肝癌血清特異標(biāo)志物Dickkopf-1核酸適體的篩選及其鑒定

何 雷，趙運(yùn)旺，李保林，安曉剛燕山大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，河北 秦皇島 066004；秦皇島市第一醫(yī)院，河北 秦皇島 066000；空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院，陜西 西安 700

目前，原發(fā)性肝癌的發(fā)病率位列世界第5，且發(fā)病率在世界范圍內(nèi)逐年上升[1]。近年來臨床治療手段有進(jìn)步，但5年生存率極低，僅為3%～5%[2]。目前肝癌診斷主要依賴于影像學(xué)檢查，而血清腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)是唯一無創(chuàng)傷的檢測(cè)手段，但敏感性較低，特別是在早期HCC的檢測(cè)中僅為25%～65%[3-5]。因此，迫切需要尋找特異性更高、親和力更強(qiáng)的肝癌血清標(biāo)志物，從而為肝癌的早期診斷提供新的分子生物學(xué)檢測(cè)手段。有研究發(fā)現(xiàn)了Dickkopf-1（DKK1），它是經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路分泌拮抗劑[6]。有研究在肝癌組織中發(fā)現(xiàn)DKK1表達(dá)水平是上調(diào)的，微陣列分析有預(yù)測(cè)早期或AFP陰性狀態(tài)肝癌的價(jià)值[7]。

核酸適體是通過指數(shù)富集配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX）篩選獲得[8-9]，即利用體外合成的隨機(jī)寡核苷酸文庫，經(jīng)過多輪篩選，并結(jié)合PCR擴(kuò)增技術(shù)，使其得到指數(shù)級(jí)富集，最終獲得高親和力、高特異性的核酸適體。核酸適體其自身能折疊成特定的空間結(jié)構(gòu)與靶標(biāo)分子特異性結(jié)合，常被稱為“化學(xué)抗體”[10-12]。與蛋白抗體相比，核酸適體具有特異性更高、親和力更強(qiáng)、穩(wěn)定性好、免疫原性和毒性低、易于合成、化學(xué)修飾及穿透腫瘤組織等優(yōu)點(diǎn)[13-15]。然而目前核酸適體在腫瘤學(xué)檢測(cè)方面仍處于研究階段[16]，目前研究未見報(bào)道DKK1核酸適體的篩選。本研究以DKK1為靶標(biāo)蛋白分子，羧基化瓊脂磁珠為篩選介質(zhì)，采用SELEX技術(shù)篩選DKK1的核酸適體，建立一種簡(jiǎn)單、快速的基于核酸適體檢測(cè)腫瘤血清標(biāo)志物DKK1的分析方法，也為靶向藥物治療研制提供一定的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

ssDNA文庫（88 nt，1.2 nmol）：5′-CTATAGCAAT GGTACGGTACTTCC（40 N）CAAAAGTGCACGCTA CTTTGCTAA-3′（N=A、G、T、C）；引物P7：5′-CT ATAGCAATGGTACGGTACTTCC-3′；引物P11：5′-TTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3′；引物P11：5′-TTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3′及Biotin-P11引物（上海生物工程有限公司）。羧基化瓊脂磁珠（普洛麥格生物技術(shù)有限公司）。DKK1抗原（2 mg/mL）、DKK2抗原（2 mg/mL）、DKK1-3抗原（2 mg/mL）（北京科衛(wèi)有限公司）。1×PBS緩沖液（137 mmol NaCl，2.7 mmol KCl，6.5 mmol Na2HPO4，1.8 mmol NaH2PO4）。

1.2 消減SELEX技術(shù)篩選DKK1核酸適體

5 μg/mL DKK1與0.5 mL羧基化瓊脂磁珠于1 mL PBS緩沖液，37 ℃孵育1 h。磁分離收集DKK1-磁珠復(fù)合物于1.5 mL EP管中，PBS緩沖液洗3次，加入1 mL封閉液（1% BSA，10 μmol/L tRNA，0.05% tween-20溶于PBS），37 ℃孵育30 min。PBS緩沖液洗3次，制備獲得DKK1-磁珠復(fù)合物。按上述操作程序，分別制備獲得DKK2-磁珠復(fù)合物、DKK3-磁珠復(fù)合物、DKK4-磁珠復(fù)合物。DKK2-磁珠復(fù)合物結(jié)合3 mL初級(jí)ssDNA文庫（95 ℃，5 min；4 ℃，10 min；37 ℃，5 min），37 ℃孵育30 min。磁分離，未結(jié)合的ssDNA上清液與DKK3-磁珠復(fù)合物結(jié)合，37 ℃孵育30 min。磁分離，未結(jié)合的ssDNA上清液與DKK4-磁珠復(fù)合物結(jié)合，37 ℃孵育30 min。磁分離將未結(jié)合的ssDNA上清液加入到DKK1-磁珠復(fù)合物中，37 ℃孵育1 h。磁分離棄去未結(jié)合的ssDNA，PBS緩沖液洗3次，加入200 μL ddH2O，95 ℃加熱10 min分離與DKK1-磁珠復(fù)合物特異結(jié)合的ssDNA?；厥盏膕sDNA文庫作為qPCR擴(kuò)增的模板，鏈霉親和素磁珠法制備獲得次級(jí)ssDNA文庫。重復(fù)上述篩選步驟。

1.3 鏈霉親和素磁珠法制備次級(jí)ssDNA文庫

整個(gè)篩選過程中，PCR的控制特別關(guān)鍵。在PCR擴(kuò)增過程中引入有生物素修飾的引物，通過對(duì)稱PCR擴(kuò)增每一輪的次級(jí)ssDNA文庫獲得量較大的標(biāo)記有生物素的dsDNA產(chǎn)物。dsDNA產(chǎn)物與300 μL鏈霉親和素磁珠，37 ℃孵育30 min，磁分離獲得biodsDNA-鏈霉親和素磁珠復(fù)合物。PBS緩沖液40 ℃水浴4 min，洗去非特異結(jié)合的dsDNA。95 ℃熱變性使雙鏈DNA解旋實(shí)現(xiàn)其分離。再對(duì)其進(jìn)行磁分離，收集上清液即獲得次級(jí)ssDNA文庫。

1.4 ELASA法實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)篩選進(jìn)程

按照鏈霉親和素磁珠法制備次級(jí)ssDNA文庫的方法，利用生物素標(biāo)記的引物擴(kuò)增獲得標(biāo)記有生物素的次級(jí)ssDNA文庫。分別取50 μL磁珠于4個(gè)1.5 mL EP管中，分別標(biāo)記為“1+”、“1-”；“2-”、“3-”EP管分別與200 μL DKK1、DKK2、DKK3、DKK4，37 ℃孵育1 h；投入每輪生物素標(biāo)記后的ssDNA文庫，37 ℃孵育30 min，1×Binding Buffer洗3次，然后加入1∶1000稀釋的HRP-labeled Streptavidin 37 ℃ 孵育 30 min，1×PBS（含1.5% Tween-20）洗3次，200 μL TMB顯色液，避光顯色15 min，50 μL 1 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，置于酶標(biāo)儀測(cè)定A450 nm值。

1.5 高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

將第6輪篩選獲得的次級(jí)ssDNA文庫作為模板，經(jīng)對(duì)稱PCR擴(kuò)增獲得dsDNA產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行鑒定。將dsDNA送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。預(yù)計(jì)每個(gè)文庫測(cè)序得到約10 000條序列。

對(duì)高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析。采用Clustal X軟件和DNAman軟件分析二代測(cè)序結(jié)果，拷貝數(shù)＞1 000的核酸適體的保守序列。采用mfold軟件（Version 3.2）分析核酸適體的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.6 SPR測(cè)定DKK1核酸適體結(jié)合解離常數(shù)（Kd）

3個(gè)候選核酸適體與DKK1的解離常數(shù)（Kd）通過表面等離子共振體（SPR）測(cè)定。HEPES緩沖液作為運(yùn)行緩沖液，50 μg/mL DKK1溶解于500 μL 10 mmol/L乙酸銨緩沖液（pH 6.0）中，稀釋后的DKK1點(diǎn)在SPR芯片上于4 ℃過夜。將三個(gè)核酸適體稀釋至一系列濃度。自動(dòng)按照運(yùn)行程序用于樣品注射和再生的重復(fù)循環(huán)。監(jiān)測(cè)核酸適體-DKK1復(fù)合物的結(jié)合和解離時(shí)間為300 s。通過使用動(dòng)力學(xué)評(píng)估軟件計(jì)算核酸適體與DKK1的相互作用。

1.7 圓二光譜分析DKK1核酸適體結(jié)構(gòu)

為進(jìn)一步確定核酸適體可能的二級(jí)結(jié)構(gòu)特征。將終濃度為5 μmol/L的核酸適體（Apt-5、Apt-26、Apt-28）溶于10 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.0，含有0.1 mol/L KCl）中。將樣品在90 ℃下加熱變性5 min，然后逐漸冷卻至室溫。將變性后的核酸適體加到比色皿中，通過JASCOJ-810分光偏振計(jì)從320～220 nm收集CD光譜。

2 結(jié)果

2.1 每輪ssDNA文庫的親和力測(cè)試

采用消減SELEX技術(shù)循環(huán)篩選，利用生物素-鏈霉親和素-辣根過氧化物酶系統(tǒng)檢測(cè)1～6輪ssDNA文庫與DKK1的親和力。結(jié)果顯示，親和力在1～5輪明顯上升，第5輪SELEX篩選以后達(dá)到飽和，因此在第6輪時(shí)終止篩選（圖1）。

2.2 DKK1核酸適體的篩選

以DKK1為靶標(biāo)，DKK2、DKK3、DKK4為反篩選靶標(biāo)，通過6輪消減SELEX篩選獲得飽和的次級(jí)ssDNA文庫。每一輪篩選過程中用的ssDNA文庫與DKK1的用量直接關(guān)系到篩選是否成功。為了獲得高特異性的核酸適體，隨著篩選輪數(shù)的增加，篩選的條件越來越苛刻，比如，投入的ssDNA文庫逐輪減少，磁珠的用量逐漸減少，孵育時(shí)間逐漸縮短，洗脫力度逐漸增強(qiáng)。第1～6輪次級(jí)文庫經(jīng)對(duì)稱PCR擴(kuò)增后的dsDNA產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示第6輪擴(kuò)增后的ssDNA次級(jí)文庫的條帶清晰，大小合適（88 bp），沒有任何雜帶（圖2），與初始ssDNA文庫片段大小吻合。

圖2 1～6輪ssDNA PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

2.3 高通量測(cè)序結(jié)果分析和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

利用消減SELEX技術(shù)篩選核酸適體，通常對(duì)與靶標(biāo)分子作用力達(dá)到飽和的核酸適體次級(jí)庫進(jìn)行高通量測(cè)序。第6輪SELEX篩選獲得的次級(jí)ssDNA文庫，利用一對(duì)無任何修飾的P7、P11引物經(jīng)對(duì)稱PCR擴(kuò)增獲得的dsDNA產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序，測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)去掉兩端引物序列和兩端adapter，得到10 000條序列，合成拷貝數(shù)＞1 000的核酸序列。最終經(jīng)序列比對(duì)獲得了3條與DKK1高特異性結(jié)合的核酸適體。獲得的核酸適體文庫中的3條高豐度核酸適體序列，占整個(gè)測(cè)序文庫總量的54%。核酸適體測(cè)序結(jié)果（表1）。

表1 核酸適體測(cè)序結(jié)果

利用DNAman軟件對(duì)3條核酸適體經(jīng)多序列比對(duì)和同源性分析。測(cè)序結(jié)果與預(yù)期長度一致，得到的核酸適體中富含G、C堿基，其同源性達(dá)78.41%。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)AGCG、AACCA和GGCGT序列均在這3條核酸適體中存在，提示，DKK1可能特異識(shí)別CCCCT、CGGTT和TGCGCG 3種保守DNA序列，而其余的序列則有一定的變化（圖3）。

核酸適體是利用其形成特殊的、穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)與靶標(biāo)分子特異結(jié)合，因此我們對(duì)3條核酸適體的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)。核酸適體結(jié)構(gòu)主要以莖環(huán)結(jié)構(gòu)、莖凸環(huán)結(jié)構(gòu)等為主，而且序列中G≡C配對(duì)較多。其中莖可以起到穩(wěn)定核酸適體空間結(jié)構(gòu)的作用，而環(huán)與靶標(biāo)結(jié)合。提示莖環(huán)結(jié)構(gòu)可能是核酸適體與DKK1特異識(shí)別的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。由此推斷核酸適體與靶標(biāo)的結(jié)合可能是結(jié)構(gòu)依賴性的，而不是序列依賴性的。這與抗原-抗體的結(jié)合反應(yīng)特別相似，但抗體是以初級(jí)結(jié)構(gòu)識(shí)別抗原決定簇，而核酸適體堿基之間可能是通過疏水作用、堿基堆積力和氫鍵等作用力與靶標(biāo)形成 “鎖與鑰匙”結(jié)構(gòu)（圖4）。

圖3 核酸適體同源性分析結(jié)果

核酸適體的二級(jí)結(jié)構(gòu)最低自由能代表了DNA空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，其最低自由能越小，核酸適體所形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定。mfold軟件計(jì)算的3個(gè)核酸適體的自由能最低能量值。

2.4 DKK1核酸適體Kd值

利用SPR儀測(cè)定候選核酸適體（Apt-5、Apt-26、Apt-28）與靶標(biāo)DKK1的親和力，將固定在SPR芯片上的DKK1分別與不同濃度的核酸適體（1～160 nmol/L）孵育測(cè)定其相互作用力。結(jié)果顯示，篩選獲得的3條核酸適體與DKK1的結(jié)合解離常數(shù)均在納摩爾級(jí)水平。解離常數(shù)值Kd大小與親和力高低成反比，Kd值越小，親和力越大。核酸適體Apt-5、Apt-26、Apt-28的Kd值分別為12.26、24.85、21.18 nmol/L，Apt-5的Kd值最小，親和力最高，Apt-26和Apt-28核酸適體親和力相對(duì)較弱（圖5）。

2.5 圓二色光譜的分析結(jié)果

利用圓二色光譜進(jìn)一步研究了DKK1核酸適體分子的高級(jí)結(jié)構(gòu)。如圖所示，3個(gè)候選核酸適體（Apt-5、Apt-26、Apt-28）在265 nm附近顯示正的特征肩峰譜帶，在240 nm附近顯示負(fù)的特征肩峰譜帶，這一性質(zhì)與G-四鏈體結(jié)構(gòu)的特殊功能一致（圖6）。

圖4 核酸適體二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

3 討論

SELEX技術(shù)是一種應(yīng)用體外合成的大容量的隨機(jī)ssDNA文庫進(jìn)行體外篩選、結(jié)合PCR擴(kuò)增的技術(shù)[17-19]。文庫中的寡核苷酸序列可以折疊形成發(fā)夾、假結(jié)、凸環(huán)和G-四分體等空間結(jié)構(gòu)，與靶物質(zhì)特異、穩(wěn)定地結(jié)合，通過多輪篩選和PCR擴(kuò)增富集，最終獲得高親和力、高特異性的ssDNA序列，稱為核酸適體。核酸適體具有靶分子范圍廣、相對(duì)分子質(zhì)量小、無免疫原性、易于人工合成、修飾和標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)，核酸適體在臨床診斷、基礎(chǔ)研究，甚至在疾病治療領(lǐng)域中都顯現(xiàn)其重要的應(yīng)用價(jià)值。因此核酸適體能夠成為最具前景的抗體替代品。有研究利用合成的DNA適體與熒光淬滅方法可以高通量地檢測(cè)和區(qū)分體液中不同種類的蛋白質(zhì)[20]。

本實(shí)驗(yàn)以DKK1為靶蛋白，以羧基化瓊脂磁珠為篩選介質(zhì)，從體外合成的隨機(jī)ssDNA文庫中篩選獲得其特異核酸適體。利用消減SELEX技術(shù)，共進(jìn)行6輪篩選DKK1核酸適體。通過鏈霉親和素磁珠法制備獲得次級(jí)ssDNA文庫，有效地避免了不對(duì)稱PCR制備過程中產(chǎn)生非特異ssDNA。整個(gè)篩選進(jìn)程通過ELASA法實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)[21]。篩選獲得的次級(jí)核酸適體庫通過高通量測(cè)序分離高豐度的一系列單一核酸適體序列[22]。該方法利用高通量測(cè)序從而有效地避免了利用傳統(tǒng)方法克隆后測(cè)序，造成核酸適體的丟失和不完整。提高了核酸適體篩選的效率。同時(shí)，該實(shí)驗(yàn)利用其篩選獲得的特異核酸適體建立一種基于ELISA的快速檢測(cè)DKK1的方法，該實(shí)驗(yàn)耗時(shí)不足1 h，同時(shí)免去了ELISA封閉實(shí)驗(yàn)步驟和反復(fù)洗板的過程，成為本研究最大的亮點(diǎn)。此外，本研究采用羧基瓊脂磁珠作為篩選介質(zhì)，提高了靶蛋白與載體的偶聯(lián)率，是目前SELEX篩選中良好的載體材料，使一輪的SELEX篩選時(shí)間縮短為2 h。

利用DNAman軟件對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示核酸適體主要以莖環(huán)和莖凸環(huán)結(jié)構(gòu)為主。序列中GC配對(duì)較多。其中莖可以起到穩(wěn)定核酸適體空間結(jié)構(gòu)的作用，而環(huán)與靶標(biāo)結(jié)合。這提示，莖環(huán)結(jié)構(gòu)可能是核酸適體與DKK1特異識(shí)別的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。圓二色光譜分析結(jié)果顯示，3個(gè)候選核酸適體（Apt-5、Apt-26、Apt-28）能特異形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)識(shí)別DKK1靶標(biāo)蛋白。同時(shí)應(yīng)用SPR儀的方法對(duì)篩選出的核酸適體的親和力進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示核酸適體Apt-5 對(duì)DKK1有很好的特異性，該技術(shù)為檢測(cè)血清中的DKK1提供了新的分子生物學(xué)方法。

圖5 核酸適體親和力測(cè)定結(jié)果

圖6 圓二色光譜分析結(jié)果