了植物體內(nèi)氧自由基的數(shù)量與狀態(tài)，重金屬脅迫下TBARS 含量越高，羥基自由基（-OH）、超氧自由基（-O2-）等自由基積累量越高。氧自由基在強(qiáng)氧化劑過氧化氫（H2O2）作用下，通過Habe-weiss 反應(yīng)可產(chǎn)生攻擊力更強(qiáng)的-OH，啟動膜脂過氧化，進(jìn)一步導(dǎo)致TBARS 的增加并對植物產(chǎn)生傷害[29]。

3）可溶性蛋白作為植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，其含量的高低可間接代表植物體總代謝能力的強(qiáng)弱，也是體現(xiàn)植物應(yīng)對重金屬脅迫能力強(qiáng)弱的一個(gè)關(guān)鍵生理參數(shù)[30]?；鹁鏄溆酌珞w內(nèi)可溶性蛋白隨著重金屬濃度的增加呈先增加后降低的趨勢，這與尚宏芹等[9]用Cd2+處理桔梗Platycodon grandiflorus種子的結(jié)果相似。在低濃度下，重金屬Pb2+與金屬硫蛋白（MT）絡(luò)合成金屬硫蛋白復(fù)合物（Pb-MT），Cd2+誘導(dǎo)植物合成螯合素（PC），再形成重金屬螯合肽（Cd-PC），以減少細(xì)胞的毒害，Pb-MT和Cd-PC均可通過可溶性蛋白來反映[31-32]。當(dāng)重金屬濃度進(jìn)一步加大時(shí)，Pb-MT 和Cd-PC 表達(dá)受到抑制，不能結(jié)合更多的Pb2+、Cd2+，可溶性蛋白含量降低，細(xì)胞受到傷害，進(jìn)而植物生長被抑制。

4）植物維持體內(nèi)活性氧動態(tài)平衡的能力也是評價(jià)其抗重金屬污染能力的重要指標(biāo)[33]。正常情況下，植物體內(nèi)SOD 能將-O2-歧化為H2O2和-OH，POD 將H2O2分解成H2O，而在重金屬脅迫下，會誘導(dǎo)-O2-、H2O2過量積累，打破植物體內(nèi)活性氧動態(tài)平衡[34]。本試驗(yàn)研究表明，低濃度條件 （Pb2+＜300 mmol/L、Cd2+＜140 mmol/L）下，SOD 和POD 活性隨Pb2+、Cd2+濃度的升高而增加，這可能是因?yàn)榈蜐舛葧r(shí)，產(chǎn)生的低濃度活性氧可作為細(xì)胞中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，誘導(dǎo)啟動植物抗逆性基因的表達(dá)，植物抗氧化系統(tǒng)被激活，表現(xiàn)為SOD、POD 含量的增加[35]。當(dāng)Pb2+濃度為1 500 mmol/L、Cd2+濃度為700 mmol/L 時(shí)，與對照相比 SOD 的活性分別降低了34.50%、56.54%，而POD 活性提高了149.44%、107.43%，這可能是隨著ROS過度積累，植物體內(nèi)ROS 動態(tài)平衡被打破，酶系統(tǒng)被破壞[36]，且由于植物種類的不同，植物抗氧化酶對Pb2+、Cd2+脅迫的敏感性不同，使得體內(nèi)抗氧化酶響應(yīng)變化能力也不同[7-8,37-40]。在Cd2+濃度為420 mmol/L時(shí)，POD 較對照降低了1.68%，這可能是一定閾值內(nèi)Cd2+脅迫對火炬樹幼苗酶活性有刺激作用，植物能通過運(yùn)用自身酶促機(jī)制清除過氧傷害，表現(xiàn)出對Cd2+一定抗性。

5）Pb2+、Cd2+脅迫均抑制了火炬樹種子萌發(fā)，除了Pb2+濃度為300 mmol/L 時(shí)促進(jìn)其幼苗生長外，其它Pb2+、Cd2+脅迫均抑制了幼苗生長，但均未出現(xiàn)無根苗現(xiàn)象，并通過抗氧化酶系統(tǒng)等生理響應(yīng)表現(xiàn)出多種積極的適應(yīng)性特征，以緩解其毒害作用，這說明火炬樹能夠適應(yīng)一定濃度的Pb2+、Cd2+環(huán)境，較其他木本植物種子對這2 種重金屬表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐性。因此火炬樹可作為具有觀賞價(jià)值和修復(fù)鉛（Pb2+）、鎘（Cd2+）污染土壤為一體的植物材料。

本研究僅完成了Pb2+、Cd2+單獨(dú)脅迫下火炬樹種子萌發(fā)、幼苗生長與生理指標(biāo)的測定，室內(nèi)研究也未能完全貼合自然條件，日后可通過盆栽試驗(yàn)?zāi)M探索自然界中火炬樹種子在重金屬環(huán)境里的成長規(guī)律、存活狀況、光合生理等。從幼苗長至成株后的抗逆解毒機(jī)理、富集規(guī)律、細(xì)胞結(jié)構(gòu)與分子水平上的影響，有待日后進(jìn)一步分析和探討。