解脲脲原體DNA檢測(cè)方法評(píng)價(jià)及人群感染情況調(diào)查

宗曾艷，熊 丹，湯花梅，王萌萌，孔凡虹，闞麗娟，張水蘭，張秀明安徽理工大學(xué)，安徽 淮南 3000；深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 深圳 44030

解脲脲原體（UU）通常在泌尿生殖道內(nèi)繁殖，與盆腔炎、產(chǎn)后感染、不孕不育、前列腺炎，胎膜早破、早產(chǎn)等疾病密切相關(guān)[1-3]，也是非淋菌性尿道炎的致病菌[4]。UU-DNA定量檢測(cè)，是早期感染診斷，抗病毒療效觀察的重要指標(biāo)，其檢測(cè)陽(yáng)性率高于傳統(tǒng)的培養(yǎng)法[5]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（qRT-PCR）是實(shí)時(shí)檢測(cè)和定量基因表達(dá)，以熒光化學(xué)物質(zhì)檢測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法[6]，更快速、簡(jiǎn)便而適用于臨床核酸檢測(cè)。研究表明，PCR技術(shù)被認(rèn)為是診斷支原體、衣原體感染的可靠方法[7]；有研究對(duì)常用的3種檢測(cè)方法進(jìn)行比較后，也建議對(duì)于初篩標(biāo)本應(yīng)首選用qRT-PCR檢測(cè)方法[8]。

目前臨床上性能驗(yàn)證主要集中在生化、免疫、臨檢等領(lǐng)域，分子生物學(xué)尚無(wú)完整權(quán)威的性能驗(yàn)證方案[9]， 2019年 2月 15日 最 新 發(fā) 布 的 CNAS-GL039文件由中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)制定，是對(duì)CNAS-CL02:2012《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在分子診斷鄰域的應(yīng)用說(shuō)明》中有關(guān)分子診斷相關(guān)檢驗(yàn)程序進(jìn)行性能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所做的具體解釋和指導(dǎo)。因此，本研究參考以上文件對(duì)qRT-PCR方法檢測(cè)解脲脲原體核酸的性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，為檢驗(yàn)科分子定量檢測(cè)方法的性能驗(yàn)證提供參考，并分析2018年全年來(lái)我院就診患者UU感染情況，為UU感染的診斷和治療提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 樣本與儀器

所需標(biāo)本為科室收集的臨床分泌物拭子標(biāo)本，儲(chǔ)存于-20 ℃。收集2018年1～12月來(lái)我院就診患者檢測(cè)的UU結(jié)果（剔除給藥后復(fù)查結(jié)果），共22 468例。拭子標(biāo)本均為各科專(zhuān)業(yè)人員使用醫(yī)用棉簽在女性宮頸口或男性尿道口1～2 cm處旋轉(zhuǎn)15 s后取出，放置在無(wú)菌試管中送檢。于上海之江生物有限公司采購(gòu)的解脲脲原體核酸測(cè)定試劑盒，PCR擴(kuò)增儀SLAN-96S，全自動(dòng)核酸提取儀Autrax。所有操作步驟和結(jié)果判定按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 精密度評(píng)估 各儀器均在在控情況下，取2例UU-DNA陽(yáng)性宮頸分泌物標(biāo)本和1例陰性標(biāo)本。各樣本每次5次重復(fù)，分4批次測(cè)定，各計(jì)20次重復(fù)，記錄每次檢測(cè)結(jié)果，以陰陽(yáng)性判定，陽(yáng)性結(jié)果以Ct值（達(dá)到閾值的最小循環(huán)數(shù)）作為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算不精密度，要求變異度（CV）≤5%，陰性符合率均＞95%則符合要求。

1.2.2 準(zhǔn)確度評(píng)估 取12例在本實(shí)驗(yàn)室用UU-DNA核酸測(cè)定試劑盒檢測(cè)的宮頸分泌物樣本（其中陽(yáng)性樣本10例，陰性樣本2例），與測(cè)序方法進(jìn)行對(duì)比分析，分析結(jié)果的一致程度，陰陽(yáng)性符合率＞95%，則準(zhǔn)確度符合要求。

1.2.3 最低檢測(cè)下限評(píng)估 依據(jù)上海之江UU核酸試劑盒說(shuō)明書(shū)和《感染性疾病個(gè)體化醫(yī)學(xué)分子檢測(cè)技術(shù)指南》，取1例UU-DNA擴(kuò)增結(jié)果Ct值約等于35（濃度約在103copies/mL）樣本，進(jìn)行10次擴(kuò)增，記錄每次檢測(cè)結(jié)果。如為陽(yáng)性，則記錄相應(yīng)的Ct值，統(tǒng)計(jì)10次擴(kuò)增結(jié)果，評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)參考CLSI-MM17A文件關(guān)于檢測(cè)下限的標(biāo)準(zhǔn)可知，10次擴(kuò)增結(jié)果總陽(yáng)性率均＞95%則滿(mǎn)足要求。

1.2.4 抗干擾能力 （1）抗交叉反應(yīng)評(píng)估：由之江公司提供的包含淋球菌、沙眼衣原體、人型支原體、生殖支原體、白色念珠菌和B組鏈球菌的質(zhì)粒（濃度約5×106copies/mL），分別加入到10例UU-DNA陰性標(biāo)本內(nèi)，進(jìn)行擴(kuò)增，統(tǒng)計(jì)10例UU-DNA陰性標(biāo)本的擴(kuò)增結(jié)果，依據(jù)上海之江UU核酸試劑盒說(shuō)明書(shū)和CNAS GL-039標(biāo)準(zhǔn)，要求10例標(biāo)本結(jié)果總陰性符合率≥95%。（2）內(nèi)源性干擾評(píng)估：取1份UU-DNA陽(yáng)性樣本分成4份，各300 μL，每份標(biāo)本加入正常人紅細(xì)胞0、6、10、12 μL的樣本進(jìn)行提取，提取DNA后再進(jìn)行復(fù)孔擴(kuò)增，重復(fù)3次，要求均≤5%，并評(píng)判符合性。

1.3 UU感染情況調(diào)查

對(duì)2018年1～12月來(lái)我院門(mén)診和住院就診患者UU-DNA檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。納入本研究中的臨床樣本數(shù)據(jù)，已征得本醫(yī)院倫理委員會(huì)的同意和批準(zhǔn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Excel和SPSS24.0統(tǒng)計(jì)分析解脲脲原體陽(yáng)性率及不同年齡段男性和女性感染情況，分析不同組別間差異使用卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 方法評(píng)價(jià)

2.1.1 結(jié)果判定 質(zhì)控在控情況下，判斷檢測(cè)樣本Ct值，結(jié)果顯示UNDET或＞40，報(bào)告為陰性結(jié)果；Ct值≤38，報(bào)告為陽(yáng)性；Ct值38～40，則重復(fù)測(cè)定該樣本，如結(jié)果仍為38～40，且溶解曲線呈S型，則判斷為陽(yáng)性，否則為陰性。計(jì)算最終擴(kuò)增結(jié)果Ct值的均值、標(biāo)準(zhǔn)差及CV，要求CV小于允許總誤差5%。

2.1.2 重復(fù)性評(píng)價(jià) 2例陽(yáng)性標(biāo)本20次檢查結(jié)果Ct值分別為25.71±0.14、28.16±0.11，CV值為0.54%、0.39%，均小于允許CV值，陰性標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果均為陰性，符合率100%，驗(yàn)證通過(guò)。

2.1.3 準(zhǔn)確度驗(yàn)證 選取12例（10例陽(yáng)性，2例陰性）在本實(shí)驗(yàn)室用核酸試劑盒qRT-PCR檢測(cè)宮頸分泌物樣本結(jié)果，經(jīng)DNA擴(kuò)增后（引物序列為CAATCTGCT CGTGAAGTATTA，ACGACGTCCATAAGCAACT），將產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，進(jìn)行結(jié)果比對(duì)。陽(yáng)性標(biāo)本序列經(jīng)Blast，同源序列100%，為解脲脲原體序列，表明準(zhǔn)確度符合本實(shí)驗(yàn)室要求。測(cè)序結(jié)果（圖1）。

2.1.4 最低檢測(cè)下限 測(cè)定結(jié)果顯示，UU標(biāo)本進(jìn)行10次擴(kuò)增，Ct值均小于37，判斷為陽(yáng)性，Ct均值36.26，結(jié)果偏倚為1.16%，小于允許CV值5%，檢測(cè)結(jié)果符合要求。

圖1 UU-DNA測(cè)序?qū)嶒?yàn)?zāi)z電泳結(jié)果

2.1.5 抗交叉反應(yīng) 10例陰性標(biāo)本加入干擾物質(zhì)后擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，符合率為100%（10/10）＞95%，與混合質(zhì)粒無(wú)交叉反應(yīng)，結(jié)果符合要求。

2.1.6 內(nèi)源性干擾 加入不同濃度紅細(xì)胞后擴(kuò)增樣本，檢測(cè)結(jié)果CV值均小于5%，表明不存在明顯的內(nèi)源性干擾，驗(yàn)證結(jié)果通過(guò)（表1）。

表1 內(nèi)源性紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 解脲脲原體感染情況調(diào)查

對(duì)2018年所有來(lái)我院就診患者經(jīng)剔除復(fù)診結(jié)果后的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，最后共納入22 468例標(biāo)本，年齡11～80歲，男性882例，女性21 586例，總的UU檢出13 431例，陽(yáng)性率為59.8%；其中男性陽(yáng)性檢出率22.7%，女性61.3%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=525.613，P＜0.05，表2）。

表2 UU總感染情況

2.2.1 不同年齡組男性感染情況 本次研究男性882例，檢出率22.7%，以31～50歲就診人數(shù)最多，年齡組從小到大感染率分別為25.0%、25.1%、22.1%、14.9%，各年齡組檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.511，P＞0.05），30歲以下組陽(yáng)性檢出率25.0%高于31～80歲組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.806，P＞0.05，表3）。

表3 不同年齡組男性UU-DNA檢測(cè)結(jié)果

2.2.2 不同年齡組女性感染情況 本研究女性患者標(biāo)本21 586例，檢出率61.3%，以21～50歲就診人數(shù)最多，陽(yáng)性率最高年齡組為11～20歲，陽(yáng)性率69.6%，21～30歲陽(yáng)性率次之，為63.9%（χ2=2.207，P＜0.05），較年輕組11～30歲陽(yáng)性檢出率64.4%，高于31～80歲組58.0%（χ2=92.830，P＜0.05，表4）。

表4 不同年齡組女性UU-DNA檢測(cè)結(jié)果

3 討論

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是實(shí)驗(yàn)室基因表達(dá)分析和食品應(yīng)用的首選方法，是將傳統(tǒng)的RT-PCR方法與熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象相結(jié)合，利用熒光引物進(jìn)行PCR，并且具有良好的敏感性和特異性、低污染風(fēng)險(xiǎn)和縮短人工時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)，使得實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)成為替代傳統(tǒng)PCR的一個(gè)有吸引力的PCR方法[10-11]?，F(xiàn)在已廣泛用于UU-DNA的檢測(cè)，因此需要充分了解該方法學(xué)性能。但多數(shù)研究對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的性能驗(yàn)證集中于乙肝核酸檢測(cè)[12-15]，也有部分研究對(duì)UU核酸檢測(cè)進(jìn)行過(guò)性能驗(yàn)證[16-17]。因此本研究對(duì)熒光PCR檢測(cè)UU-DNA進(jìn)行性能評(píng)估。準(zhǔn)確度使用測(cè)序結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，12例樣本陰陽(yáng)性結(jié)果與測(cè)序結(jié)果100%吻合，精密度、內(nèi)源性抗干擾能力CV值均小于5%,最低檢出限樣本結(jié)果Ct值均小于37，結(jié)果為陽(yáng)性，此時(shí)平均偏移為1.16%，滿(mǎn)足要求，從而保證檢測(cè)結(jié)果的可靠性。

本研究中UU總感染13 431例（59.8%），高于我國(guó)其他省份的研究報(bào)道[18-20]，與北京地區(qū)2013～2016年研究結(jié)果相比[21]，本研究男性檢出率為22.7%，低于北京地區(qū)的31.8%；女性檢出率為61.3%，高于北京地區(qū)的52.5%，分析可能與不同地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平、調(diào)查人群、檢測(cè)方法等因素有關(guān)。本研究女性陽(yáng)性率顯著高于男性，與其它研究結(jié)果一致[20, 22]，這可能是由于女性特殊生殖系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和內(nèi)分泌激素不同造成的，女性生殖系統(tǒng)的弱酸性環(huán)境更適合生殖道病原體存活。本研究中30歲以下女性陽(yáng)性率64.4%，與30歲以上年齡組具有顯著性差異，與部分研究較一致[23]，即陽(yáng)性率年齡段主要集中在21～30歲，感染率呈現(xiàn)年輕化，與該人群性行為方式，激素水平變化，性知識(shí)缺乏等有關(guān)。另有研究表明，無(wú)癥狀體檢女性中支原體檢出率為2.2%[24]，提示應(yīng)采取措施普及性傳播疾病知識(shí)，引導(dǎo)本地區(qū)女性預(yù)防感染，定期體檢，適當(dāng)治療。男性30歲以下育齡組陽(yáng)性率為25.0%，高于30～80歲組，目前進(jìn)行UU檢查的育齡男性總體數(shù)量偏少，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)育齡男性尤其是存在不孕不育疾病的男性進(jìn)行性疾病知識(shí)宣講，積極進(jìn)行病原體感染篩查。雖然1988年中國(guó)就啟動(dòng)了全國(guó)性傳播感染監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，以監(jiān)測(cè)性傳播感染的規(guī)模及其趨勢(shì)，但UU感染率仍呈上升趨勢(shì)[21]，因此應(yīng)引起大家的重視，避免忽視或者漏診，臨床科研應(yīng)進(jìn)行更多流行病學(xué)研究，努力降低UU感染率。

綜上所述，qRT-PCR檢測(cè)方法靈敏度高，重復(fù)性好，抗干擾力強(qiáng)，檢測(cè)下限符合要求，可滿(mǎn)足于臨床檢測(cè)；流行病學(xué)研究有助于了解深圳地區(qū)UU感染情況，從而為臨床對(duì)UU的干預(yù)，防治提供依據(jù)。