基于SRAP標(biāo)記的土沉香遺傳多樣性分析

蔣開彬，祝文娟，潘 文，何紫迪，朱報著，Nguyen DuyKien，黃少偉

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) a.林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院；b.廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642；2.廣東省林業(yè)科學(xué)研究院，廣東 廣州 510520；3.越南社會主義共和國 農(nóng)業(yè)部，河內(nèi) 100803）

沉香歷史悠久，利用價值巨大。根據(jù)歷史記錄，早在公元前300年，我國就有自然脅迫和人誘導(dǎo)沉香形成的記錄。沉香在東南亞、中東、印度、中國和日本存在國際貿(mào)易，在希臘、羅馬、中國、中東和歐洲的文獻(xiàn)中記載了沉香的醫(yī)療用途，并且沉香在印度教、基督教、佛教和伊斯蘭教的重要著作中受到高度尊敬。沉香香氣在整個歷史上都是流行的，并且在傳統(tǒng)熏香和現(xiàn)代香水中仍保持著較高的需 求[1]。沉香作為傳統(tǒng)中醫(yī)的一部分，已有數(shù)百年的歷史。在東南亞國家、孟加拉國和中國西藏，沉香一直被當(dāng)作傳統(tǒng)藥物使用。沉香含有的倍半萜2-2-苯基乙基-4H-色烯-4-酮衍生物（2(-2-phenylethyl)-4H-chromen-4-one derivatives）、粗提物和一些分離的化合物表現(xiàn)出抗過敏、抗炎、抗糖尿病、抗癌、抗氧化、抗缺血、抗微生物、肝保護(hù)、瀉劑以及對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響[2]。

瑞香科Thymelaeceae 沉香屬Aquilaria植物有26 個種，分布在15 個國家，中國有3 個種，分別是大葉沉香Aquilaria grandiflora、云南沉香Aquilaria yunnanensis和土沉香Aquilaria sinensis，其中大葉沉香和土沉香能結(jié)香，而云南沉香不能結(jié)香[3-4]。土沉香是中國特有的物種[5]，主要分布于廣東、廣西、海南、云南、香港及澳門等地[6]。

沉香是熱帶森林中最有價值的非木材產(chǎn)品之一，主要來源于沉香屬植物。沉香屬植物作為一種重要的經(jīng)濟(jì)樹種，過度采伐和棲息地的喪失正威脅著一些能結(jié)香的沉香樹種群體[7]。由于沉香在社會上的巨大市場需求和低產(chǎn)出的現(xiàn)象讓沉香價格不斷上升。目前，分布較為集中的土沉香林木已被砍伐殆盡，野生的種群逐漸稀少，現(xiàn)僅有少量的殘存植株存在。另外，土沉香的種子有很大的局限性，種子壽命短，非常脆弱，一旦果實(shí)裂開，種子暴露后，如果不及時播種，就很難發(fā)芽[8]，這種特殊的生理特性使其自然繁衍后代非常困難，野生土沉香則越來越稀少。

我國土沉香瀕危的主要原因在于長期以來人們對野生大樹的掠奪性采伐，導(dǎo)致土沉香母樹的不斷減少，從而使其種群更新難以順利地進(jìn)行，甚至由于非法采伐，我國野生土沉香正面臨消失的危險[9]。1999年土沉香被列為國家Ⅱ級瀕危保護(hù)植物并收載于《中國植物紅皮書》。2000年土沉香被世界自然保護(hù)聯(lián)盟（IUCN）列入《世界自然保護(hù)聯(lián)盟受威脅植物紅色名錄》。2004年土沉香連同產(chǎn)于東南亞等各國用于生產(chǎn)沉香的沉香屬植物均被列入《瀕危野生動植物物種國際交流公約》（CITES，1973）附錄[10]。由于野生的沉香樹是極度瀕危和脆弱的，因此需要可持續(xù)的農(nóng)業(yè)和林業(yè)實(shí)踐來進(jìn)一步開發(fā)和利用。其中，對土沉香種質(zhì)資源進(jìn)行研究不僅是可持續(xù)開發(fā)和利用沉香資源的工作基礎(chǔ)，也是了解我國沉香種質(zhì)資源的重要組成部分，而沉香分子水平的遺傳多樣性分析是種質(zhì)資源研究的重要內(nèi)容。

分子標(biāo)記是評價植物物種遺傳多樣性和種群結(jié)構(gòu)的有效方法，是林業(yè)研究中應(yīng)用最廣泛的一種遺傳標(biāo)記。使用分子標(biāo)記來估計物種內(nèi)部的遺傳變異可以幫助育種程序中進(jìn)行理想的親本、育種路線和性狀的選擇[11]。SRAP（Sequence-related amplified polymorphism）是一種基于PCR 的分子標(biāo)記，用于擴(kuò)增開放閱讀框[12]。SRAP 標(biāo)記在遺傳多樣性檢測和種群結(jié)構(gòu)分析中比其他方法如AFLP、RAPD、ISSR 和SSR 更好[13-14]。SRAP 工具簡單、高效，并且具有很高的生產(chǎn)率。因此，本研究采用SRAP對土沉香的遺傳多樣性進(jìn)行分析。

近年來，沉香有許多分子方面的研究報道，如沉香成分D-愈創(chuàng)木酚在大腸桿菌中的表達(dá)[15]、利用葉綠體基因組全序列做系統(tǒng)進(jìn)化研究[16]、利用DNA 條形碼識別和鑒定沉香樹種[9]、沉香化學(xué)成分2-（2-苯乙基）-色酮衍生物治療炎癥的機(jī)理[17]和倍半萜衍生物HHX-5 對先天免疫和適應(yīng)性免疫的抑制作用原理[18]等。但在土沉香分子遺傳多樣性方面只有少量的報道，如用ISSR 技術(shù)分析廣西和廣東土沉香居群的遺傳多樣性[19]，用ISSR 和AFLP 分子標(biāo)記分析海南、云南、廣東、廣西等地沉香屬植物的遺傳多樣性[20]。目前，沒有應(yīng)用SRAP 分析土沉香遺傳多樣性的報道，也沒有較系統(tǒng)地分析我國野生土沉香種質(zhì)資源的報道。本研究通過應(yīng)用SRAP 分析我國廣西1 個種源、廣東6個種源、海南3 個種源、云南1 個種源以及越南2個種源共13 個種源的遺傳多樣性，為我國土沉香種質(zhì)資源評價、保護(hù)及綜合開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 土沉香材料

在我國廣東、海南、廣西、云南、福建和越南等地選取樹齡10～20 a、生長健壯、樹干較通直、間距50 m 以上的單株，嫁接收集在廣東省林科院苗圃。本研究收集的沉香材料共148 份，包括來自廣東的6 個種源53 份材料、海南的3 個種源30 份材料、廣西的1 個種源8 份材料、云南的1 個種源9 份材料和越南的2 個種源48 份材料。

1.2 土沉香DNA 的提取

采用新型植物基因組 DNA 提取試劑盒（北京天根公司）對土沉香的葉片提取DNA。

1.3 SRAP 的擴(kuò)增

根據(jù)SRAP 引物設(shè)計并查閱資料[12]，篩選出條帶清晰、反應(yīng)穩(wěn)定的引物組合進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。25 μL 反應(yīng)體系包括2.5 μL 的10×PCR Buffer (Mg free)，2 μLMg2+（25 mmol/L），1.75 μL dNTPS (2.5 mmol/L)，0.2 μL Taq enzyme(5 U·μL-1)，0.5 μL F-primer 和R-primer（各20 μmol/L），1μL DNA（40 ng/μL），16.55 μLddH2O。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)在PTC-200 和BiometraTprofessional PCR 擴(kuò)增儀上進(jìn)行。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃變性5 min 之后進(jìn)入循環(huán)，每個循環(huán)94 ℃變性1 min，退火1 min，72 ℃延伸1 min。退火溫度從65 ℃開始，每隔2個循環(huán)降低1 ℃，直至58 ℃，維持29 個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束，72 ℃延伸8 min。

1.4 數(shù)據(jù)分析

對土沉香群體檢測的結(jié)果進(jìn)行分析，統(tǒng)計6%聚丙烯酰胺凝膠電泳擴(kuò)增產(chǎn)物中清晰明亮、多次重復(fù)穩(wěn)定的條帶。在相同遷移位置有條帶的記為1，沒有條帶的記為0。運(yùn)用POPGEN 32 軟件[21]計算土沉香群體遺傳多樣性，利用Gen Alex 6.4軟件[22]對土沉香群體內(nèi)與群體間不同水平的遺傳變異的來源進(jìn)行AMOVA 分子變異方差分析，利用NTSYS 2.10e 軟件[23]，采用UPGMA 方法，以Nei’s 無偏遺傳距離（1978）對土沉香群體進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SRAP 的擴(kuò)增多態(tài)性分析

從SRAP 引物組合中共篩選出15 對條帶清晰、多態(tài)性高的SRAP 引物，采用這15 對SRAP引物對土沉香148 份材料進(jìn)行SRAP-PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增條帶大多集中在100～2 000 bp 之間。各引物對擴(kuò)增的位點(diǎn)數(shù)及多態(tài)性見表1。由表1 可知，共獲得358 個擴(kuò)增位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)有259個，多態(tài)性位點(diǎn)率達(dá)到73.46%。平均每對引物擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)為23.87，平均每對引物多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)為17.53，其中多態(tài)性位點(diǎn)百分率達(dá)到100%的引物有兩對，分別是Me2 Em12 和Me7 Em23。

2.2 遺傳多樣性分析

應(yīng)用POPGEN32 軟件對土沉香13 個種源群體的遺傳多樣性參數(shù)進(jìn)行計算，從表2 中可以看出，土沉香群體的平均等位基因數(shù)（Na）為 1.567 4，平均有效等位基因數(shù)（Ne）為1.418 3，平均Nei’s 基因多樣度指數(shù)（H）為0.332 8，平均Shannon 多樣性指數(shù)（I）為0.337 5。各群體Nei's基因多樣度指數(shù)（H）的變化范圍為0.171 5～0.539 4，Shannon 多樣性指數(shù)（I）的變化范圍為 0.249 1～0.483 7。

土沉香群體水平的平均多態(tài)位點(diǎn)（PL）為39，各群體多態(tài)位點(diǎn)（PL）的變化范圍為29～53。土沉香群體水平的平均多態(tài)位點(diǎn)百分比（PPL）為56.74%，各群體多態(tài)位點(diǎn)百分比（PPL）的變化范圍為42.03%～76.81%。13 個土沉香群體多態(tài)位點(diǎn)百分比（PPL）按照由高到低的順序依次為：越南種源1 ＞越南種源2 ＞廣東陸河＞海南臨高、廣東深圳、廣東東莞＞云南種源＞廣東珠三角、海南屯昌＞海南瓊山＞廣東電白、廣西陸川＞廣東蘿崗。

2.3 AMOVA 分析

運(yùn)用GenAlex6.4 軟件對土沉香13 個群體內(nèi)與群體間不同水平的遺傳變異來源進(jìn)行分子方差分析（Analysis of molecular variance，AMOVA），結(jié)果見表3。對土沉香群體內(nèi)和群體間的分子變異組分進(jìn)行分析，結(jié)果顯示土沉香群體內(nèi)和群體間存在顯著的遺傳變異（P＜0.001）。有30%的遺傳變異存在于土沉香群體間，而70%的遺傳變異存在于土沉香群體內(nèi)。這表明，土沉香群體的遺傳變異表現(xiàn)為：群體內(nèi)遺傳變異＞群體間遺傳變異。

表1 15 對SRAP 引物在土沉香148 個單株中的多態(tài)性檢測Table 1 Polymorphism detected by fifteen pairs of SRAP primers in 148 trees of Aquilaria sinensis

續(xù)表1Continuation of table 1

表2 13 個土沉香群體遺傳多樣性指數(shù)Table 2 Genetic diversity indices of 13 populations of Aquilaria sinensis

表3 13 個土沉香群體遺傳變異的AMOVA 分析Table 3 AMOVA analysis of genetic variation in 13 populations of Aquilaria sinensis

2.4 聚類分析

運(yùn)用軟件NTSYS 2.10e 對群體進(jìn)行Nei's 無偏遺傳距離分析，利用UPGM 方法進(jìn)行聚類，進(jìn)而構(gòu)建13 個土沉香群體的系統(tǒng)聚類圖（圖1）。從圖1中可以看出，廣東電白和廣東珠三角群體之間遺傳距離值最小，最先聚在一起。當(dāng)閾值為0.17時，13 個土沉香群體可以分為6 類；廣東電白、廣東珠三角、廣東深圳、廣東東莞、廣東陸河五個種源與越南2 個種源聚為一類；云南省、廣東蘿崗、廣西陸川、海南臨高4 個種源分別自成一類；海南屯昌和海南瓊山2 個種源聚為一類。

3 結(jié)論與討論

遺傳多樣性是指一個物種內(nèi)部的遺傳分化程度。它還反映了一個物種適應(yīng)環(huán)境變化的能力及其轉(zhuǎn)化和利用的潛力。因此，對遺傳多樣性的評價是種質(zhì)鑒定、采集和育種的重要組成部分[24]。SRAP分子標(biāo)記已被證明是遺傳多樣性估計和種群關(guān)系分析的有效分析工具[25]。本研究通過SRAP 分子標(biāo)記，應(yīng)用POPGEN32 軟件計算多態(tài)性條帶的百分比（PPB）、Nei’s 基因多樣性（H）和Shannon’s信息指數(shù)（I）等主要遺傳多樣性參數(shù)，分析13 個土沉香種源遺傳多樣性。PPB 為56.74%，與申彥晶等[26]利用ISSR 分析得到的58.8%相近，表明種群間存在一定程度的遺傳變異。土沉香群體的基因多樣度（H）、多樣性指數(shù)（I）和群體多態(tài)位點(diǎn)百分比（PPL）均顯示各群體多樣性維持在中等水平。從其排序來看，來自越南的2 個種源遺傳多樣性豐富，各個指標(biāo)均為最高值，而廣東蘿崗在13 個土沉香群體中遺傳多樣性水平最低。群體遺傳多樣性水平與參與實(shí)驗(yàn)的種群大小有一定的聯(lián)系，越南2個種源家系數(shù)最多，而蘿崗種源家系數(shù)最少。在土沉香保護(hù)和育種中，遺傳多樣性指數(shù)較高的種群，可加大選擇權(quán)重，但是對遺傳多樣性指數(shù)較低的種群，也應(yīng)予以重視[27]。

圖1 基于SRAP 標(biāo)記的土沉香種源聚類結(jié)果Fig.1 Cluster of Aquilaria sinensis provenances based on SRAP markers

遺傳分化系數(shù)（Genetic differentiation coefficient，GST）是評價群體間遺傳分化最常用的指標(biāo)之一，可為種群間遺傳分化的進(jìn)化過程提供重要的解釋[28]。當(dāng)0 ＜GST＜0.05 時，表示群體間遺傳分化水平較低；當(dāng)0.05 ＜GST＜0.25 時，群體間有中度的遺傳分化；當(dāng)GST＞0.5 時，群體間有高度遺傳分化。本研究運(yùn)用GenAlex6.4 軟件對土沉香13 個種源群體內(nèi)與群體間不同水平的遺傳變異來源進(jìn)行AMOVA 分子變異方差分析，有30%的遺傳變異存在于土沉香群體間，即種源群體間的遺傳分化系數(shù)（GST）為0.30，表明13 個土沉香不同種源群體間存在中度的遺傳分化。種源間存在中度的遺傳分化，意味不同種源土沉香在資源保護(hù)與利用時中應(yīng)得到重視。

種群遺傳結(jié)構(gòu)被定義為一個物種或種群在空間和時間上的遺傳變異的非隨機(jī)分布模式，在很大程度上，它代表一個物種或種群的進(jìn)化潛力[29]?；贜ei’s 無偏遺傳距離，采用UPGM 方法構(gòu)建13 個土沉香群體的聚類圖。當(dāng)閾值為0.17 時，廣東電白、廣東珠三角、廣東深圳、廣東東莞、廣東陸河5 種源與越南2 個種源聚為一類，云南省、廣東蘿崗、廣西陸川、海南臨高這4 個種源則自成一類，海南屯昌、海南瓊山2 個種源聚為一類。這表明，廣東電白、珠三角、深圳、東莞、陸河與越南種源親緣關(guān)系比較接近，海南瓊山和海南屯昌種源親緣關(guān)系較近。

本研究應(yīng)用SRAP 分子標(biāo)記分析土沉香的遺傳多樣性，結(jié)果表明，13 個土沉香種源有中度的遺傳多樣性和遺傳分化。隨著野生土沉香被破壞，我國土沉香遺傳多樣性會越來越低。因此，對我國野生土沉香種質(zhì)資源進(jìn)行保護(hù)顯得非常必要。本研究的結(jié)果為土沉香的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)，如種質(zhì)資源保存、關(guān)聯(lián)分析和分子育種等研究。