FOXK1基因的生物特性及其在腫瘤中的研究進展

李 燕，陳 瑜，何美芝，卞小慧，涂令境，崔春暉，謝 朗南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院普通外科，廣東 廣州 508；南方醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 5055

在人口結(jié)構(gòu)老齡化、不良的飲食習慣、環(huán)境污染等眾多因素的影響下，惡性腫瘤的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢。近年來FOXK1基因在腫瘤中的作用受到廣泛的關(guān)注，有證據(jù)顯示FOXK1在多種細胞的生命活動以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演了重要角色。有一項關(guān)于生物信息學表達的分析表明FOXK1在幼兒腦、眼睛、心臟、肺臟和胸腺的低分化組織表達；而在成年人，F(xiàn)OXK1主要表達于惡性組織，尤其是腦、結(jié)直腸和淋巴結(jié)腫瘤[1]。本文關(guān)注FOXK1基因從第一次報道（1994年）到現(xiàn)在20多年間在腫瘤的研究進展，對FOXK1在各類腫瘤中的表達及作用作一綜述。

1 FOXK1基因的特征

1.1 FOXK1基因的結(jié)構(gòu)特點

自果蠅fork head基因被發(fā)現(xiàn)以來[2]，已經(jīng)在不同物種中發(fā)現(xiàn)了許多FOX家族基因。人類叉頭框（FOX）家族為一種轉(zhuǎn)錄因子家族，包含從A到Q的17個亞族、43個成員，其中FOXA-G、I-L和Q屬于1類FOX亞型，F(xiàn)OXKH及M-P屬于2類FOX亞型[3]。人類FOXK1基因?qū)儆贔OX家族成員，因其編碼的蛋白與小鼠肌細胞核因子/FOXK1具有高度同源性而得名。FOX蛋白也被稱作翼狀螺旋蛋白，F(xiàn)OX家族蛋白含有DNA結(jié)合區(qū)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)，其中DNA結(jié)合區(qū)又稱“叉頭區(qū)”，為各FOX家族亞型的共性結(jié)構(gòu)，約含有100個氨基酸[4]。人源性FOXK1基因位于染色體7p22，包含13個外顯子（圖1）。FOXK1a和FOXK1b為FOXK1的兩種轉(zhuǎn)錄物變體，它們的5’末端含有一個叉頭框結(jié)構(gòu)，可作為序列特異性DNA結(jié)合區(qū)域起作用以調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[1]。FOXK1蛋白核心部分為相連的3個α螺旋結(jié)構(gòu)，兩側(cè)通過β鏈連接了兩個稱之為“翼”的環(huán)狀結(jié)構(gòu)（圖2）。

1.2 FOXK1的蛋白特性及其分布

人源FOXK1蛋白由733個氨基酸排列組成，共約75.5 kDa，其中88.7%的氨基酸序列與鼠源FOXK1同源，48.7%的氨基酸與人FOXK2同源，47.5%氨基酸與非洲蟾蜍FOXK2同源。FOXK1a和FOXK1b蛋白富含丙氨酸、脯氨酸和絲氨酸，均有相同的叉頭域及潛在的核定位信號（PKRR）。FOXK1在胎兒的腦、眼睛、心臟、肺和胸腺表達，成年人FOXK1主要在惡性組織表達，尤其是腦、結(jié)直腸和淋巴結(jié)腫瘤[1]。通過RNA測序、基因芯片和基因表達的系列分析顯示的FOXK1基因在人體各個組織中的表達（圖3）。另外，來源于HPA的亞細胞定位顯示（圖4），F(xiàn)OXK1蛋白高表達于細胞核，同時在細胞骨架中亦有中等量表達。

圖1 人源性FOXK1基因的染色體定位

圖2 FOXK1的蛋白結(jié)構(gòu)

2 FOXK1基因的生物學功能

2.1 FOXK1調(diào)控細胞周期

FOXK1的敲除消除了細胞周期依賴性振蕩并導致細胞增殖率降低，從而肯定FOXK1可作為細胞周期的重要調(diào)節(jié)分子[5]。FOXK1調(diào)節(jié)小鼠肌原性祖細胞（MPC）中細胞周期進程和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21，F(xiàn)OXK1的缺乏導致p21表達上調(diào)，使生長促進條件下MPC群中的G0/G1停滯[6]，這基本闡明了FOXK1作為癌基因影響細胞周期的一項重要作用機制。此外，F(xiàn)OXK1可直接抑制基因表達激活因子FOXO4的轉(zhuǎn)錄活性，從而降低其下游包括p21等靶基因，F(xiàn)OXO4的抑制作用導致MPC中p21表達降低，細胞增殖增加[7]。FOXK1可抑制結(jié)直腸癌細胞系SW480凋亡，實驗發(fā)現(xiàn)在FOXK1基因高表達癌細胞SW480中，細胞生長增殖旺盛，而在敲除FOXK1基因的SW480細胞細胞周期狀態(tài)大都停滯于的G0/G1期，未能進一步進展的SW480分裂期細胞進入細胞凋亡期[8]。此外，研究發(fā)現(xiàn)FOXK1還參與PLK1-FOXK1-JLP-JNK/p38/MAPK信號通路，與原癌基因PLK1相互識別、作用，促進了其在胞內(nèi)的磷酸化和轉(zhuǎn)錄水平，介導細胞從G2期到M期的周期過程，從而參與有絲分裂[9]。

圖4 FOXK1基因的亞細胞定位

2.2 FOXK1介導信號通路

FOX家族成員可通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控和信號轉(zhuǎn)導途徑在機體的生長發(fā)育、細胞分化、代謝、凋亡以及免疫等方面起關(guān)鍵作用。Wnt/β-catenin通路是指導細胞增殖、自我更新、分化、組織穩(wěn)態(tài)和胚胎發(fā)育的重要信號通路[10]。DVL相關(guān)蛋白在人類結(jié)直腸癌組織高表達，激活Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控成人組織穩(wěn)態(tài)發(fā)展和維持生物過程[11]。β-catenin調(diào)節(jié)Wnt信號通路的重要組成成分（cyclin-D1、c-myc和基質(zhì)金屬蛋白酶-7）的表達，導致細胞增殖和侵襲失控。FOXK1可以依賴于β-catenin，將DVL蛋白轉(zhuǎn)位進入核內(nèi)從而正向調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路，在結(jié)直腸癌中發(fā)揮積極作用[12]。FOXK1還參與了Akt/mTOR信號通路調(diào)節(jié)miR-646介導的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）[13]。FOXK還被證實了可介導胚胎中腸內(nèi)胚層的TGF-β信號通路，而TGF-β信號也可通過Smad/Mad結(jié)合位點直接調(diào)節(jié)FOXK的表達，形成反饋調(diào)節(jié)機制[14]。除此之外，F(xiàn)OXK1在各系統(tǒng)腫瘤中的作用還涉及多個信號通路，F(xiàn)OXK1在腫瘤中的表達及具體調(diào)控機制（表1）。

2.3 FOXK1與其他基因相互作用

進一步通過STRING篩選出了25種FOXK1相互作用蛋白。蛋白質(zhì)互相作用的網(wǎng)絡(luò)分析（圖5）。FOXK1如何調(diào)控相關(guān)蛋白的表達并發(fā)揮其作用有待進一步探討。

3 FOXK1與各系統(tǒng)腫瘤

3.1 FOXK1基因與卵巢癌

在不影響細胞凋亡的情況下，F(xiàn)OXK1過表達可顯著提高S期細胞百分率，通過促進G1/S相變促進細胞增殖。同時，在卵巢癌細胞系中敲除FOXK1，細胞侵襲標志物MMP-9的表達降低。且FOXK1與細胞周期抑制蛋白p21的啟動子區(qū)域存在相互作用，F(xiàn)OXK1的過表達抑制了p21的表達，表明FOXK1通過抑制p21轉(zhuǎn)錄促進細胞增殖[15]。

3.2 FOXK1基因與肺癌

CCK8和transwell侵襲實驗表明，miR-1275可抑制肺癌細胞的增殖和侵襲，而FOXK1是miR-1275的一個潛在靶點，且miR-1275的過表達抑制了肺癌細胞中FOXK1的mRNA和蛋白水平[16]。這表明miR-1275可以調(diào)控肺癌細胞中FOXK1的表達抑制肺癌細胞增殖。進一步實驗表明，circMAN2B2是通過circMAN2B2/miR-1275/FOXK1信號通路在肺癌中發(fā)揮致癌作用的。

3.3 FOXK1基因與彌漫大B細胞淋巴瘤

基于微陣列基因表達譜的彌漫性大B細胞淋巴瘤潛在關(guān)鍵基因的鑒定中預(yù)測FOXK1為抑癌基因miR-17-5p的靶向基因，參與DNA結(jié)合FOXK1最有可能通過靶向miR-17通過調(diào)節(jié)細胞生長和細胞凋亡在彌漫性大B細胞淋巴瘤的進展中起主要作用[17]。

表1 FOXK1在各種腫瘤中的表達及可能機制

3.4 FOXK1基因與前列腺癌

FOXK1在人前列腺癌細胞系中有高表達，其下調(diào)抑制了前列腺癌細胞的增殖和遷移，同時上調(diào)上皮細胞標志物E-cadherin以及下調(diào)間充質(zhì)細胞標記物N-cadherin的表達從而逆轉(zhuǎn)EMT過程，這表明FOXK1是一種前列腺癌轉(zhuǎn)移潛能的潛在增強劑和EMT的誘導劑。此外，F(xiàn)OXK1通過上調(diào)β-catenin、c-myc、cyclin D1的表達蛋白水平，對Wnt/β-catenin信號通路起到正向調(diào)控作用，促進腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[18]。

3.5 FOXK1基因與神經(jīng)膠質(zhì)瘤

與正常腦組織相比，膠質(zhì)瘤組織和細胞系中FOXK1的表達增加，其過表達顯著促進了細胞的增殖和周期轉(zhuǎn)變，且FOXK1可通過激活神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中的Wnt/β-catenin通路促進細胞生長[19]。同時，研究發(fā)現(xiàn)FOXK1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的作用受到抑癌基因miR-137的靶向負調(diào)控。

然而另有研究表明，在膠質(zhì)瘤組織和細胞中FOXK1的表達是下降的，且FOXK1的過度表達顯著抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖，遷移和侵襲。FOXK1可以與其下游分子MMP1、MMP9和VE-Cadherin的啟動子結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄。具有高FOXK1表達的神經(jīng)膠質(zhì)瘤比具有低表達的神經(jīng)膠質(zhì)瘤具有更長的存活時間[20]。ZRANB2是在大鼠腎小球旁細胞原代培養(yǎng)的差異性顯示實驗中發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)[21]。ZRANB2的抑制降低了長鏈非編碼RNA（lncRNA）SNHG20的穩(wěn)定性和表達，而下調(diào)的SNHG20可通過SMD途徑降低轉(zhuǎn)錄因子FOXK1 mRNA降解，從而增加FOXK1的表達。FOXK1下調(diào)血管生成擬態(tài)相關(guān)分子MMP1、MMP9、VE-鈣粘蛋白的水平，并抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中的血管生成擬態(tài)形成[20]。

膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）是星形細胞腫瘤中惡性程度最高的膠質(zhì)瘤，F(xiàn)OXK1在GBM組織和細胞系中過表達，其通過激活Snail的轉(zhuǎn)錄促進GBM細胞的EMT，從而促進GBM細胞的轉(zhuǎn)移，同時還可以通過調(diào)控細胞周期促進GBM細胞的增殖[22]。

3.6 FOXK1基因與乳腺癌

在乳腺癌細胞系中FOXK1的表達下降，它在體內(nèi)外均可抑制EMT和乳腺癌細胞的轉(zhuǎn)移，且FOXK1表達越高，乳腺癌預(yù)后越好[23]。通過進一步的實驗發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXK1通過抑制轉(zhuǎn)錄因子Twist和血管內(nèi)皮生長因子等關(guān)鍵致癌基因的轉(zhuǎn)錄，從而抑制乳腺癌EMT及血管生成，因此，在乳腺癌中FOXK1是一種潛在的腫瘤抑制因子。FOXK1還可以增強乳腺癌MRI表型的檢測，并且與調(diào)節(jié)乳腺癌生長和轉(zhuǎn)移的腫瘤抑制因子TET1在生理功能上存在相互關(guān)聯(lián)。

3.7 FOXK1基因與食管癌

免疫組化實驗表明，與正常食管黏膜組織相比，F(xiàn)OXK1在食管癌組織的表達顯著增多。其表達水平與食管癌的分化程度相關(guān)，分化程度越低的腫瘤組織FOXK1的表達水平越低，且FOXK1的高表達是影響食管癌患者的預(yù)后及生存時間的作用因素，提示FOXK1可能成為食管癌患者的診療新靶點[24]。進一步的細胞實驗發(fā)現(xiàn)，提高食管癌細胞內(nèi)FOXK1的表達水平，可抑制細胞凋亡、促進細胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移，而在食管癌細胞內(nèi)抑制FOXK1的表達則得出相反的結(jié)果。

3.8 FOXK1與肝細胞性肝癌

FOXK1高表達于肝細胞性肝癌（HCC）組織細胞，敲除FOXK1基因可下調(diào)HCC細胞內(nèi)β-catenin、cmyc和cyclin D1等蛋白的表達水平，相反，Wnt/βcatenin信號通路催化劑LiCl有效地逆轉(zhuǎn)FOXK1敲除導致的HCC細胞增殖和侵襲效應(yīng)。且有研究報道FOXK在胚胎中腸內(nèi)胚層中介導TGF-β信號，因此TGF-β-FOXK1-Wnt信號可能在調(diào)控HCC細胞增殖和侵襲中發(fā)揮重要作用[25]。此外，Cui等[26]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXK1的下調(diào)可以抑制肝癌細胞糖酵解、降低肝癌細胞活力，這可能與其降低糖酵解關(guān)鍵酶HK2的表達有關(guān)。Akt/mTOR通路被證實可以通過刺激葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)生、激活HK2等途徑從而增加細胞的葡萄糖攝取和糖酵解。Cui等[26]通過進一步的研究發(fā)現(xiàn)FOXK1的下調(diào)抑制了肝癌細胞中Akt/mTOR通路的激活，導致細胞糖酵解的抑制。

3.9 FOXK1基因與胃癌

FOXK1和原癌基因c-jun均表達于胃癌細胞核，c-jun可直接結(jié)合并激活人FOXK1基因啟動子362-355 bp核心序列處；過表達FOXKl的MKN28穩(wěn)定株沉默c-jun序列后，細胞的增殖、遷移和侵襲能力受抑制，F(xiàn)OXKl誘導的EMT也同樣受到阻礙[27]。因此，F(xiàn)OXKl的啟動子被c-jun識別激活后表達上調(diào)，發(fā)揮原癌基因作用促進胃癌進展。另有研究指出，miR-646為FOXK1在胃癌細胞中表達的調(diào)控基因，miR-646可通過下調(diào)FOXK1對抗TGF-β1誘導EMT亞型，抑制Bcl-2/Akt信號通路，從而抑制GC細胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲[13]。lncRNA LINC02163被證實參與胃癌的發(fā)生及發(fā)展，它在胃癌細胞系和組織中的表達增高。LINCO2163的抑制降低了FOXK1的表達，而當miR-593-3p被抑制時，LINC02163下調(diào)FOXK1表達的作用被消除。FOXK1過表達可抵消LINC02163下調(diào)對細胞生長、細胞周期分布和侵襲的影響[28]。因此，LINC02163可以通過miR-593-3p/FOXK1軸發(fā)揮其在胃癌中的癌基因作用。此外，在胃癌的發(fā)生發(fā)展中FOXK1與波形蛋白存在相互穩(wěn)定和相互促進作用，其在胃癌細胞中的表達呈顯著正相關(guān)。在胃癌細胞中FOXK1誘導EMT，促進胃癌的侵襲及轉(zhuǎn)移，與胃癌的不良預(yù)后有關(guān)[28]。

3.10 FOXK1與結(jié)直腸癌

目前，關(guān)于FOXK1在結(jié)直腸癌的表達特點及其分子作用機制的研究最為廣泛和深入。FOXK1在結(jié)直腸腫瘤著高表達，且其表達水平與患者的預(yù)后呈負相關(guān)，對其預(yù)后狀態(tài)的單因素及多因素回歸分析提示FOXK1在腫瘤組織中的表達為結(jié)直腸癌患者獨立的預(yù)后因素[29]。有研究發(fā)現(xiàn)敲除FOXK1可誘導結(jié)直腸癌SW480細胞在G0/G1期阻滯[8]，由此提出FOXK1可能成為結(jié)直腸癌侵襲性的生物表型標志物和基因干預(yù)治療的新靶標。而FOXK1和FHL2的共表達可誘導EMT促進結(jié)直腸癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，TGF-β1可上調(diào)LIM蛋白家族成員FHL2的表達，從而賦予癌細胞以轉(zhuǎn)移的功能[30]，一系列的研究結(jié)果使FOXK1和FHL成為聯(lián)合治療結(jié)直腸癌特別是轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的潛在靶點[31]。在體內(nèi)結(jié)直腸癌中觀察到，F(xiàn)OXK1的蛋白水平和細胞定位與RUFY3相似，RUFY3高表達可促進體內(nèi)和體外結(jié)直腸癌細胞增殖，加強EMT和轉(zhuǎn)移亞型，而siRNA介導抑制RUFY3可誘導G0/G1細胞周期阻滯，F(xiàn)OXK1被證實可通過原位移植促進RUFY3介導的轉(zhuǎn)移FOXK1- RUFY3軸的形成促成且加快了結(jié)直腸癌的疾病進展[32]。除此之外，通過基因表達譜、蛋白印跡分析和相關(guān)性等分析發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌細胞中，F(xiàn)OXK1的表達還與轉(zhuǎn)錄因子Snail呈正相關(guān)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Snail可與FOXK1啟動子結(jié)合，反式激活FOXK1表達，從而促進結(jié)直腸癌腫瘤發(fā)生和EMT介導的侵襲轉(zhuǎn)移。此外，熒光素酶報告基因測定顯示FOXK1反式激活Cyr61啟動子活性，它們的共同表達調(diào)控了結(jié)直腸癌細胞的遷移、侵襲和EMT[33-34]，因而靶向FOXK1-Cyr61-Snail軸可以為結(jié)直腸癌的治療提供新的治療方向。另外，熒光素酶報告基因測定發(fā)現(xiàn)miR-4492與結(jié)直腸癌結(jié)直腸癌細胞中的lncRNA LINC01503和FOXK1 mRNA存在相互作用，LINC01503通過抑制miR-4492在結(jié)直腸癌細胞中促進FOXK1的表達，而CCK8和Transwell測定表明FOXK1表達的恢復(fù)顯著逆轉(zhuǎn)了LINC01503敲低對結(jié)直腸癌細胞的抑制作用。

4 總結(jié)

綜上所述，F(xiàn)OXK1參與EMT，介導TGF-β、Wnt/βcatenin和Bcl-2/Akt等多個信號通路，影響不同系統(tǒng)腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲。FOXK1在腫瘤中作為一個新興的原癌基因，對各個系統(tǒng)腫瘤細胞的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后起重要的作用。然而，與其他的腫瘤標志物相比，F(xiàn)OXK1的研究尚處于初步階段，它的生物學功能及其影響各個系統(tǒng)腫瘤的具體機制還需進一步的深入研究。FOXK1有望成為不同系統(tǒng)腫瘤新的生物標記物及作用靶點，為患者的診斷、治療及預(yù)后帶來新的曙光。