慢性心衰患者穩(wěn)定期Bax、Bcl-2水平及其與心功能的關(guān)系

劉文秀，蘇 暢，白素芬，齊書(shū)英，汝磊生

聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八〇醫(yī)院1心內(nèi)科，2心胸外科，河北 石家莊 050082；3華北理工大學(xué)中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)臨床系，河北 唐山 063210

心衰是一組復(fù)雜的臨床綜合征，是全球病死率最高、住院率最高的疾病[1]。慢性心衰（CHF）的機(jī)制復(fù)雜，且不十分明確。心肌細(xì)胞凋亡是主要機(jī)制之一，人和動(dòng)物模型都提示凋亡與心衰有關(guān)，且凋亡參與從心肌肥大到心衰的發(fā)展[2]。B淋巴瘤-2（Bcl-2）家族是一個(gè)參與凋亡和抗凋亡的大家族，Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，而B(niǎo)cl-2相關(guān)X蛋白（Bax）是促細(xì)胞死亡的蛋白，是細(xì)胞死亡的負(fù)調(diào)節(jié)因子。多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究證實(shí)，Bcl-2和Bax參與慢性心衰的發(fā)展。目前關(guān)于Bcl-2和Bax在心肌細(xì)胞凋亡方面的研究較少，未見(jiàn)到有關(guān)慢性心衰穩(wěn)定期患者循環(huán)炎癥細(xì)胞中Bcl-2和Bax水平的研究，且Bcl-2和Bax水平與心功能的關(guān)系未知。本研究對(duì)CHF穩(wěn)定期患者循環(huán)炎癥細(xì)胞中Bcl-2和Bax水平進(jìn)行報(bào)道，并分析Bcl-2和Bax水平與心功能的關(guān)系，幫助認(rèn)識(shí)心衰的發(fā)病機(jī)制，對(duì)心衰的基因治療提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究納入60例2014年3月～2016年12月在我院心內(nèi)科住院的穩(wěn)定期CHF患者，包括32例男性和28例女性，年齡53～72歲（63.4±6.2歲）。60例患者中，28例為冠心?。–HD）心衰（有心肌梗死和/或冠狀動(dòng)脈狹窄病史），15例為高血壓性心臟?。℉HD）心衰（有明確的高血壓病史，排除冠狀動(dòng)脈狹窄、瓣膜病等），17例為心肌病（CM，多為原發(fā)性心肌病）心衰（無(wú)明確的高血壓病、冠心病、瓣膜病、先天性心臟病等）。CHF組給予常規(guī)心衰治療。對(duì)照組納入30例健康人，均為來(lái)院門(mén)診健康體檢者，無(wú)心臟疾病，包括16例男性和14例女性，年齡49～70歲（60.7±6.1歲）。

1.2 選擇標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 病例組由心臟病專(zhuān)家根據(jù)病史、體格檢查、心臟超聲、胸片、冠脈造影等檢查確診，心臟彩色多普勒超聲LVEF均＜45%（根據(jù)2007中國(guó)慢性心力衰竭診斷治療指南），為美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)/協(xié)會(huì)心功能C期，或紐約心臟病協(xié)會(huì)心功能Ⅰ～Ⅳ級(jí)，經(jīng)治療后心功能穩(wěn)定至少1月入組。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 嚴(yán)重的肝腎功能異常；感染；惡性腫瘤患者；電解質(zhì)紊亂；精神疾?。皇褂每股卣?；使用肝素者；急性心肌梗死；懷孕或哺乳期。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)同意執(zhí)行。

1.3 定量反轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)Bcl-2和Bax mRNA的表達(dá)

晨起快速收集所有病例的靜脈血，用Ficoll-Paque PLUS淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單核細(xì)胞（PBMC）。PBMC在加入10% FBS的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 h（37 ℃，5% CO2）。移除細(xì)胞懸液，PBMC即附著于培養(yǎng)基壁上生長(zhǎng)，直至長(zhǎng)滿(mǎn)。每24 h更換培養(yǎng)液。

以TRIzol試劑消化并收集，供提取所有RNA；再通過(guò)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用來(lái)做qRT-PCR的模板，條件如下：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s 90次，54 ℃ 30 s，72 ℃1 min。GAPDH用來(lái)做內(nèi)參。

1.4 測(cè)量左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）

LVEF由經(jīng)胸彩色多普勒超聲HP SONOS5500系統(tǒng)（飛利浦，荷蘭阿姆斯特丹）測(cè)定。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)以SPSS 21.0和Graphpad Prism 5 for Windows軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，正態(tài)性檢驗(yàn)采用D’Agostino & Pearson omnibus檢驗(yàn)，方差齊性檢驗(yàn)采用Levene法檢驗(yàn)；兩組間比較采用均數(shù)間比較t檢驗(yàn)；多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析；多組間均數(shù)兩兩比較采用Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布或方差不齊時(shí)，兩組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)；多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)和例數(shù)表示，計(jì)數(shù)資料多個(gè)樣本率的比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)檢驗(yàn)；方差不齊或等級(jí)資料相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料結(jié)果

根據(jù)病因?qū)HF組分為3個(gè)亞組：CHD組、HHD組和CM組。CHD組年齡高于HHD組和CM組（P＜0.05）。CHD組吸煙比例高于HHD和CM組（P＜0.01）。HHD組高血壓病比例高于CHD組，CHD組高于CM組（P＜0.01）。CHD組糖尿病比例高于HHD組（P＜0.05），HHD組高于CM組（P＜0.01）。CHD組使用阿司匹林比例高于HHD和CM組（P＜0.01）。CHD組使用他汀類(lèi)藥物比例高于HHD組（P＜0.01），HHD組高于CM組（P＜0.01）。CHF組LVEF低于對(duì)照組（P＜0.01）。CHF組N-末端B型鈉尿肽前體（NT-proBNP）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左房?jī)?nèi)徑、右室舒張期橫徑值高于對(duì)照組（P＜0.01，表1）。

2.2 CHF組和對(duì)照組Bcl-2和Bax mRNA水平的比較

CHF組外周血單核細(xì)胞Bcl-2 mRNA水平低于對(duì)照組（P＜0.01，圖1A）；Bax mRNA水平高于對(duì)照組（P＜0.01，圖1B）。

2.3 CHF 3個(gè)亞組Bcl-2和Bax mRNA水平的比較

3個(gè)亞組分別與對(duì)照組相比，外周血單核細(xì)胞Bcl-2和Bax mRNA水平的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖2A）。組內(nèi)兩兩比較，Bcl-2和Bax mRNA水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖2B）。

2.4 Bcl-2、Bax mRNA水平與NHYA心功能分級(jí)的相關(guān)性

CHF組外周血單核細(xì)胞Bcl-2 mRNA的水平與NYHA心功能分級(jí)呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.494,P=0.039，圖3），Bax mRNA的水平與NYHA心功能分級(jí)呈正相關(guān)（rs=0.536,P=0.041）。

2.5 Bcl-2、Bax mRNA水平與LVEF的相關(guān)性

CHF組外周血單核細(xì)胞Bcl-2 mRNA水平與LVEF呈正相關(guān)（r=0.497,P=0.035，圖4），Bax mRNA水平與LVEF呈負(fù)相關(guān)（r=-0.446,P=0.043）。

2.6 Bcl-2、Bax mRNA水平與NT-proBNP濃度的相關(guān)性

CHF組外周血單核細(xì)胞Bax mRNA水平與NT-proBNP濃度呈正相關(guān)（r=0.374,P=0.003，圖5）。Bcl-2 mRNA水平與NT-proBNP濃度無(wú)相關(guān)性（r=-0.227,P=0.082）。

表1 研究對(duì)象一般臨床資料

圖1 CHF組和對(duì)照組Bcl-2和Bax mRNA水平的比較

圖2 CHF 3個(gè)亞組Bcl-2和Bax mRNA水平的比較

圖3 Bcl-2、Bax mRNA水平與NHYA心功能分級(jí)的相關(guān)性

圖4 Bcl-2、Bax mRNA水平與LVEF的相關(guān)性

2.7 Bcl-2、Bax mRNA水平與LVEDD的相關(guān)性

CHF組外周血單核細(xì)胞Bax mRNA水平與LVEDD呈正相關(guān)（r=0.289,P=0.025，圖6），Bcl-2 mRNA水平與LVEDD無(wú)相關(guān)性（r=-0.168,P=0.201）。

圖5 Bcl-2、Bax mRNA水平與NT-proBNP濃度的相關(guān)性

圖6 Bcl-2、Bax mRNA水平與LVEDD的相關(guān)性

3 討論

凋亡導(dǎo)致逐漸丟失的心肌細(xì)胞加速了疾病的進(jìn)程[3]。在射血分?jǐn)?shù)降低的心衰中，心肌細(xì)胞凋亡在左室功能障礙的發(fā)展中起重要作用，且射血分?jǐn)?shù)降低的心衰心肌細(xì)胞丟失是一個(gè)明確的特點(diǎn)[4-5]。細(xì)胞的命運(yùn)大部分程度由促和抗凋亡因素表達(dá)的相對(duì)水平?jīng)Q定。Bcl-2家族中的Bcl-2是最主要的一種抗凋亡蛋白，而B(niǎo)ax是促細(xì)胞死亡的蛋白，是細(xì)胞死亡的負(fù)調(diào)節(jié)因子[6]，Bcl-2通過(guò)阻止Bax釋放細(xì)胞色素C對(duì)其抑制作用[7]。Bax阻止細(xì)胞凋亡主要依賴(lài)于Bcl-2和Bax的比值。當(dāng)Bcl-2過(guò)剩時(shí)，Bax/Bcl-2二聚體形成，細(xì)胞受保護(hù)。然而，當(dāng)Bax占多數(shù)時(shí)，Bax二聚體形成，細(xì)胞將啟動(dòng)程序性細(xì)胞死亡。Bax還可能參與通道形成，減緩心衰進(jìn)程[8]。

小鼠動(dòng)物模型試驗(yàn)表明，慢性缺氧、牽拉和長(zhǎng)期壓力過(guò)重引起的心衰鼠心臟細(xì)胞凋亡明顯增加，Bax水平明顯升高，Bcl-2水平明顯降低。在試驗(yàn)中，Bax基因的表達(dá)可以增加心臟壓力負(fù)荷過(guò)重時(shí)Bcl-2的表達(dá)[9]。升高的Bax可能通過(guò)加速電壓依賴(lài)性離子通道來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞色素C從線(xiàn)粒體釋放[10]。國(guó)內(nèi)的研究表明，與對(duì)照組相比，心衰模型小鼠心肌細(xì)胞凋亡明顯增加，Bax凋亡指數(shù)明顯升高，Bcl-2凋亡指數(shù)明顯降低，心肌細(xì)胞Bax/Bcl-2比值顯著升高[11]。在Bcl-2基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的心衰小鼠模型中，6周后可見(jiàn)心肌細(xì)胞凋亡減少，心室重構(gòu)改善[12]。但目前對(duì)于Bcl-2和Bax在CHF穩(wěn)定期患者中mRNA水平的臨床研究很少，且有不一致的結(jié)論。研究報(bào)道缺血性心肌病和擴(kuò)張型心肌病終末期心衰患者心肌組織Bax和Bcl-2表達(dá)均增加，缺血性心肌病組更明顯[13]。且Bax/Bcl-2參與心衰的機(jī)制仍不明確。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，Bax缺失不能使Ku70基因敲除的小鼠的心功能恢復(fù)正常，提示Ku70蛋白作為雙鏈DNA修復(fù)、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵核蛋白，Bax可能通過(guò)與Ku70基因的相互作用來(lái)導(dǎo)致心功能惡化[14]。另有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Bax表達(dá)的增加和其與VDAC（電壓依賴(lài)性陰離子通道）的相互作用可導(dǎo)致線(xiàn)粒體的tRNA突變，加重心臟損害[15]。臨床研究表明，Bax基因的過(guò)甲基化可能參與增加70歲以上人群冠心病的風(fēng)險(xiǎn)[16]。

PBMC為多能髓系祖細(xì)胞，在特定條件下可分化為血細(xì)胞、心肌源性細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞[17]。體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，移植到心梗小鼠和兔模型上時(shí)，人PBMC可分化為心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，參與缺血心臟再生[18]。最新的研究表明，高分化人心肌細(xì)胞可由PBMC起源的多能干細(xì)胞分化而來(lái)[19]。人的心肌細(xì)胞獲取困難，對(duì)PBMC凋亡相關(guān)基因的研究，可從一定程度上反映心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的功能。

本研究顯示，CHF組外周血單核細(xì)胞Bcl-2 mRNA水平低于對(duì)照組；Bax mRNA水平高于對(duì)照組。與心衰動(dòng)物試驗(yàn)中Bcl-2表達(dá)降低，Bax表達(dá)增加的趨勢(shì)一致；與Bcl-2凋亡指數(shù)降低，Bax凋亡指數(shù)升高的趨勢(shì)亦一致，表明CHF穩(wěn)定期患者外周血單核細(xì)胞的Bcl-2和Bax mRNA水平與心肌細(xì)胞Bcl-2和Bax表達(dá)水平同步。CHF時(shí)Bcl-2和Bax表達(dá)的改變，增加了心肌細(xì)胞對(duì)凋亡的易感性，加重心衰的進(jìn)展，進(jìn)一步證明在CHF的發(fā)展過(guò)程中，心肌細(xì)胞凋亡起到了一定作用，發(fā)生凋亡的機(jī)制與Bcl-2和Bax水平的改變有關(guān)。Bcl-2和Bax mRNA表達(dá)水平3個(gè)亞組中的兩兩比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。CHF組外周血單核細(xì)胞Bcl-2 mRNA水平與NYHA心功能分級(jí)呈負(fù)相關(guān)，與LVEF呈正相關(guān)；Bax mRNA水平與NYHA心功能分級(jí)呈正相關(guān)，與LVEF呈負(fù)相關(guān)。Bax mRNA水平還與NT-proBNP濃度和LVEDD呈正相關(guān)。Bcl-2 mRNA水平與NT-proBNP濃度和LVEDD的相關(guān)性未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但有正相關(guān)的趨勢(shì)，可能與樣本量較小有關(guān)。

總之，Bcl-2和Bax這一對(duì)凋亡相關(guān)基因在慢性心衰穩(wěn)定期表達(dá)發(fā)生明顯變化，各種病因所致的CHF可能導(dǎo)致這一對(duì)凋亡相關(guān)基因共同的改變，且mRNA水平與CHF病情嚴(yán)重程度相關(guān)，可能成為CHF預(yù)后因子之一。本研究未統(tǒng)計(jì)合并房顫的心衰患者，但已有研究表明，Bcl-2/Bax表達(dá)失衡可能參與房顫的發(fā)生發(fā)展[20]?？稍诤罄m(xù)的工作中對(duì)其進(jìn)一步研究。